甘草-淫羊藿活性成分配伍抗肝癌復(fù)方納米膠束制備與評(píng)價(jià)

摘要： 基于晚期肝細(xì)胞癌（HCC）高侵襲性和對(duì)常規(guī)化療的固有耐藥性，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了共遞送中藥活性成分淫羊藿次苷Ⅱ（ICA Ⅱ）和甘草次酸（GA）的抗肝癌復(fù)方納米膠束。通過(guò)單因素及正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行處方和工藝優(yōu)化，在mPEG-PCL-Phe（Boc）為載體材料、ICA Ⅱ與GA質(zhì)量比4∶1、藥輔質(zhì)量比1∶9、水浴溫度45 ℃、水化體積4 mL的最佳工藝條件下制備出復(fù)方膠束。該復(fù)方聚合物膠束具有典型的核-殼結(jié)構(gòu)，粒徑為（22.30±0.19）nm，PDI為0.29±0.01，Zeta電位為（-0.94±0.67）mV，膠體穩(wěn)定性和生物相容性良好。在模擬正常生理?xiàng)l件（pH 7.4）下，可進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)10 d的緩慢釋放，符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)。與單藥膠束相比，復(fù)方膠束能顯著提高對(duì)人肝癌細(xì)胞的體外增殖抑制活性。顯示甘草-淫羊藿活性成分復(fù)方配伍遞送系統(tǒng)的抗肝癌潛力。

關(guān)鍵詞： 肝癌；中藥活性成分；淫羊藿次苷Ⅱ；甘草次酸；復(fù)方納米膠束

中圖分類(lèi)號(hào)： R944""""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）已成為全球癌癥死亡的第四大常見(jiàn)原因。然而，單一療法在臨床實(shí)踐中往往顯示出有限的治療效果^［1］。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，中藥及其活性成分配伍具有抗腫瘤副作用小、安全性高、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，作用于疾病發(fā)生發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)^［2-3］。因此，抗肝癌中藥活性成分的聯(lián)合遞送受到了廣泛的關(guān)注^［4］。

近年來(lái)，來(lái)自于淫羊藿黃酮化合物中的淫羊藿次苷Ⅱ（Icariside Ⅱ，ICA Ⅱ）展現(xiàn)出抗肝毒性、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松和改善糖尿病神經(jīng)病變的能力，其藥理作用在某些方面要優(yōu)于淫羊藿苷^［5］。尤其在抗肝癌方面，ICA Ⅱ可以靶向mTOR信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，還可誘導(dǎo)線粒體和溶酶體丟失參與的HepG2細(xì)胞凋亡^［6-7］。在淫羊藿的中藥方劑中常見(jiàn)甘草配伍使用，甘草常具有矯味、解毒、調(diào)和諸藥之功效，并且甘草中的活性成分甘草次酸（Glycyrrhetinic acid，GA）具有保肝和抗肝癌的作用。研究表明GA可以下調(diào)Bcl-2和Bcl-xl促凋亡通路，從而高效誘導(dǎo)HepG2的凋亡，與DOX聯(lián)合使用的新型前藥膠束中發(fā)揮了協(xié)同抗肝癌作用^［8-9］。然而，ICA Ⅱ和GA的水溶性差、生物利用低等問(wèn)題限制了其臨床使用。脂質(zhì)體、納米粒、聚合物膠束等可用于天然產(chǎn)物共遞送系統(tǒng)，其中，聚合物膠束在水性介質(zhì)中有著良好的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，能夠提高藥物的溶解度和穩(wěn)定性，膠束粒徑一般小于100 nm，可以有效避免RES的清除，并能通過(guò)EPR效應(yīng)實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向，實(shí)現(xiàn)在腫瘤部位的有效蓄積^［10］。因此，開(kāi)發(fā)一種共同遞送ICA Ⅱ和GA的復(fù)方聚合物納米膠束（CPMIG），可有效地將藥物遞送到腫瘤部位，解決ICA Ⅱ和GA的臨床應(yīng)用，有望實(shí)現(xiàn)其對(duì)肝癌的化療^［11］。

本研究以薄膜水化法制備復(fù)方膠束，通過(guò)對(duì)聚合物類(lèi)型、ICA Ⅱ與GA質(zhì)量比、藥輔質(zhì)量比、水浴溫度和水化體積進(jìn)行單因素和正交篩選，在最優(yōu)工藝條件下制備共遞送ICA Ⅱ和GA的復(fù)方納米膠束，并對(duì)其載藥量（DL）和包封率（EE）、外觀、粒徑、PDI和Zeta電位進(jìn)行基本的藥劑學(xué)表征，后續(xù)對(duì)其體外釋放和體外細(xì)胞毒活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀SB-2000（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；HPLC色譜儀（美國(guó)Waters公司）；IKA mini G 離心機(jī)（德國(guó)IKA公司）；JEM 1400 Plus透射電鏡（日本株式會(huì)社）；百特激光粒度儀（中國(guó)丹東百特儀器公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Carl Zeiss公司）。

1.2 試劑與細(xì)胞

淫羊藿次苷Ⅱ（西安信澤浩生物科技有限公司，純度≥ 98%）；甘草次酸（上海麥克林生化科技有限公司，純度≥ 97%）；mPEG2000-PCL1800、mPEG2000-PCL5000、mPEG2000-PCL2000（上海麗昂化學(xué)有限公司）；mPEG1000-PCL2000、mPEG2000-PDLLA2000、mPEG2000-PDLLA5000、mPEG2000-PLA1500（濟(jì)南代罡生物工程有限公司）；mPEG-PCL-Phe（Boc）（蘇州雷納藥物研發(fā)有限公司）；CCK8（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；其他化學(xué)試劑為分析級(jí)或色譜級(jí)；人肝癌細(xì)胞HepG2（上海弘順生物科技有限公司）。

1.3 復(fù)方膠束的制備方法

通過(guò)薄膜水化法制備復(fù)方聚合物膠束，其操作簡(jiǎn)單、可控性強(qiáng)。將一定量的輔料、ICA Ⅱ和GA超聲溶解，攪拌5 min后在水浴環(huán)境中通過(guò)旋蒸緩慢除去溶劑，在此過(guò)程中形成薄膜。再用生理鹽水進(jìn)行水化，過(guò)0.45 μm濾膜除去未包載的藥物，即得到膠束溶液。不含藥的空白膠束也用此法制備。

1.4 處方與工藝優(yōu)化

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)聚合物種類(lèi)、ICA Ⅱ與GA質(zhì)量比、藥輔質(zhì)量比、水浴溫度、水化體積進(jìn)行初步的工藝優(yōu)化，以DL和EE為指標(biāo)對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，在此基礎(chǔ)上選擇對(duì)膠束影響較大的處方因素（聚合物種類(lèi)、ICA Ⅱ與GA質(zhì)量比、藥輔質(zhì)量比），采用L8（4×2⁴）混合正交設(shè)計(jì)進(jìn)行處方優(yōu)化。

1.5 復(fù)方膠束的表征

1.5.1 HPLC色譜條件 Angilent TC-C18色譜柱（4.6 μm×150 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流動(dòng)相為乙腈∶0.1%甲酸水溶液（70∶30），檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm（ICA Ⅱ和GA均可檢出），進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min。

1.5.2 載藥量和包封率的測(cè)定 取100 μL膠束溶液，加900 μL乙腈超聲破乳，6000 r/min離心5 min，按照“1.5.1”項(xiàng)下條件測(cè)定藥物濃度。根據(jù)藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線得出藥物包封的質(zhì)量W包封，W膠束為載藥膠束質(zhì)量，W總投藥量為載藥膠束投藥總質(zhì)量，CPMIG的DL和EE計(jì)算公式為

DL=W包封W膠束×100%，

EE=W包封W總投藥量×100%。

1.5.3 膠束的外觀、粒徑、PDI和Zeta電位 新鮮制備的膠束溶液少量多次滴在銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸染色5 min，待自然晾干后置于透射電鏡中觀察膠束形態(tài)。吸取2 mL膠束溶液于石英比色皿中，用粒度儀（25 ℃，平衡時(shí)間120 s）對(duì)其粒徑、PDI、Zeta電位平行測(cè)定三次。

1.5.4 膠束的穩(wěn)定性考察

在37 ℃含10%胎牛血清的條件下研究不同時(shí)間間隔下膠束的粒徑變化，觀察膠束的膠體穩(wěn)定性。

1.6 復(fù)方膠束的體外釋放

采用透析法考察在磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（pH 7.4，0.5% 吐溫-80）中模擬藥物的釋放情況。取膠束溶液2 mL放入透析袋（3500 u）中，于37 ℃、70 r/min的定轉(zhuǎn)速條件下振蕩孵育，每次取樣500 μL后補(bǔ)充新鮮等體積釋放介質(zhì)，HPLC法測(cè)定ICA Ⅱ與GA的累計(jì)釋藥率。采用經(jīng)典的零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、Higuchi模型對(duì)體外釋藥行為進(jìn)行方程擬合，采用Ritger-Peppas方程擬合來(lái)判別藥物的釋放機(jī)制。

1.7 復(fù)方膠束的體外細(xì)胞毒評(píng)價(jià)

采用CCK8法測(cè)定人肝癌細(xì)胞HepG2的體外細(xì)胞毒性。將細(xì)胞按照1×10⁴個(gè)/孔的密度接種于96孔板中孵育24 h。之后進(jìn)行不同方式的給藥處理后孵育24 h。PBS洗滌細(xì)胞，再加入等量新培養(yǎng)基，然后每孔均分別加入10 μL CCK8，孵育2～4 h。以630 nm為參比波長(zhǎng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（A），按［（A實(shí)驗(yàn)孔－A空白孔）/（A對(duì)照孔－A空白孔）］×100%來(lái)計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均以重復(fù)測(cè)量的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示。數(shù)據(jù)分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS 20.0，Plt;0.05為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 單因素篩選

2.1.1 聚合物類(lèi)型 對(duì)表1中8種聚合物進(jìn)行篩選，分別用其作為輔料來(lái)制備CPMIG并測(cè)定DL和EE。結(jié)果顯示，不同的嵌段共聚物對(duì)ICA Ⅱ和GA的DL和EE的影響并沒(méi)有明顯差異，但對(duì)穩(wěn)定性的影響存在差異，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將暫時(shí)選擇穩(wěn)定性較好的mPEG-PCL-Phe（Boc）作為載體材料。而mPEG1000-PCL2000、mPEG2000-PDLLA5000、mPEG2000-PCL5000在制備過(guò)程中形成的薄膜較厚，造成無(wú)法水化。

2.1.2 ICA Ⅱ與GA質(zhì)量比 選擇mPEG-PCL-Phe（Boc）作為載體材料，對(duì)ICA Ⅱ與GA質(zhì)量比進(jìn)行篩選，結(jié)果如表2所示，隨著GA含量的增加，對(duì)GA的EE明顯降低，質(zhì)量比為2.5∶2.5時(shí)，對(duì)ICA Ⅱ和GA的DL總和也降低，質(zhì)量比為2∶3時(shí)，甚至無(wú)法水化，說(shuō)明聚合物無(wú)法包封更多的GA。因此，選擇質(zhì)量比為4∶1的ICA Ⅱ與GA能夠?qū)煞N藥物均實(shí)現(xiàn)最大的包封。

2.1.3 藥輔質(zhì)量比 在藥物總質(zhì)量（ICA Ⅱ+GA）為5 mg，且ICA Ⅱ與GA質(zhì)量比為4∶1時(shí)，篩選藥物與輔料mPEG-PCL-Phe（Boc）在不同質(zhì)量比下所制備復(fù)方膠束的DL和EE，結(jié)果如表3所示，隨著聚合物質(zhì)量的增加，ICA Ⅱ和GA的EE略微上升，1∶9時(shí)EE達(dá)到最高，繼續(xù)增加聚合物的質(zhì)量，DL下降，EE基本不變，因此藥輔質(zhì)量比在1∶9時(shí)就能對(duì)藥物實(shí)現(xiàn)良好的包封。

2.1.4 水浴溫度和水化體積

在聚合物為mPEG-PCL-Phe（Boc），ICA Ⅱ與GA質(zhì)量比4∶1，藥輔質(zhì)量比1∶9時(shí)，對(duì)水浴溫度和水化體積進(jìn)行篩選，結(jié)果如表4所示，分別在水浴溫度45 ℃和水化體積4 mL時(shí)，復(fù)方膠束的DL和EE達(dá)到最高。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

選擇聚合物種類(lèi)、ICA Ⅱ與GA質(zhì)量比、藥輔質(zhì)量比進(jìn)行正交優(yōu)化，選擇的水平如表5所示。測(cè)定所制備復(fù)方膠束的EE，并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行打分，以EE和穩(wěn)定性各占50%權(quán)重為綜合指標(biāo)進(jìn)行處方優(yōu)選。結(jié)果如表6所示，通過(guò)極差值的大小順序可知： B＞A＞C，即ICA Ⅱ與GA質(zhì)量比對(duì)結(jié)果的影響最大，聚合物種類(lèi)次之，藥輔質(zhì)量比影響最小。由此得出最佳工藝為A1B2C2，即：聚合物種類(lèi)為mPEG-PCL-Phe（Boc），ICA Ⅱ與GA質(zhì)量比4∶1，藥輔質(zhì)量比1∶9，水浴溫度45 ℃，水化體積4 mL。

2.3 復(fù)方膠束表征

如圖1所示，所制備的復(fù)方膠束呈淡黃色，有明顯的膠體特性，透射電鏡觀察到膠束外觀呈球形，大小均一，粒徑在20 nm左右。

如圖2所示，動(dòng)態(tài)光散射測(cè)得復(fù)方膠束粒徑為（22.30±0.19）nm，Zeta電位為（-0.94±0.67）mV，PDI為0.29±0.01。粒徑較小，滿足發(fā)揮EPR效應(yīng)被動(dòng)靶向到腫瘤環(huán)境的粒徑范圍，并且小粒徑的膠束可以延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，改善靶組織的滲透和積累，而復(fù)方膠束帶有的負(fù)電荷能夠避免在循環(huán)中被清除^［12］。通過(guò)HPLC測(cè)得CPMIG中ICA Ⅱ的DL和EE分別為（7.62±0.08）%和（95.25±1.00）%，GA的DL和EE分別為（1.81±0.03）%和（90.52±1.73）%。含10%FBS的膠束溶液粒徑在24 h內(nèi)基本維持不變（圖3），說(shuō)明納米膠束不會(huì)被體內(nèi)的各種蛋白所清除，能夠維持穩(wěn)定狀態(tài)。

2.4 體外釋放特征

通過(guò)檢測(cè)復(fù)方膠束在PBS（pH 7.4）中的釋藥

情況來(lái)模擬膠束在正常生理?xiàng)l件下的釋藥情況。如圖4所示，在相同釋放條件下游離藥物快速通過(guò)透析袋進(jìn)入釋放介質(zhì)中，ICA Ⅱ在48 h內(nèi)累計(jì)釋放度達(dá)到97%，而GA僅在12 h內(nèi)就達(dá)到了95%。與游離藥物的釋放相比，CPMIG中的ICA Ⅱ和GA表現(xiàn)出明顯的緩釋效果，但二者的釋放也存在明顯的差異。其中GA在48 h內(nèi)累計(jì)釋放度達(dá)到80%，而ICA Ⅱ僅接近40%，之后在長(zhǎng)達(dá)10 d的釋放中ICA Ⅱ的累計(jì)釋放度達(dá)到93%。

根據(jù)模型擬合結(jié)果（表7）可知，在First-order模型中兩種藥物的絕對(duì)系數(shù)（R²）最大，因此CPMIG中ICA Ⅱ和GA的釋放行為最符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。對(duì)于Ritger-Peppas模型，k作為釋放常數(shù)，是表征釋放機(jī)制的特征參數(shù)。當(dāng)k≤0.45時(shí)，釋放機(jī)制為菲克（Fick）擴(kuò)散；當(dāng)0.45＜k＜0.89時(shí)，釋放機(jī)制為藥物擴(kuò)散和骨架溶蝕的共同作用；當(dāng)k≥0.89時(shí)，釋放機(jī)制為骨架溶蝕。其中GA的k為0.398 3，ICA Ⅱ的k為0.749 8，由此可知GA的釋放屬于Fick擴(kuò)散，濃度差是其主要釋放動(dòng)力，因此在48 h內(nèi)累計(jì)釋放度達(dá)到80%。而ICA Ⅱ的釋放屬于藥物擴(kuò)散和骨架溶蝕的共同作用，聚合物載體對(duì)其具有一定的束縛力，ICA Ⅱ的釋放不僅依靠濃度差，還依靠膠束骨架溶蝕后才能得以釋放，因此導(dǎo)致了ICA Ⅱ進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)10 d的緩慢釋放^［13］。

2.5 體外細(xì)胞毒活性

載體材料無(wú)毒無(wú)害是保障載藥膠束在體內(nèi)發(fā)揮作用的前提，本研究采用HepG2細(xì)胞評(píng)價(jià)空白膠束的體外細(xì)胞毒性，其中空白膠束細(xì)胞的增殖抑制作用如圖5（a），可知空白膠束的毒性很小，不同質(zhì)量濃度組的存活率都超過(guò)80%，說(shuō)明所選擇的兩嵌段共聚物具有良好的生物兼容性和安全性。各制劑組對(duì)HepG2細(xì)胞的體外增殖毒性如圖5（b），

游離藥物和載藥膠束都能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且抑制程度呈濃度依賴(lài)性。以半數(shù)抑制濃度（IC50）作為活性指標(biāo)，如圖6，相比游離藥物，制備成膠束后其IC50顯著降低，展現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤活性。另外，與單藥膠束相比，尤其與Micelles@ICA Ⅱ膠束相比，CPMIG的IC50顯著降低，這說(shuō)明ICA Ⅱ和GA聯(lián)合使用可顯著增強(qiáng)抗腫瘤活性。

3 結(jié) 論

針對(duì)肝癌單一治療的缺陷以及ICA Ⅱ和GA在抗肝癌方面的廣泛應(yīng)用，本研究設(shè)計(jì)了一種可以共

遞送ICA Ⅱ和GA的復(fù)方納米膠束，在解決兩種藥物溶解性差、臨床應(yīng)用難等問(wèn)題的同時(shí)，旨在通過(guò)被動(dòng)靶向?qū)⑺幬镞f送到腫瘤部位，實(shí)現(xiàn)肝癌的靶向化療。結(jié)果顯示，制備的復(fù)方膠束擁有較小的粒徑，可以滿足被動(dòng)靶向的要求，良好的穩(wěn)定性保證了膠束抗腫瘤作用的發(fā)揮。體外釋放特征說(shuō)明復(fù)方膠束以一級(jí)動(dòng)力學(xué)可以進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)10 d的緩慢釋放。此外，復(fù)方膠束對(duì)HepG2細(xì)胞有著明顯體外細(xì)胞毒活性，值得注意的是，兩種藥物的聯(lián)合使用顯著增強(qiáng)了細(xì)胞毒活性。綜上，本研究為中藥活性成分聯(lián)合遞送治療肝癌提供了理論支持。

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Preparation and Evaluation of Compound Anti-hepatocellular Carcinoma Nanomicelles Formulated with Licorice-Epimedium Active Ingredients

HAO Teng¹， ZHAO Fengdong¹， SUN Zheng¹， LI Yanli^{1， 2}， XU Kexin¹， ZHAO Feng¹，

CHEN Daquan¹， XU Hui¹

（1.School of Pharmacy， Yantai University， Yantai 264005， China; 2. Binzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine（Affiliated Chinese Medicine Hospital of Binzhou Medical University）， Binzhou 256601， China）

Abstract：" Based on the high invasiveness of advanced hepatocellular carcinoma （HCC） and its inherent resistance to conventional chemotherapy， an anti-hepatocellular carcinoma compound nanomicelle was designed and developed to co-deliver the active components of traditional Chinese medicine， icariside Ⅱ （ICA Ⅱ） and glycyrrhetinic acid （GA）. Formulation and process optimization were conducted through single-factor and orthogonal experimental designs， resulting in the preparation of complex micelles with mPEG-PCL-Phe （Boc） as the carrier material， an ICA Ⅱ-to-GA mass ratio of 4∶1， drug-accompanying mass ratio of 1∶9， and hydration volume of 4 mL at a water bath temperature of 45 ℃. The prepared micelles exhibited a typical core-shell structure， with a particle size of （22.30 ± 0.19） nm， PDI of 0.29 ± 0.01， and Zeta potential of（-0.94 ± 0.67） mV， indicating good colloidal stability and biocompatibility. Under simulated physiological conditions （pH 7.4）， they can release drugs slowly for up to 10 days， following first-order kinetics. Compared with single drug loaded micelles， the compound micelles significantly enhanced the in vitro proliferation inhibition activity against human liver cancer cells， demonstrating the anti-hepatocarcinoma potential of the licorice-epimedium active ingredient compound compatibility delivery system.

Keywords：" hepatocellular carcinoma; Chinese medicine active ingredient; icariside Ⅱ; glycyrrhetinic acid; compound nanomicelle

（責(zé)任編輯 周雪瑩）