藜麥愈傷組織誘導、增殖及組織細胞學觀察

摘要： 以藜麥Faro無菌種苗為試驗材料，通過組織培養輔助細胞學觀察建立愈傷組織誘導、增殖體系。試驗結果表明，以子葉、胚軸及種胚為外植體均能誘導獲得愈傷組織，但最佳培養基配方有明顯差異：子葉外植體配方為MS+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，胚軸外植體配方為MS+0.5 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L 6-BA，而種胚外植體配方為MS+0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L ZT。優化篩選愈傷組織繼代增殖培養基為MS+0.1 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA。增加蔗糖濃度有利于藜麥愈傷組織非胚性細胞向胚性細胞轉化。

關鍵詞： 藜麥品種Faro；愈傷組織；誘導；增殖；組織細胞學

中圖分類號： S519

文獻標志碼： A

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）由于其特殊的生物學特性和豐富的營養價值，近年來備受關注^［1-3］。藜麥具有較強抗逆性，其中耐鹽性最為典型^［4］，近年來有將藜麥作為耐鹽模式植物的趨勢^［5］。藜麥的分子研究涉及基因編輯、遺傳轉化、體外多倍體培養等多種生物技術，其中的難點就是藜麥轉基因作物的培育^［6］，而轉基因技術的基礎就是離體培養無性繁殖。

目前，關于藜麥的研究主要集中在引種馴化、生物學特性、化學成分、抗逆性等生理學特性方面，有關藜麥離體培養無性繁殖體系的建立研究的報道較少。國內外有關藜麥直接器官發生體系的建立報道較多：REGALADO 團隊建立了一套完整的兩個沿海藜麥品種的直接發生體系^［5］；HESAMI 等建立了直接發生腋芽誘導方案，但沒有明確說明實驗品種^［7］；段鵬慧等以HQ1品種的藜麥帶腋芽的莖段為外植體，建立了藜麥離體直接發生體系^［8］；吳筱林建立了Faro品種的直接發生腋芽、叢生芽誘導方案^［9］。有關藜麥間接器官發生體系報道成功案例少，EISA等從體細胞胚再生藜麥植株，成功率為5%，未報道植株馴化信息^［10］；HESAMI等通過愈傷組織培養再生藜麥不定芽的成功率很高（86.7%）^［11］。曹寧等完成臺灣紅黎藜麥莖段愈傷組織的誘導^［12］；王燕芳等從18個藜麥品種中篩選出9個較易誘導出愈傷組織的品種^［13］；俞涵譯等完成9個藜麥品種的藜麥愈傷組織誘導體系優化^［14］；田娟等完成2個藜麥品種的藜麥愈傷組織誘導體系建立^［15］；劉潔玉等建立了藜麥下胚軸離體間接發生方法，未明確說明藜麥品種^［16］。根據相關研究可見，藜麥發生體系種間差異較大，建立一套具有針對實驗室研究藜麥品種Faro的愈傷組織發生體系可以為Faro品種的間接器官發生體系和體細胞胚發生體系的建立提供參考。

1 材料與方法

選用來自智利中部（緯度34.65 °，經度71.91 °）的藜麥品種Faro，在實驗室培育保存。首先采用正交試驗，以子葉作為外植體，培養基中設計2，4-D、ZT、酪蛋白三種植物生長調節劑配比組合，以及6-BA、NAA兩種植物生長調節劑配比組合，35 d后觀察誘導產生的愈傷組織的生長狀態，統計愈傷組織誘導率及生長情況。對愈傷組織誘導的主要影響因子進行初步篩選。根據預實驗結果，對不同外植體的愈傷組織誘導培養基中的植物生長調節劑配比進行進一步篩選。將愈傷誘導得到的優質松散愈傷組織繼代培養，設計2，4-D、6-BA配比組合，以及不同濃度TDZ的配比，經過25 d培養，統計愈傷組織增值率及顯微觀察愈傷組織細胞組織學狀態，篩選最佳的愈傷增殖植物生長激素配比。根據繼代實驗的結果，選擇繼代階段最佳培養基進一步實驗，討論糖濃度對藜麥胚性愈傷組織誘導的影響。的每個實驗配方接種10瓶，每瓶培養基中接種4個外植體，進行3次平行試驗。實驗外植體接種于培養瓶中，培養溫度為（25±1） ℃，暗培養。

除另有說明外，實驗所需基礎培養基為Murashige和Skoog （MS）培養基。所有培養基中添加蔗糖30 g/L、肌醇100 mg/L、酪蛋白水解物100 mg/L，用5.5 g/L瓊脂固化。培養基中加入相應植物生長調節劑后，用1 mol/L NaOH調節pH至5.8， 121 ℃滅菌20 min。

藜麥種子在自來水流水沖洗2 h后，75%乙醇沖洗30 s，0.1%氯化汞溶液滅菌10 min，再用無菌蒸餾水沖洗5次，每次5 min，獲得無菌種子。將無菌種子接種到添加20 g/L蔗糖和1 g/L活性炭的1/2MS基礎培養基。黑暗培養3 d后，光照培養5 d，得到藜麥無菌幼苗。將帶有芽點的子葉的葉片切除一半作為子葉外植體，將靠近頂芽約0.5 cm的胚軸作為胚軸外植體。將滅菌階段獲得的無菌種子浸泡在無菌水中12 h后，均勻按壓無菌種子，擠出藜麥環形胚，獲得無菌種胚。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織誘導的影響因子篩選

愈傷誘導第10天，部分處理外植體開始膨大，切口處有少量愈傷組織發生，部分外植體芽點處有不定芽發生；另外部分子葉外植體未能形成愈傷組織發生僅有芽點處有不定芽發生。20 d后，愈傷組織進一步膨大，不定芽伸長。

試驗結果（表1）表明，較高濃度的2，4-D和ZT組合配比愈傷誘導率較好，例如，配比0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L ZT+0.1 g/L酪蛋白、0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L ZT+0.1 g/L酪蛋白、0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L ZT+0.3 g/L酪蛋白，愈傷組織量多，組織疏松，呈白色，無黃化褐化等情況（圖1a）。而不同濃度的酪蛋白對于愈傷組織誘導并無顯著影響。植物生長調節劑6-BA、NAA組合配比愈傷誘導率較好，配比4.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L組的NAA愈傷組織生長良好，組織疏松，愈傷組織量較多，呈淡綠色，有少量褐化情況，有部分外植體在芽點處有不定芽發生（圖1b）。綜合考慮，植物生長調節劑6-BA、2，4-D和ZT是藜麥愈傷組織啟動的主要影響因子。后續實驗選擇較高濃度的三種植物生長調節劑組合配比，篩選出最優的藜麥品種Faro愈傷組織誘導條件。

2.2 不同外植體和植物生長調節劑配比對愈傷組織誘導的影響

設計植物生長調節劑6-BA、2，4-D和ZT兩兩組合，取不同的外植體接種培養。結果（表2）表明，不同外植體愈傷誘導的最佳植物生長調節劑配比差別較大。子葉外植體最佳愈傷誘導植物生長調節劑配比為0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA。在此處理下，子葉外植體在10 d啟動，初步形成愈傷組織，20 d愈傷開始快速膨大，疏松，最終獲得的愈傷組織疏松、呈白色、無褐化黃化（圖1c）。4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L組的NAA愈傷誘導率較高，但存在少量子葉芽點發生不定芽，誘導愈傷組織量多，組織疏松，呈淡綠色，存在少量褐化現象，同時愈傷組織上

有芽點發生（圖1d）。胚軸外植體愈傷誘導最佳植物生長調節劑配比為0.5 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L6-BA，2，4-D和6-BA組合的3個處理下愈傷組織誘導率均很高，在10 d內啟動愈傷，三個處理愈傷組織狀態無明顯差異，組織量多、疏松，呈白色，無褐化黃化現象（圖1e）。種胚外植體最佳愈傷誘導植物生長調節劑濃度配比為0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L ZT。愈傷組織誘導率高，芽點不定芽發生率低。配比0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L ZT在愈傷誘導的前10 d，有部分種胚外植體伸長生長，也有愈傷啟動，10 d后外植體不再伸長，愈傷組織快速膨大、疏松，最終獲得的愈傷組織量大、組織疏松，呈白色，無褐化黃化現象（圖1f）。

2.3 不同植物生長調節劑配比對愈傷組織增殖的影響

藜麥愈傷組織增殖在25 d后愈傷組織即生長到旺盛狀態；子葉、胚軸、種胚外植體經過2次繼代培養即可完全脫分化。繼代得到的愈傷組織在形態學上觀察，大部分呈白色，松散，但在顆粒大小上區別明顯。結合細胞組織學觀察對比得出，顆粒小的愈傷組織大部分細胞小而規則，細胞質濃厚，細胞核大，具有明顯的胚性細胞的特點；而顆粒大的愈傷組織，細胞質稀薄，細胞核小。

實驗結果（表3）表明，處理F3愈傷組織增殖率最大（803.90%），其次為處理F2（782.43%），兩個處理間的差異無統計學意義。從愈傷組織生長情況觀察，0.1 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA組愈傷組織松散，組織顆粒大，呈白色，無黃化褐化現象（圖1g）；愈傷組織細胞小但部分細胞形狀不規則，細胞質稀薄，細胞核小（圖2a），為非胚性細胞。而0.1 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA組愈傷組織松散，組織顆粒小，呈白色，無黃化褐化現象（圖1h）；愈傷組織細胞小呈規則圓形，細胞質濃厚，細胞核較大（圖2b、c），具有胚性細胞特點，有再生潛力。根據細胞觀察結果，0.1mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-BA組誘導得到的愈傷組織具有胚性愈傷組織特點，更適宜作為愈傷組織增殖的最佳植物生長調節劑配比。1.0 mg/L TDZ組愈傷組織增殖率不高，為679.95%；愈傷組織松散、顆粒大，呈白色，無褐化黃化現象（圖1i）；但是愈傷組織細胞存在少部分細胞小呈規則圓形，細胞質濃厚，細胞核較大（圖2d），具有胚性細胞特點。

綜合愈傷組織增殖率和愈傷組織細胞是否具有胚性細胞的特征，選擇配比0.1 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA作為藜麥品種Faro最佳愈傷組織繼代增殖最佳植物生長調節劑配比。

2.4 不同蔗糖濃度對于愈傷組織增殖的影響

根據前期實驗結果，選取增殖實驗愈傷細胞中具有胚性細胞特點的細胞比例較大的兩個植物生長調節劑配比2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.2 mg/L和TDZ 1.0 mg/L，設計增加蔗糖濃度誘導愈傷組織增殖。結果（表4）表明，在相同的植物生長調節劑配比下，隨著蔗糖濃度升高，愈傷組織增殖率增加，愈傷形態學上組織顆粒變小。根據細胞學觀察可見，隨著蔗糖濃度升高，具有胚性細胞特點的愈傷組織增多（圖2e、f）。，TDZ 1.0 mg/L組具有胚性細胞特點的細胞比例隨著蔗糖濃度增加的增幅大于2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.2 mg/L組，但總體來說，2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.2 mg/L胚性細胞特點的細胞比例高，當蔗糖濃度達到60 g時，比例可達66.32%。

綜上，增加蔗糖濃度有利于藜麥愈傷組織細胞向胚性細胞狀態轉化。

3 討 論

3.1 不同植物生長調節劑配比對于藜麥愈傷組織誘導的影響

常用于愈傷組織誘導的植物生長調節劑為6-BA、2，4-D、NAA^［17］，不同外植體愈傷誘導最佳的植物生長調節劑濃度配比不同。本研究結果表明，藜麥品種Faro子葉誘導愈傷組織最佳植物生長調節劑配比為0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，這與其他品種的藜麥子葉外植體愈傷誘導最佳植物生長調節劑配比不同^［13］，由此可見，不同的藜麥品種主要影響植物生長調節劑差異較大。4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LNAA誘導的子葉外植體愈傷組織上有芽點發生，這對于后續的藜麥間接器官發生體系建立具有較高的參考價值。6-BA和NAA配比可誘導藜麥愈傷組織間接發生，這一結論與劉潔玉等^［16］實驗結果一致。藜麥品種Faro胚軸誘導愈傷組織最佳植物生長調節劑配比都為0.5 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L 6-BA，與子葉外植體相比，胚軸外植體所需的植物生長調節劑水平較低。ZT對于胚性愈傷組織的產生具有誘導作用^［18］，種胚外植體最佳愈傷組織誘導植物生長調節劑配比為0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L ZT。

3.2 不同植物生長調節劑配比對于藜麥愈傷組織增殖的影響

胚性愈傷組織具有胚胎發生能力，是再生體系建立的重要基礎。胚性愈傷組織增殖力旺盛，增殖率高。胚性愈傷組織細胞小呈規則圓形，排列緊密，細胞質濃厚，細胞核較大，與非胚性細胞具有明顯差異^［19］。實驗結果表明，0.1 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA誘導增殖的愈傷組織細胞具有明顯的胚性細胞特點。藜麥品種Faro胚性愈傷組織松散，組織顆粒相較于非胚性愈傷組織較小。1.0 mg/L TDZ誘導增殖的愈傷組織部分細胞具有胚性細胞的特點，有研究表明，植物生長激素TDZ對于荔枝^［20］、花生^［21］、煙草^［22］等多種植物的體胚發生具有促進作用。1.0 mg/L 的TDZ配比對于增加體胚細胞的比例研究具有重要價值。

3.3 不同蔗糖濃度對于藜麥愈傷組織增殖的影響

蔗糖可以為愈傷組織提供增殖發育所需的能量和碳源，也可以調節培養基滲透勢，維持植物材料的滲透壓^［23］。實驗結果表明，藜麥相比其他植物如杜鵑^［24］、荔枝^［25］、卷丹^［26］等愈傷組織增殖率高，說明藜麥愈傷組織增殖速度快。藜麥屬于高滲透壓植物^［27］，培養基滲透壓較高利于愈傷組織吸收培養基的營養成分。本研究中，實驗誘導增殖的大部分愈傷組織與胚性愈傷組織的差別是細胞質稀薄，增加蔗糖含量后，愈傷組織細胞質顯著濃厚，大部分細胞更加規則，呈圓形。因此，增加蔗糖濃度更有利于藜麥愈傷組織細胞向胚性狀態轉化。

4 結 論

（1） 愈傷誘導最佳植物生長調節劑配比為：子葉外植體 MS+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，胚軸外植 MS+0.5 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L 6-BA，種胚外植體 MS+0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L ZT。

（2） 優化篩選愈傷組織繼代增殖培養基為MS+0.1 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA。

（3） 增加蔗糖濃度有利于藜麥愈傷組織非胚性細胞向胚性細胞轉化。

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Establishment of Callus Induction and Proliferation System and

Histological Observation of Chenopodium Quinoa Willd.

GONG Yuan， GUO Shanli， CHEN Shihua， LIANG Likun， YOU Cuirong

（School of Life Sciences， Yantai University， Yantai 264005， China）

Abstract：The callus induction and proliferation system of quinoa Faro is established through tissue culture assisted cytological observation. The results show that the cotyledon， hypocotyl and seed embryo as explants can induce callus， but there are significant differences in the optimal medium formula： cotyledon explants are MS+0.5mg/L 2， 4-D +0.5mg/L 6-BA， cotyl explants are MS+0.5mg/L 2，4-D+0.05mg/L 6-BA， and seed embryo explants are MS+0.2mg/L 2， 4-D +0.5mg/L ZT. Callus proliferation mediam is optimized for MS+0.1mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-BA. Increasing sucrose concentration is beneficial to the transformation of callus cells into embryogenic cells.

Keywords："quinoa variety Faro; callus; induction; proliferation; tissue cytology

（責任編輯 周雪瑩）