5-HT2A受體反向激動劑LPM6690061對AD大鼠精神病性癥狀的治療作用及機制

摘要： 旨在研究5-HT2A受體反向激動劑LPM6690061對阿爾茨海默伴發精神病性癥狀大鼠模型的作用及其相關作用機制。建立雙側海馬注入β-淀粉樣蛋白（Aβ）AD大鼠模型，采用DOI誘導AD大鼠出現精神病相關行為表型，灌胃給予3.0 mg/kg LPM6690061進行體內藥效學及機制研究。采用Western Blot（WB）檢測LPM6690061對磷酸化蛋白激酶B（P-AKT）、磷酸化環磷腺苷效應元件結合蛋白（P-CREB）、腦源性神經營養因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在海馬中表達水平的影響；采用尼氏染色觀察海馬區神經細胞形態和數量的改變；高爾基染色檢測LPM6690061對大鼠海馬樹突棘密度的影響。結果表明，LPM6690061可顯著減輕DOI誘導的大鼠甩頭。在新物體識別試驗中，LPM6690061顯著改善了Aβ引起的認知障礙。前脈沖抑制測試中，LPM6690061顯著提高了ADP大鼠的前脈沖抑制率。LPM6690061可增加ADP大鼠海馬區P-AKT、P-CREB、BDNF的蛋白表達水平，增加海馬區神經元數量，顯著緩解由聚集態Aβ造成的樹突棘密度降低。上述研究結果表明，LPM6690061可以通過AKT/CREB/BDNF途徑改善由Aβ沉積對突觸可塑性的影響，從而減輕ADP大鼠精神癥狀，改善ADP大鼠認知障礙。

關鍵詞： 阿爾茨海默伴發精神病性癥狀；5-HT2A受體；BDNF；突觸可塑性

中圖分類號： R964""""""" 文獻標志碼： A

患有阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的人大約有50%會出現精神病性癥狀，稱為阿爾茨海默伴發精神病性癥狀（Psychosis in Alzheimer’s disease，ADP）^［1］，通常患者不僅會出現更為嚴重的認知障礙，還會出現幻覺和妄想等，進一步加劇了對個人和家屬的影響。ADP發病機制尚不明確，但研究表明ADP患者存在γ-氨基丁酸（GABA）能缺陷和谷氨酸系統代謝異常，這可能是由于β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積破壞了小清蛋白陽性中間神經元，使其無法與谷氨酸能錐體細胞連接傳遞抑制性神經遞質，導致谷氨酸能錐體細胞過度興奮，當興奮/抑制平衡被破壞時會出現精神病性癥狀^［2］。5-HT2A受體與錐體細胞興奮性在解剖學和功能上存在聯系，5-HT2A受體調節谷氨酸能錐體細胞的興奮性，高水平表達會使神經元細胞過度興奮導致精神病性癥狀，受這些病理變化影響的大腦區域與5-HT2A受體高水平表達的區域一致^［3］，5-HT2A受體激活還會導致腦源性神經營養因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平下降，BDNF在谷氨酸能和GABA能突觸的正常生長、發育中發揮重要

作用^［4］，是大腦中神經元突觸可塑性的關鍵介質，BDNF可以促進神經元生長、大腦神經細胞突觸的形成和穩定，以及促長時程增強作用。因此，抑制5-HT2A受體激活可以幫助控制阿爾茨海默病中發現的神經元超興奮性和伴隨的精神病行為。

突觸的傳遞是谷氨酸通過其受體實現的，目前普遍使用離子型谷氨酸受體N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）受體拮抗劑美金剛治療AD，該藥物可以抑制NMDA受體的興奮毒性作用，但這種藥物會加重甚至誘導AD患者產生新的視幻覺^［5］。5-HT2A受體基本上受到所有非典型抗精神病藥物的影響^［6］，接受利培酮、奧氮平和阿立哌唑等抗精神病藥物治療的癡呆相關精神病老年患者死亡風險增加，選擇性5-HT2A受體反向激動劑和功能性拮抗劑匹莫范色林則具有廣泛代謝、引起心電QT間期延長以及肺臟毒性等毒副作用，這幾個藥物尚未獲批用于治療癡呆相關精神病患者^［7］。與抗精神病藥物相比，其他藥物如選擇性5-HT再攝取抑制劑的療效甚微^［8］。針對以上缺陷，研究者正在開發許多新型的5-HT2A受體反向激動劑，以提高5-HT2A受體反向激動劑/拮抗劑活性，增強其代謝穩定性，從而獲得更好的治療效果和良好的安全性。

LPM6690061為綠葉制藥有限公司開發的新型選擇性5-HT2A受體反向激動劑，LPM6690061對人5-HT2A受體具有較高的反向激動和拮抗活性，在大鼠體內表現出比匹莫范色林更有效的抗精神病樣活性^［9］。化學名為1-（（5-氟吡啶-2-基）甲基）-1-（1-甲基哌啶-4-基）-3-（4-（2，2，2-三氟乙氧基）芐基）脲檸檬酸鹽，分子式為C22H26F4N4O2·C6H8O7，分子質量646.59 u。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

購于北京維通利華的6～8周齡雄性SD大鼠，體重為180～200 g，動物生產許可證號為SCXK（京）2021-0011，飼養于無特定病原體SPF級明暗交替（12 h/12 h）的標準動物房，相對濕度40%～70%，保持室溫（23±1） ℃，自由飲水飲食，動物提前一周適應實驗室環境。動物實驗方案經煙臺大學動物倫理委員會批準。

1.2 藥品與試劑

LPM6690061（山東綠葉制藥有限公司合成）；Aβ1-42、（±）-DOI 鹽酸鹽（MCE）；水合三氯乙醛（阿拉丁）；青霉素鈉（魯抗）；GAPDH抗體（大鼠單抗）、BCA濃度測定試劑盒（增強型）、酶標山羊抗兔 IgG、山羊抗鼠 IgG（碧云天生物技術公司）；BDNF抗體、CREB抗體、P-CREB抗體（Abcam）；AKT抗體、P-AKT抗體（CST）；尼式染色試劑盒（賽默飛）；高爾基染色試劑盒（FD Neuro Tech）。

1.3 主要儀器

電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；磁力加熱攪拌器、渦旋混勻儀（德國IKA）；離心機（美國 Beckman公司）；細胞培養箱（美國 Thermo Fisher）；腦立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；新物體識別裝置（上海軟隆科技發展有限公司）；震驚條件反射裝置（上海欣軟）；酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；電泳儀、轉膜儀、顯影儀器（美國Bio-Rad公司）；脫水機、包埋機、冰凍切片機（賽默飛世爾科技）；石蠟組織切片機（徠卡）；OLYMPUSIX73倒置熒光顯微鏡（北京奧林巴斯有限公司）。

2 實驗方法

2.1 藥物配制

2.1.1 Aβ1-42寡聚體的孵育 將1 mg Aβ1-42肽片段溶于44 μL的二甲亞砜（DMSO）中，溶解后緩慢加入磷酸鹽緩沖（PBS）溶液（456 μL），輕搖混勻，定容到2 μg/μL。封口膜封好后，將溶液放入37 ℃恒溫培養箱中孵育7 d，使其聚集老化。

2.1.2 LPM6690061、DOI、水合氯醛配制 分別稱取一定量LPM6690061、DOI和三氯乙醛，加入生理鹽水中，放于磁力攪拌器上攪拌溶解。各藥物濃度配置如下： LPM6690061 1.5 mg/mL、DOI 1 mg/mL、水合氯醛0.1 g/mL。

2.2 AD模型的建立

所有動物術前禁食12 h，自由進水。腦立體術前對大鼠進行隨機分組，分為Sham組15只、AD組30只。腹腔注射10%（0.4 mL/100 g）水合氯醛將大鼠麻醉后固定在腦立體定位儀上，剪開頭頂部皮膚，雙氧水腐蝕筋膜充分暴露前囟。按照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為零點，前囟向后3 mm，中線左右側旁開2 mm處為定位點，用牙科鉆鉆開顱骨，微量注射器自顱骨表面垂直進針3 mm，其中30只大鼠雙側海馬CA1區以1 μL/min勻速注射聚集態Aβ1-42各5 μL（2 μg/μL），留針10 min，制作AD大鼠；15只大鼠注入1.5 μL生理鹽水為Sham組大鼠。退針后用牙科膠覆蓋小孔，縫合傷口，術后連續3 d腹腔注射青霉素鈉預防感染。

2.3 大鼠分組及給藥

手術5 d后，將AD大鼠隨機分為ADP組、LPM6690061（LPM-3）組，每組15只，Sham組大鼠15只。LPM-3組灌胃給藥3.0 mg/kg LPM6690061，Sham組和ADP組按相同體積灌胃生理鹽水，每天1次，連續14 d，給藥第1天定義為試驗第1天。試驗第3天，ADP組和LPM-3組大鼠腹腔注射給予DOI（2.7 mg/kg），Sham組按相同體積腹腔注射生理鹽水，進行甩頭試驗；試驗第7天，ADP組和LPM-3組大鼠腹腔注射給予DOI，Sham組按相同體積腹腔注射生理鹽水，進行新物體識別試驗；試驗第14天，ADP組和LPM-3組大鼠腹腔注射給予DOI，Sham組按相同體積腹腔注射生理鹽水，進行前脈沖抑制試驗。

2.4 甩頭試驗

試驗第3天，灌胃給予LPM6690061 1 h后，ADP組和LPM-3組大鼠腹腔注射給予DOI，Sham組按相同體積腹腔注射生理鹽水，進行甩頭試驗。試驗開始時人工統計給予DOI后5-35 min內的甩頭次數。

2.5 新物體識別試驗

新物體識別試驗可以用來檢測動物對于不同物體的偏好性，試驗第7天進行，根據藥物半衰期調整給藥時間。試驗前一天將3組大鼠放置到新物體識別實驗室適應環境。試驗開始先將動物放進設備（60 cm×60 cm×45 cm的藍色PVC箱）中適應環境10 min，隨后開始給藥進行試驗。試驗分為2個階段，訓練期： 在箱體的左上、右下2處各放置2個不易挪動的長方體盒子（熟悉物體），放入大鼠并探索10 min。40 min之后進入測試期，將左上方的長方體更換為圓柱形瓶子（新物體），重新放入大鼠并探索10 min。TopScan監控系統記錄大鼠的探索過程并統計大鼠在新物體2 cm范圍內的探索行為持續時間。

2.6 前脈沖抑制試驗

試驗第14天進行前脈沖抑制試驗，試驗程序包括適應期、Block 1～3等4個階段，各階段包括不同強度及模式的前脈沖刺激。適應期大鼠在背景噪聲為62 dB的測試箱中適應5 min以減小背景噪音對結果的干擾。Block 1階段為120 dB的震驚刺激，共10次。Block 2階段包括6種模式，以偽隨機的形式出現： ①僅62 dB背景噪聲；②僅120 dB震驚剌激；③僅74 dB、78 dB或86 dB的前脈沖刺激；④～⑥74、78、86 dB 前脈沖刺激區間隔100 ms的120 dB震驚刺激。模式③每6次出現1次，相鄰模式之間間隔10～20 s。Block 2階段共40次震驚刺激，用于檢測大鼠的前脈沖抑制強度。Block 3階段同Block 1，用于與Block 1對比分析大鼠是否在實驗中產生適應性。采集驚跳的反應幅度數據后，采用上海欣軟軟件進行處理和分析。用前脈沖抑制效率（PPI）表示前脈沖抑制的強度，PPI=（震驚刺激的反應幅度-前脈沖聯合震驚刺激的反應幅度）100%。

2.7 Western Blot法檢測ADP大鼠海馬BDNF、CREB、P-CREB、AKT、P-AKT蛋白表達給藥結束后，每組隨機取3只大鼠，用PBS進行心臟灌注，取腦。冰上分離海馬部位，加適量裂解液研磨組織，具體操作步驟嚴格按照BCA蛋白提取試劑盒說明，以50 μg/10 μL的上樣體積進行上樣，電泳，轉膜，封閉后4 ℃孵育一抗過夜。次日TBST洗滌，加入二抗，室溫孵育2 h，用ECL顯影液顯影。采用 Image J軟件進行圖片分析。

2.8 尼氏染色

每組隨機取3只大鼠，灌注100 mL PBS后，繼續灌注50 mL 4%多聚甲醛。灌注完成后，小心剝離腦殼暴露全腦，取出全腦放入4%多聚甲醛內固定48 h后置于全自動脫水機脫水，完全脫水后，取含有海馬中段部位進行石蠟包埋以及切片。

將石蠟切片放入60 ℃烘箱2 h后進行脫蠟處理，56 ℃烘箱0.1%焦油紫染色60 min，染色完畢后，經PBS溶液沖洗數次，再用尼氏分化液分化，直至尼氏小體呈紫色。最后，經梯度酒精常規脫水透明，二甲苯透明后封片，光鏡下觀察。

2.9 高爾基染色（Golgi-Cox法）

根據高爾基染色試劑（FD Rapid GolgiStain^TM Kit FD neurotechnologiec，Inc）實驗手冊指導，提前1 d將A液和B液按1∶1混合并常溫避光保存。行為學結束，將大鼠水合氯醛麻醉后完整取出全腦，置于 AB 混合液中室溫黑暗放置14 d，用于高爾基染色。14 d后棄去混合液體加入C液并避光室溫保存7 d。7 d后用干冰-異戊烷速凍法冰凍組織并保存于-150 ℃冰箱。

將冰凍的腦組織用冰凍切片機切成 100～140 μm厚的切片并轉移到明膠包被載玻片上于室溫黑暗條件下自然風干。根據實驗手冊染色后在油鏡下觀察海馬區域樹突棘形態并計數。

2.10 統計分析

所有數據均以均數±標準誤（x-±sx-）表示，Graphpad prism作圖。新物體識別試驗數據采用t檢驗；其余數據均采用單因素方差分析（One-way ANOVA），當單因素方差分析顯示差異有統計學意義時（P≤0.05），采用Tukey事后比較，分析比較組間的差異；當單因素方差分析顯示差異無統計學意義時（Pgt;0.05），則統計分析結束。Plt;0.05表示組間差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 LPM6690061抑制ADP大鼠甩頭行為各組間大鼠甩頭次數通過單因素方差分析和Tukey事后比較進行分析，結果如圖2所示。與Sham組大鼠甩頭次數（1±0.4）相比，ADP組大鼠的甩頭次數（24.9±1.9）顯著增加（Plt;0.001），LPM-3組大鼠的甩頭次數（1.8±0.6）較Sham組大鼠無顯著性差異，較ADP組大鼠顯著減少（Plt;0.001）。

3.2 LPM6690061對ADP大鼠新物體識別能力的改善作用

如圖3（a）所示，經 t 檢驗分析，訓練期間3組大鼠對于左右兩側相同物體探索時間的差異不具有統計學意義。如圖3 （b）所示，經對樣本 t 檢驗分析，ADP組大鼠對新物體的探索時間與熟悉物體相似，測試期Sham組大鼠和LPM-3組大鼠對新物體探索時間更長，對于熟悉物體和新物體探索時間的差異具有統計學意義（Plt;0.05）。正的識別指數表示大鼠更多地選擇與新物體互動，而負的識別指數表示大鼠更多地選擇與熟悉物體互動，如圖3（c）所示，聚集態Aβ和DOI會導致大鼠出現認知障礙，LPM6690061對認知癥狀具有一定的改善作用。

3.3 LPM6690061提高ADP大鼠前脈沖抑制率

通常在精神病狀態下可以觀察到運動活性的增加和前脈沖抑制缺陷，它代表大鼠在接受前脈沖刺激后對震驚刺激的反應抑制程度，隨著聲音刺激的產生和增強，大鼠主要肌群出現收縮和舒張，因此前脈沖抑制試驗常用于評價大鼠反應性。隨著前脈沖分貝數增加（74、78、86 dB），大鼠對120 dB的震驚刺激反應減少，因此，前脈沖的PPI增加。如圖4所示，前脈沖刺激在74、78、86 dB下，ADP組大鼠對震驚刺激反應增加，PPI較Sham組大鼠顯著下降（Plt;0.05，Plt;0.01）；LPM-3組大鼠相比于ADP組大鼠，PPI顯著上升（Plt;0.05，Plt;0.01），較Sham組大鼠無顯著性差異，因此，LPM6690061對DOI誘導的ADP大鼠前脈沖抑制率降低具有改善作用。

3.4 LPM6690061增加ADP大鼠海馬部位P-AKT、P-CREB、BDNF的表達量

實驗結果如圖5表明： 與Sham組相比，ADP組大鼠海馬部位P-AKT、P-CREB、BDNF表達量顯著降低（Plt;0.01，Plt;0.001）。與ADP組大鼠相比，LPM-3組P-AKT、P-CREB、BDNF的表達量均顯著上升 （Plt;0.01，Plt;0.001），結果顯示，ADP組大鼠海馬AKT、CREB磷酸化水平降低，BDNF蛋白表達減少， LPM6690061能夠促進海馬AKT、CREB的磷酸化，從而提高BDNF的表達。ADP組及LPM-3組大鼠AKT及CREB總蛋白表達未見顯著差異。

3.5 給予LPM6690061后大鼠海馬神經元明顯增多

結果如圖6（a）所示，與Sham組比較，ADP組大鼠海馬區的神經元數量明顯減少（Plt;0.001）；與ADP組相比，LPM-3組大鼠海馬區神經元數量顯著增多（Plt;0.01）。

3.6 LPM6690061對ADP大鼠海馬樹突棘密度的影響

采用高爾基染色法檢測海馬內樹突棘數量的變化。結果如圖7所示，與Sham組相比，ADP組樹突棘密度顯著降低（Plt;0.001）。LPM-3組大鼠樹突棘密度較ADP組顯著增加（Plt;0.001），較Sham組大鼠無顯著變化。ADP大鼠樹突棘密度降低，經LPM6690061治療后會增加ADP大鼠樹突棘密度。LPM6690061能夠通過改善突觸可塑性來發揮治療作用。

4 討 論

目前有關于ADP致病機理的研究非常廣泛，其中最具影響力的假說為Aβ沉積，腦內發揮毒性作用的Aβ主要分為Aβ1-40和Aβ1-42，基于此，本實驗于大鼠海馬CA1區注射Aβ1-42同時暴露于致幻劑5-HT2A受體激動劑DOI制作ADP模型，基本模擬了ADP患者學習記憶和空間記憶能力減退、膠質細胞炎癥反應等病理學特征。

妄想和幻覺等陽性癥狀是ADP的核心癥狀之一，因此使用5-羥色胺前體（5-HTP）誘發甩頭模型，此模型基于5-HT受體系統功能失調假說設計，該行為主要由 5-HT2A受體介導，引起動物不自主的耳廓反應。本研究通過統計甩頭反應次數來檢測化合物對于 5-HT2A受體反向激動能力，結果顯示LPM-3組和Sham組大鼠的甩頭次數相似，間接反映出化合物對于ADP陽性癥狀的改善作用。新物體識別試驗結果表明，LPM6690061對Aβ1-42引起的認知障礙有改善作用且效果顯著。長期以來，前脈沖抑制缺陷被認為是精神分裂癥精神病的特征，通常在精神病狀態下可以觀察到運動活性的增加和前脈沖抑制缺陷^［10］。在前脈沖抑制缺陷試驗中，LPM-3組大鼠相比于ADP組大鼠，PPI顯著上升，與Sham組相似，表明LPM6690061對感覺運動門控功能具有調節作用，LPM-3組大鼠的前脈沖抑制缺陷現象得到明顯改善。行為學實驗后對大鼠腦切片進行了尼氏染色，結果顯示，ADP組大鼠組大腦海馬區的神經元出現顯著的形態結構改變，推測可能是該模型大鼠腦神經元內出現了中央性尼氏小體溶解現象，而尼氏小體溶解可能源于神經元胞體與突起的斷離所致，是神經元凋亡的原因之一^［11］。LPM-3組大鼠腦切片顯示細胞質內尼氏小體數量顯著增加。在此基礎上，本研究探索了LPM6690061對于突觸形態可塑性的影響及其作用機制。BDNF作為一種重要的神經營養因子在神經系統的發育及功能維持中起重要作用，其最重要的功能包括對神經、膠質細胞和突觸形成的調節，起到神經保護作用以及對長短時記憶的控制^［12］。蛋白激酶B（AKT）在哺乳動物中大量表達，在維持細胞的統一性和存活中具有重要作用^［13］。從機制上講，BDNF是CREB的靶基因，在中樞神經系統（CNS）的突觸可塑性中起主要作用^［14］。AKT神經保護途徑激活CREB，使包括神經元在內的許多細胞被磷酸化并存活，從而誘導BDNF等靶基因的轉錄，促進內源性BDNF的合成，進而促進神經元的生成和存活^［15］。Western Blot結果顯示，ADP組大鼠P-AKT、P-CREB、BDNF表達量較Sham組均顯著減少，LPM-3組大鼠較ADP組大鼠三種蛋白表達量均顯著增加。聚集態Aβ1-42會引起海馬區錐體神經元樹突棘密度顯著下降，本研究采用高爾基染色的方法檢測了大鼠海馬神經元中樹突棘的密度，結果表明LPM-3組相比于ADP組樹突棘密度顯著增加，且相比于Sham組差異無統計學意義，說明LPM6690061可能通過AKT/CREB/BDNF通路改善突觸可塑性。

5 結 論

綜合以上結果，LPM6690061作為5-HT2A受體反向激動劑，通過反向激動5-HT2A受體，增加 AKT和CREB的磷酸化，促進BDNF蛋白表達，改善突觸可塑性，從而減輕由聚集態Aβ1-42引起的ADP。體內藥理學研究表明，LPM6690061是一種強而有效的5-HT2A受體反向激動劑，具有顯著的抗精神病樣活性和良好的安全性，有力地支持了其作為新型抗精神病藥物的臨床開發。

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Therapeutic Effect and Mechanism of 5-HT2A Receptor Reverse Agonist

LPM6690061 on Psychiatric Symptoms in Alzheimer’s Disease（AD） Rats

YANG Yue， ZHANG Xiaofan， ZHU Xiaoyin， TIAN Jingwei

（School of Pharmacy， Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation （Yantai University），Ministry of Education， Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong， Yantai University，Yantai 264005，China）

Abstract： This article aimed to investigate the effects and related mechanisms of the 5-HT2A receptor reverse agonist LPM6690061 on a rat model of psychosis in Alzheimer’s disease（ADP）. A bilateral hippocampal injection of β-Amyloid protein （Aβ） was used to establish an AD rat model， and DOI was used to induce psychopathic behavior phenotypes in AD rats. Oral administration of 3.0 mg/kg LPM6690061 was used for in vivo pharmacological and mechanistic studies. The effects of LPM6690061 on the expression levels of phosphorylated protein kinase B （P-AKT）， phosphorylated cyclic adenosine monophosphate effector element binding protein （P-CREB）， and brain-derived neurotrophic factor （BDNF） in the hippocampus were examined by Western Blot （WB）. Nissl staining was utilized to observe changes in the neuronal morphology and quantity of the hippocampal neurocytes. Golgi-Cox staining was employed to assess the impact of LPM6690061 on the dendritic spine density in the hippocampus of rats. The results indicated that LPM6690061 significantly alleviated DOI-induced head-twitch response in rates. In the new object recognition test， LPM6690061 significantly improves cognitive impairments caused by Aβ. In the pre-pulse inhibition test， LPM6690061 significantly enhanced the pre-pulse inhibition rate in ADP rats. LPM6690061 increased the protein expression levels of P-AKT， P-CREB， and BDNF in the hippocampal region of AD rates， increased the number of neurons in the hippocampus， and significantly

alleviated the decrease in dendritic spine density caused by aggregated Aβ. These findings suggest that LPM6690061 can improve the synaptic plasticity affected by Aβ deposition through the AKT/CREB/BDNF pathway， thereby alleviating psychotic symptoms and improving cognitive impairments in ADP rats.

Keywords：" psychosis in Alzheimer’s disease; 5-HT2A receptor; BDNF; synaptic plasticity

（責任編輯 周雪瑩）