oHSV-1-GM-CSF聯合anti PD-L1抗體治療小鼠雙側結腸癌移植瘤

摘要： 為了驗證oHSV-1-GM-CSF與anti PD-L1抗體聯用在雙側結腸癌皮下移植瘤模型中的全身抗腫瘤活性，并初步探究該聯用方案在體內的作用原理，在BALB/c小鼠上利用CT26.WT細胞建立雙側結腸癌皮下移植瘤模型并進行隨機分組，設置Vehicle、oHSV-1-GM-CSF、anti PD-L1以及oHSV-1-GM-CSF＋anti PD-L1組。治療結束后，取小鼠外周血淋巴細胞進行流式細胞術和體外殺傷實驗，并繼續觀察治療結束后的小鼠腫瘤消退情況或消退的腫瘤重新發生的情況。結果顯示，oHSV-1-GM-CSF能在CT26.WT細胞上表達mGM-CSF，且溶瘤作用與空載病毒相比無顯著差異；在體內實驗中oHSV-1-GM-CSF對治療側的腫瘤抑制效果強于空載病毒，與anti PD-L1抗體聯用后產生更強的抑制全身腫瘤的作用；流式結果顯示，聯用組小鼠外周血和脾臟中與特異性免疫相關的細胞比例顯著上調，且外周血淋巴細胞能在體外特異性殺傷CT26.WT細胞而對同種屬的4T1細胞無明顯作用；生存期結果顯示聯用組能顯著延長小鼠生存期，存活率為33.3%，且無腫瘤重新發生的情況。綜上所述，oHSV-1-GM-CSF與anti PD-L1抗體聯用后能加強機體的特異性免疫從而產生持久的抑瘤效果，并延長小鼠生存期，為臨床對結腸癌的治療方案提供數據支持。

關鍵詞：

結腸癌；雙側結腸癌移植瘤；溶瘤病毒；特異性免疫

中圖分類號： R735.3+5

文獻標志碼： A

結直腸癌是一種起源于直腸或者結腸的胃腸道惡性腫瘤，目前是全球第三大常見癌癥，也是惡性腫瘤相關死亡的第二大原因，2018年全球估計有180萬新發病例和約88.1萬例死亡^［1］。預計到2030年全球結直腸癌新增病例將近一步增加20%，每年約有220萬例結直腸癌患者^［2-4］。目前臨床上對結直腸癌的治療策略以手術治療、化療和靶向治療為主，且隨著有效的篩查措施讓更多的患者能夠在腫瘤早期接受治療，使局部和區域化結直腸癌的5年生存率分別高達90%和71%，但轉移性結直腸癌的5年生存率卻只有14%左右^［5］。因此還迫切需要開發新的治療策略來面對日益增多的結直腸癌患者和轉移性結直腸癌。

近年來，人們在個性化醫學和癌癥治療領域取得了重大進展^［6］。過繼細胞轉移和免疫檢查點抑制劑（Immune checkpoint inhibitors，ICI）等免疫治療通過利用自身免疫系統來對抗腫瘤細胞，其單獨或與常規治療（如放療和化療）相結合的治療方案已

在許多癌癥中取得了不錯的療效^［7］。免疫檢查點抑制劑是腫瘤免疫治療的主要方法，因其在各種腫瘤中的綜合生物活性、反應的穩定性以及在轉移性和化療耐藥的惡性腫瘤中的明顯療效，已被納入腫瘤臨床治療的藥物^［8］。溶瘤病毒（Oncolytic virus，OVs）被定義為一種基因工程或自然產生的病毒，與基因療法不同的是，溶瘤病毒療法將病毒本身作為活性藥物試劑。溶瘤病毒可以選擇性地感染腫瘤細胞，并在接下來的幾輪復制中侵染到鄰近的腫瘤細胞，通過靶向腫瘤血管和旁側效應殺死未被感染的細胞。此外，溶瘤病毒還能誘導機體產生抗腫瘤免疫，從而對轉移的腫瘤產生抑制作用^［9-11］。本實驗所構建的重組溶瘤病毒是在空載病毒中插入粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）基因，它能將樹突狀細胞招募到腫瘤細胞破裂的部位，并吸收可溶性腫瘤抗原，刺激自身成熟，從而促進T細胞啟動免疫應答^［12-13］。有研究表明，相較于空載病毒，經HSV-GM-CSF處理的小鼠腫瘤標本中觀察到更多的巨噬細胞浸潤^［14］。本研究在對單側腫瘤注射溶瘤病毒，病毒裂解細胞的同時表達GM-CSF，從而募集淋巴細胞產生特異性免疫，并聯合anti-PD-L1抗體產生更有效的全身抗腫瘤作用，從而達到局部治療與全身抑制的治療效果。

1 材料與設備

1.1 材料

小鼠結腸癌細胞 CT26.WT，小鼠乳腺癌細胞 4T1，該兩株細胞均購自中國科學院分子細胞科學卓越創新中心。

1.2 試劑

CFSE試劑盒、PI染料均購自美國Thermo Fisher公司；CD45（TIL）Microbeads、Dead Cell Removal Kit均購自德國美天旎公司；InVivoPlus anti-mouse PD-L1 Antibody （BP0101）購自美國Bioxcell公司；Mouse GM-CSF ELISA Kit購自中國Elabscience公司；anti-mouse CD16/32 Antibody、anti-mouse CD45 Antibody、anti-mouse CD3ε Antibody、anti-mouse CD4 Antibody、anti-mouse CD8a Antibody、anti-mouse CD335 （NKp46） Antibody、anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody、anti-mouse CD44 Antibody、anti-mouse CD62L Antibody均購自美國Biolegend公司。

1.3 實驗動物

SPF級健康5～6周雌性BALB/c小鼠，體重18～20 g，購自濟南朋悅動物繁殖有限公司。所有動物實驗方案操作均遵守《煙臺大學實驗動物使用管理規范》并經過煙臺大學實驗動物倫理委員會審核及批準。

1.4 儀器

磁力架（德國美天旎），FACSCelesta流式細胞儀（美國BD公司），酶標儀（美國BD公司）。

2 方 法

2.1 ELISA法檢測oHSV-1-GM-CSF外源蛋白的表達

將CT26.WT結腸癌細胞復蘇、傳代和細胞計數，按每孔5×105個細胞數加入到六孔板中，次日更換為無血清培養基并按照相同的感染復數（multiplicity of infection，MOI）加入oHSV-1-mock（空載病毒）和oHSV-1-GM-CSF病毒，混勻后放入細胞培養箱中培養。培養24、48、72 h后收集細胞上清液，進行ELISA實驗，檢測上清中mGM-CSF的含量。

2.2 CCK-8法檢測oHSV-1-GM-CSF的溶瘤作用

將CT26.WT結腸癌細胞復蘇、傳代和細胞計數，按照每孔1×104個細胞加入到96孔板中。次日吸出舊培養基，用無血清培養基稀釋oHSV-1-mock和oHSV-1-GM-CSF，使最終的MOI為20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.01，加入到對應96孔板，放入CO2培養箱。在感染病毒72 h后取出96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液放入CO2培養箱，反應1 h和2 h后，使用酶標儀在450 nm處檢測吸光度。

2.3 建立雙側皮下結腸癌移植瘤模型

復蘇CT26.WT細胞，培養傳代后，消化處于對數生長期的細胞，計數并調整細胞濃度為3×107個/mL和1×107個/mL，在其左右側的背部剃毛。右側（治療側）背部皮下接種100 μL 3×107個/mL CT26.WT細胞細胞懸液；左側背部皮下接種100 μL 1×107 個/mL CT26.WT細胞細胞懸液。

2.4 oHSV-1-GM-CSF對雙側CT26.WT皮下移植瘤的抗腫瘤活性

接瘤后3～5 d觀察小鼠背部腫瘤生長情況，測量兩側腫瘤的長短徑，計算腫瘤體積（計算公式：腫瘤體積=1/2×瘤長×瘤寬2），選取右側腫瘤體積在100～150 mm3的小鼠進行編號，并通過SPSS軟件進行隨機分組。按照表1所示方案對小鼠進行治療，觀察治腫瘤體積變化和小鼠狀態。

2.5 oHSV-1-GM-CSF 聯合 antiPD-L1抗體藥效評價

同“2.4”對小鼠進行分組后按照表2所示方案對小鼠進行治療，觀察治療側和對側腫瘤體積變化和小鼠狀態。治療結束次日，取小鼠外周血，加入適量的紅細胞裂解液，待反應完全后，1500 r/min離心5 min，棄上清并加入5 mL PBS重懸，暫存于4 ℃冰箱。

2.6 流式細胞術檢測外周血中免疫細胞分群

將外周血細胞懸液從4 ℃冰箱中取出，1500 r/min離心5 min，棄上清，加入300 μL PBS重懸并轉移至流式管中。向每管中加入CD16/32 Fc block封閉液（1 μL/管），渦旋混勻后，4 ℃冰箱封閉5 min。將封閉完的細胞懸液加入2 mL PBS輕輕渦旋后1500 r/min離心5 min，棄上清，加入300 μL PBS重懸，向每管中加入死活染料（1 μL/管），4 ℃冰箱避光孵育30 min。孵育完畢后PBS清洗一次，再加入300 μL PBS重懸。對細胞表面分子染色：分別加入3 μL CD8-FITC，CD3-percp-cy5.5，CD45-AF700， CD4-APC-cy7，CD44-BV421，CD62L-PE，CD335-APC，B220-FITC渦旋混勻，室溫避光孵育30 min，染色完畢加2 mL PBS重懸洗滌一次，加入250 μL PBS重懸細胞，上機檢測。

2.7 小鼠外周血CD45＋對腫瘤細胞特異性殺傷作用檢測

將培養的靶細胞CT26.WT、4T1消化計數，吸取1×107個細胞。1500 r/min離心5 min，棄上清，用1 mL預冷的PBS重懸，加入0.5～1 μL CFSE溶液混勻。37 ℃條件下避光培養20 min（期間振蕩混勻兩次）。向50 mL離心管中加入5倍體積的預冷1640完全培養基，在4 ℃冰箱中避光孵育5 min。1500 r/min離心5 min棄上清，重懸于1640完全培養基中。將外周血細胞懸液從4 ℃冰箱中取出，根據試劑盒的說明分離血液中CD45＋活細胞，計數后和靶細胞CT26.WT、4T1按照1∶10和1∶40的靶效比進行共培養。4 h后吸取上清并消化CT26.WT、4T1一起加入流式管中，1500 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL PBS重懸，向其中加入2.5 μL PI溶液，加入染料后反應40 s上機檢測。

2.8 統計學分析

以GraphPad Prism 9.3軟件進行統計學分析，所得數據以± s表示。數據分析采用雙尾、非配對T檢驗或雙因素方差分析，用Kaplan-Meier生存曲線評價動物存活率，用Mantel-Cox檢驗進行統計學分析。Plt;0.05被認為組間差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 oHSV-1-GM-CSF外源蛋白表達

如圖1結果顯示，對照組和oHSV-1-mock 在病毒侵染24 h后，上清中mGM-CSF的含量較oHSV-1-GM-CSF組相比均無明顯表達（Plt;0.001，R2=0.990 5），oHSV-1-GM-CSF組病毒侵染48 h和72 h較24 h上清中mGM-CSF表達量均有所升高，且差異具有統計學意義（Plt;0.01）。證明實驗室擴增的oHSV-1-GM-CSF能在CT26.WT細胞株上穩定地表達目的蛋白。

3.2 插入mGM-CSF基因對病毒溶瘤作用的影響

如圖2結果顯示，oHSV-1-GM-CSF和oHSV-1-mock在侵染CT26.WT細胞72 h后兩條曲線之間不存在顯著性差異且兩曲線基本吻合。說明外源基因mGM-CSF的插入對病毒溶瘤作用的影響較小。

3.3 oHSV-1-GM-CSF皮下移植瘤的抗腫瘤作用

如圖3（a）顯示oHSV-1-GM-CSF組在小鼠治療側腫瘤較oHSV-1-mock和Vehicle組均具有顯著性抑制腫瘤生長的作用（Plt;0.05）；而在治療對側oHSV-1-GM-CSF和oHSV-1-mock與Vehicle組相比無顯著性差異，但病毒注射組的腫瘤總體小于Vehicle組。說明oHSV-1-GM-CSF能通過表達mGM-CSF來加強注射部位腫瘤的抑制作用，但對于遠端的非注射部位作用有限。

3.4 oHSV-1-GM-CSF聯合anti-PD-L1抗體藥效評價

如圖4和圖5顯示，oHSV-1-GM-CSF+anti-PD-L1組較oHSV-1-GM-CSF和anti-PD-L1組對治療側（右側）腫瘤均有顯著抑制效果（Plt;0.01）；oHSV-1-GM-CSF+anti-PD-L1組對治療對側（左側）腫瘤也表現出較好的抑制效果，與oHSV-1-GM-CSF組相比差異具有統計學意義（Plt;0.001），與anti-PD-L1組相比差異具有統計學意義（Plt;0.05），并且在oHSV-1-GM-CSF+anti-PD-L1組中兩只小鼠左側的移植瘤消失。如圖6所示，與Vehicle組相比，oHSV-1-GM-CSF、anti-PD-L1和聯用組均能顯著延長小鼠生存期（Plt;0.05，Plt;0.01，Plt;0.001），但只有oHSV-1-GM-CSF+anti-PD-L1組在實驗觀察期間有小鼠存活，存活率為33.3%。說明oHSV-1-GM-CSF與anti-PD-L1抗體聯用，不僅能加強重組溶瘤病毒對治療對側腫瘤的抑制作用，并且能加強免疫檢查點抑制劑對腫瘤的抑制效果，且在腫瘤消退之后無腫瘤重新發生的情況。

3.5 小鼠外周血的免疫細胞分群

流式結果顯示，在CD45＋細胞的分群中（圖7）oHSV-1-GM-CSF＋anti-PD-L1組相較于oHSV-1-GM-CSF組顯著性上調外周血中CD3＋T細胞的比例（Plt;0.01）；anti-PD-L1組、oHSV-1-GM-CSF組和oHSV-1-GM-CSF＋anti-PD-L1組相較Vehicle組外周血中B細胞的占比均有所上調，且oHSV-1-GM-CSF與Vehicle組之間差異具有統計學意義（Plt;0.05），聯用組較anti-PD-L1組差異也具有統計學意義（Plt;0.05）；此外，anti-PD-L1組外周血中NK細胞的比例較其他組有所上調。CD3＋T細胞的分群結果顯示（圖8），各組CD8＋T細胞比例無明顯變化，但oHSV-1-GM-CSF＋anti-PD-L1組的CD4+細胞較oHSV-1-GM-CSF組差異具有統計學意義（Plt;0.01）。而在CD8+、CD4+T細胞的進一步分群中（圖8（c）、（d）），oHSV-1-GM-CSF＋anti-PD-L1組相較于單用組能顯著性提高血液中CD8+效應T細胞的含量（Plt;0.05）；oHSV-1-GM-CSF與Vehicle組相比能極顯著地提高血液中CD4+效應T細胞水平（Plt;0.001）；oHSV-1-GM-CSF＋anti-PD-L1組相較于anti-PD-L1組也能極顯著上調外周血中CD4+效應T細胞的含量（Plt;0.001）。說明oHSV-1-GM-CSF＋anti-PD-L1組對比于oHSV-1-GM-CSF組上調了小鼠外周血B細胞占比，顯著提高外周血中CD8+效應T細胞和CD4+效應T細胞的含量，同時顯著提高CD8+和CD4+效應T細胞的比例，有效激發機體產生更強的針對CT26.WT腫瘤細胞的特異性殺傷。

3.6 小鼠外周血CD45+細胞體外殺傷結果

4T1與CT26.WT兩種腫瘤細胞屬于同一種屬但發生在小鼠不同部位。本實驗中CFSE+PI+細胞為被CD45+細胞殺傷的腫瘤細胞，CFSE+PI-細胞為腫瘤活細胞。流式結果顯示（圖9、10），針對CT26.WT細胞，anti-PD-L1組（Plt;0.05）、oHSV-1-GM-CSF組（Plt;0.001）以及oHSV-1-GM-CSF+anti-PD-L1聯用組（Plt;0.05）靶效比為1∶40較1∶10的殺傷效果均顯著提高，且聯用組靶效比為1∶40的殺傷效果最強；而針對4T1細胞不同靶效比，聯用組與單用組之間無顯著性差異，表明anti-PD-L1、oHSV-1-GM-CSF以及oHSV-1-GM-CSF+anti-PD-L1聯用組外周血對腫瘤產生的免疫應答以特異性免疫為主。

4 討 論

本研究通過在敲除ICP34.5以及ICP47基因的空載oHSV-1載體上插入mGM-CSF基因，使病毒在裂解腫瘤細胞的同時表達GM-CSF，從而加強機體的免疫識別，誘導局部或全身特異性免疫反應^［15］。體外實驗顯示插入外源基因mGM-CSF后，重組溶瘤病毒oHSV-1-GM-CSF能穩定表達GM-CSF，且溶瘤作用相較于空載病毒無明顯差異。oHSV-1-GM-CSF在治療期間對治療側的腫瘤抑制作用強于oHSV-1-mock，證實所插入的GM-CSF基因的確有助于機體對腫瘤的抑制，但對于治療對側的抑制作用與oHSV-1-mock無顯著性差異。說明在該治療劑量下，oHSV-1-GM-CSF所產生的GM-CSF只能局限于注射部位而無法對遠端的腫瘤產生抑制效果。這可能是由于機體產生的抗病毒中和抗體限制oHSV-1-GM-CSF在體內發揮作用^［16-17］。為了加強給藥對側的治療效果，通過聯合anti-PD-L1抗體產生更強的全身抗腫瘤作用，并初步探究給藥后的小鼠體內的免疫應答

情況。在與anti-PD-L1抗體的聯用后，聯用組顯示出良好的全身抗腫瘤作用，且顯著地延長了小鼠的生存期。對各組小鼠的外周血中的淋巴細胞進行分析，結果表明聯用組相較于單用組顯著上調外周血中B細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞以及CD4+和CD8+效應T細胞的比例，從而有效激發機體產生更強的針對CT26.WT腫瘤細胞的特異性殺傷。為了更直觀地證明聯用組有效激發了小鼠體內的特異性免疫，分離小鼠外周血中的CD45+細胞，并分別與CT26.WT和4T1細胞共培養后，結果表明聯用組對CT26.WT細胞存在更強的殺傷作用，而對同種屬4T1細胞并沒有顯示出相較于Vehicle組更強的殺傷作用。在后面的研究中將會在此治療基礎上加大治療劑量，觀察oHSV-1-GM-CSF對于未注射部位的抑瘤作用，并提取治療后的腫瘤組織分析聯用前后腫瘤組織分子水平的差異，從而進一步探究聯用組發揮有效抑瘤作用的分子機制。

總之，本研究表明oHSV-1-GM-CSF對治療部位的腫瘤抑制效果強于空載病毒，與anti-PD-L1抗體聯用后在小鼠雙側結腸癌皮下移植瘤模型中表現出優于藥物單用的全身抗腫瘤作用，顯示oHSV-1-GM-CSF聯合anti-PD-L1抗體使用在結腸癌臨床治療中具有很大潛力。

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Efficacy of OHSV-1-GM-CSF Combined with Anti PD-L1 Antibody on Bilateral Colon Xenograft Cancer Tumor of Mice

WANG Shengrun， ZHU Chengyang， ZHU Wei， HU Zongfeng， LI Jinfeng， LI Xiaopeng

（School of Pharmacy， Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation （Yantai University）， Ministry of Education， Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong， Yantai University， Yantai 264005， China）

Abstract：In order to verify the effectiveness of oHSV-1-GM-CSF combined with anti-PD-L1 antibody in treating bilateral colon cancer， a subcutaneous tumor model is set up using CT26.WT cells in BALB/c mice. Tumor-bearing mice are randomly assigned to four groups： Vehicle， oHSV-1-GM-CSF， anti-PD-L1， and oHSV-1-GM-CSF+anti-PD-L1. After administration， blood lymphocytes are taken from the mice and analyzed， and tumor regression or recurrence is also observed. The results show that oHSV-1-GM-CSF can express mGM-CSF on CT26.WT cells and there is no significant difference in oncolytic effect between oHSV-1-GM-CSF and the unload virus. In vivo experiments show that， oHSV-1-GM-CSF has a more substantial tumor inhibition effect than the no-load virus on the drug administration side， and oHSV-1-GM-CSF combined with anti-PD-L1 antibody produces a more substantial tumor inhibition effect on the whole body. The proportion of specific immune-related cells in peripheral blood and spleen of the combined treatment group significantly increases. Peripheral blood lymphocytes can kill CT26.WT cells in vitro， meanwhile has no effect on 4T1 cells of the same species. The combined treatment group significantly prolongs the survival time of mice， with a survival rate of 33.3%， and tumor recurrence doesn’t occur. In conclusion， the combination of oHSV-1-GM-CSF and anti-PD-L1 antibody can enhance the specific immunity of the body， produce a lasting tumor inhibition effect， prolong the survival of mice， and provide data support for clinical treatment of colon cancer.

Keywords：colon cancer; bilateral colon cancer transplantation tumor; oncolytic virus; specific immunity

（責任編輯 周雪瑩）