miR-539抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移的作用機(jī)制分析

孫煜曦,鄧英姿,張美玲,張運(yùn)峰,許 可,胡 芬

(1.華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 唐山 063210;2.唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系,河北 唐山 063000)

乳腺癌(Breast cancer)是女性多發(fā)惡性腫瘤之一,晚期癌細(xì)胞會(huì)隨著淋巴管和血管向遠(yuǎn)端肝臟、腦、肺臟、骨組織轉(zhuǎn)移,且轉(zhuǎn)移過程是一個(gè)多基因參與調(diào)控的復(fù)雜過程[1]。已有文獻(xiàn)報(bào)道轉(zhuǎn)化生長因子β[2]、E-鈣黏蛋白[3],基質(zhì)金屬蛋白酶[4]等多個(gè)基因與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。目前,乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制已經(jīng)有所了解,但仍有許多問題尚未解決。

microRNAs是一類長度約為19～25個(gè)核苷酸長度的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA,其與靶基因的mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)序列結(jié)合,抑制靶mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解,從而通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)生命活動(dòng)的調(diào)控[5]。miR-539在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中有著重要的功能,在前列腺癌中miR-539通過調(diào)節(jié)SPAG5的表達(dá)抑制其發(fā)展[6],在肝癌發(fā)生中miR-539通過靶向下調(diào)E2F3蛋白水平達(dá)到抑制癌細(xì)胞的增殖[7],miR-539還抑制非小細(xì)胞肺癌[8]細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

本研究通過檢測miR-539在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá),分析其對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響,并進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析其靶基因集合和信號(hào)通路及其在乳腺癌組織和正常組織間的表達(dá)差異,為深入研究miR-539在乳腺癌細(xì)胞發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)集分析miR-539在乳腺癌中的臨床意義

采用TCGA數(shù)據(jù)在線分析工具(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/miR_path/index),獲得miR-539的表達(dá)譜。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

ZR-75-30、MDA-MB-231、T-47D和MCF-7乳腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 總RNA的提取和定量PCR

四種乳腺癌細(xì)胞總RNA的抽提和定量PCR參照胡芬等[9]的方法進(jìn)行。

miR-539的檢測引物如下:5′-GGAGAAAT TATCCTTGGTGTGT-3′(上游引物),5′-GTG CAGGGTCCGAGGT-3′(下游引物)。U6為內(nèi)參基因,U6的檢測引物如下:5′-CTCGCTTCG GCAGCACATA-3′(上游引物),5′-CGAATTT GCGTGTCATCCT-3′(下游引物)。

1.4 遷移實(shí)驗(yàn)

以7×104個(gè)MCF-7細(xì)胞/孔的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%的時(shí)候,將miR-539 mimics、Negative Control、miR-539 inhibitor和microRNA inhibitor N.C(上海吉瑪生物有限公司)轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞,轉(zhuǎn)染和遷移實(shí)驗(yàn)參照胡芬等[9]的方法進(jìn)行。

1.5 miR-539保守性分析

利用miRBase數(shù)據(jù)庫下載Homosapiens(人)、Canisfamiliaris(家犬)、Equuscaballus(馬)、Bostaurus(牛)、Macacamulatta(獼猴)、Musmusculus(小鼠)、Ovisaries(綿羊)、Pantroglodytes(黑猩猩)、Pongopygmaeus(猩猩)、Rattusnorvegicus(大鼠)10個(gè)物種的miR-539的成熟序列。采用MEGA7.0軟件分析其保守性。

1.6 miR-539靶基因的預(yù)測

應(yīng)用TargetScan7.1、RNA22-HSA及MIRDB靶基因預(yù)測軟件對(duì)miR-539進(jìn)行靶基因預(yù)測,取三者預(yù)測數(shù)據(jù)的交集再結(jié)合miTarbase中已經(jīng)證實(shí)的靶基因形成靶基因集合用于后續(xù)分析。

1.7 KEGG分析

用KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-539靶基因集合進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析。

1.8 GEPIA分析靶基因集合在乳腺癌和正常組織中表達(dá)差異

采用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析miR-539靶基因集合在浸潤性乳腺癌和正常乳腺組織中的表達(dá)差異。

2 結(jié)果

2.1 miR-539在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

圖1 qPCR檢測乳腺癌細(xì)胞系中miR-539的表達(dá)

定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-539在ZR-75-30、MDA-MB-231、MCF-7和T-47D四種乳腺癌細(xì)胞中均有表達(dá),且在ZR-75-30細(xì)胞中表達(dá)量最高,在其它三種細(xì)胞的表達(dá)量相對(duì)較低(見圖1)。

2.2 miR-539抑制MCF-7遷移

Transwell結(jié)果表明,在MCF-7細(xì)胞中,相對(duì)于對(duì)照組,過表達(dá)miR-539-mimics顯著地抑制MCF-7遷移,過表達(dá)miR-539 inhibitor則促進(jìn)MCF-7遷移(圖2)。

圖2 miR-539抑制MCF-7細(xì)胞遷移

2.3 miR-539的保守性分析

利用miRBase數(shù)據(jù)庫下載了10個(gè)物種的miR-539的成熟序列,利用MEGA7.0軟件分析其保守性,結(jié)果如圖3所示。miR-539的成熟序列均是22個(gè)堿基,且堿基基本完全一致(綿羊和馬除外),miR-539成熟序列在脊椎動(dòng)物中具有高度的保守性。

2.4 miR-539的靶基因預(yù)測

采用TargetScan7.1、RNA22-HSA及MIRDB預(yù)測了miR-539靶基因,數(shù)量分別為6268、4674、547個(gè),對(duì)3種預(yù)測方法的結(jié)果數(shù)據(jù)取交集后共獲得172個(gè)靶基因。miTarbase數(shù)據(jù)庫中記錄的經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、western blot和qPCR方法證實(shí)的miR-539靶基因共有2個(gè)(Twist1和ZEB1),合計(jì)共獲得174個(gè)靶基因用于后續(xù)的基因注釋和通路富集分析(見圖4)。

2.5 miR-539的預(yù)測靶基因的KEGG分析

miRNA的眾多靶基因通常情況下會(huì)協(xié)同調(diào)控細(xì)胞信號(hào)通路。為了深入了解分析miR-539預(yù)測的靶基因和集中的174個(gè)基因,本研究采用KEGG經(jīng)典通路數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-539的靶基因集合進(jìn)行了信號(hào)通路富集分析。表1結(jié)果表明,miR-539的靶基因顯著富集于RNA降解、雌激素信號(hào)通路等信號(hào)通路(P<0.01)。

表1 miR-539靶基因集合的KEGG富集分析

2.6 miR-539靶基因集合在乳腺癌中表達(dá)差異分析

GEPIA可用于分析來自TCGA和GTEx的9 736個(gè)腫瘤和8 587個(gè)正常樣本的RNA測序表達(dá)數(shù)據(jù)[10]。本研究利用GEPIA分析了miR-539靶基因集合在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達(dá),其中28個(gè)靶基因在乳腺癌中低表達(dá)(見圖5A),14個(gè)靶基因在乳腺癌中高表達(dá)(見圖5B),這42個(gè)基因可能與乳腺癌發(fā)生密切相關(guān)。

圖5 GEPIA分析miR-539靶基因集合在乳腺癌和正常組織中的表達(dá)。相對(duì)于乳腺正常組織,在乳腺癌組織低表達(dá)的基因(A)和高表達(dá)的基因(B)

3 討論

miR-539定位在人的14號(hào)染色體,已有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-539在前列腺癌[6]、肝癌[7]、非小細(xì)胞肺癌[8]的發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮著重要的作用。本研究檢測了miR-539在4種乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá),并且遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明miR-539抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移,表明miR-539可能具有抑制乳腺癌發(fā)生的作用。

microRNAs發(fā)揮功能是通過調(diào)控靶基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的,因此,找到microRNA的靶基因非常重要,但是microRNAs的靶基因?qū)ふ覅s非易事[11]。本研究通過多種生物學(xué)軟件對(duì)miR-539的靶基因進(jìn)行了預(yù)測,共獲得174個(gè)靶基因,且這些基因主要參與細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程,為miR-539的功能研究提供了基礎(chǔ)。

乳腺癌分為激素依賴型和非激素依賴型,在激素依賴型乳腺癌細(xì)胞中,雌激素通過雌激素受體促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖,進(jìn)而促進(jìn)雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞的生長[12],本研究通過對(duì)miR-539的靶基因集合進(jìn)行了KEGG信號(hào)通路分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-539主要富集在雌激素信號(hào)通路,由此推測miR-539的功能與乳腺癌發(fā)生密切相關(guān)。

通過分析174個(gè)靶基因在TCGA和GTEx樣本中轉(zhuǎn)錄過程發(fā)現(xiàn),與正常組織相比,乳腺癌組織中的GBRC5B、MAP1B等28個(gè)基因低表達(dá),HNRNPF、TMEM等14個(gè)基因高表達(dá)基因,縮小了乳腺癌發(fā)生過程中miR-539的調(diào)控靶基因的范圍,為闡明miR-539在乳腺癌發(fā)生中調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。