大片吸蟲磷酸丙糖異構酶基因的克隆表達和免疫原性分析

姚文浩，吳興隆，秦志博，李文豪，朱惠麗，王磊，胡建和，韓艷輝

(河南科技學院，河南 新鄉 453003)

片形吸蟲病是大片吸蟲(Fasciolagigantica)和肝片吸蟲(Fasciolahepatica)寄生于反芻動物和人的肝臟、膽管中引起的一種人獸共患寄生蟲病[1-2]。片形吸蟲病是一種食源性寄生蟲病，人類是偶感宿主，通過飲用受污染的水或水生植物而感染。該病影響全球超過75個國家的240萬人，感染了全球數百萬反芻動物，每年造成超過30億美元的經濟損失[3]。近年來，農田灌溉面積擴大、濕地改造等人為活動使片形吸蟲病的感染率呈上升趨勢[4]，世界衛生組織將其歸類為一種被忽視的熱帶疾病[5]。目前，三氯苯達唑(TCBZ)是治療片形吸蟲病的首選藥物，然而過度使用會導致耐藥性的產生，荷蘭、智利、土耳其和秘魯等地均出現了抗TCBZ蟲株，這對該病的預防和控制產生了巨大影響[6]，開發新的抗片形吸蟲病疫苗候選分子迫在眉睫。

大片吸蟲主要依賴糖酵解獲取能源賴以生存[7]，而磷酸丙糖異構酶(TPI)是糖酵解過程中必不可少的酶，它可以將磷酸二羥丙酮轉化為3-磷酸甘油醛[8]。TPI作為糖酵解的關鍵酶，廣泛存在于各類生物中，科學家已從多種生物體中克隆并成功表達出該基因[9]。有研究顯示，TPI可用于開發藥物或疫苗，不僅用于克服華支睪吸蟲病，還包括其他人畜共患的蠕蟲病[10]。目前，對大片吸蟲TPI(FgTPI)的研究微乎其微。本試驗以大片吸蟲的TPI為研究對象，對該基因的生物學特性進行了初步分析，為評價其作為抗大片吸蟲病疫苗候選分子的潛在能力，以及深入研究FgTPI的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種、質粒、實驗動物

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、表達質粒pET-28a(+)和大片吸蟲cDNA模板均由河南科技學院動物科技學院實驗室保存；6周齡SPF級BALB/c雄性小鼠購自河南斯克貝斯生物有限公司。

1.2 主要試劑和酶

DNA凝膠回收試劑盒(離心柱型)、高純度質粒DNA小提試劑盒(離心柱型)、限制性核酸內切酶BamHⅠ、XhoⅠ、pMD19-T載體、T4 DNA連接酶、DNA標志物均購自TaKaRa生物工程(大連)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自北京全式金生物技術有限公司；Ni Sepharose excel購自美國General Electric公司。酶活性測定試劑均購自北京索萊寶科技有限公司。

M.DNA分子質量標準；1.FgTPI PCR產物。

1.3 引物的設計與合成

參照NCBI收錄的肝片吸蟲基因(No.KC164346.1)核苷酸序列，通過軟件設計含有限制性酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ的引物，引物由TaKaRa生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 目的基因的克隆

以大片吸蟲的cDNA為模板，進行PCR擴增。95 ℃預變性5 min；95 ℃ 50 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。凝膠電泳鑒定并回收目的片段。目的片段與pMD19-T連接過夜，按照轉化說明書將連接產物轉化入DH5α感受態細胞中，培養過夜，挑取單克隆，PCR鑒定并測序。

1.5 FgTPI基因的序列測定及生物信息學分析

對鑒定正確的質粒進行生物信息學分析。用BLAST軟件進行基因序列分析，并進行序列相似性比較。運用在線網站(https://web.expasy.org/protscale/)對FgTPI蛋白序列進行親疏水性分析，并在網站(https://web.expasy.org/protparam/)上進行參數分析，最后利用在線網站(https://www.swissmodel.expasy.org/)預測其三級結構。運用DNAStar軟件分析FgTPI的蛋白分子量和理論等電點(PI)。

1.6 重組質粒FgTPI-pET-28a(+)的構建

對1.4中的測序正確樣品提取質粒，并進行雙酶切，并與雙酶切的pET-28a(+)質粒16 ℃連接過夜，構建重組表達質粒FgTPI-pET-28a(+)。

1.7 重組質粒在大腸桿菌中的表達與表達產物的純化

按照轉化說明書將1.6中的連接產物轉化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，經PCR擴增、酶切及測序鑒定正確后，大量擴增，并進行誘導表達。獲得可溶性重組蛋白rFgTPI，用 Ni Sepharose excel 進行蛋白的純化，SDS-PAGE驗證純化效果。

1.8 動物免疫與免疫血清制備

選擇6周齡SPF級BALB/c小鼠30只，隨機分成3組，分別為免疫組(FgTPI-Adjuvant)、佐劑對照組(206-Adjuvant)和空白對照組(PBS)。免疫組每次每只注射100 μL含206佐劑和20 μg純化的重組蛋白rFgTPI的乳化劑；佐劑對照組每次每只注射100 μL 含206佐劑和PBS的乳化劑；空白對照組每次每只注射100 μL的PBS。3組均腹腔注射，每隔1周免疫1次，共免疫3次。小鼠免疫之前(陰性血清)以及每次免疫之后1周采血，分離并收集血清，備用。

1.9 重組蛋白的Western blot分析

將10 μg重組蛋白rFgTPI進行SDS-PAGE，后轉移至硝酸纖維素膜上，加入0.5%的PBST-脫脂奶粉，4 ℃封閉過夜。隨后分別與感染大片吸蟲羊的血清(1∶500)、未感染的陰性血清(1∶500)共孵育，室溫靜置2 h，PBST洗滌3次，與兔抗羊IgG-HRP(1∶2 000)室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，用自動化學發光圖像分析系統進行成像分析。

1.10 ELISA檢測特異性IgG抗體水平

以純化的重組蛋白rFgTPI為抗原包被ELISA板，以1.8中制備的免疫血清為一抗，檢測3組小鼠免疫前后血清中抗rFgTPI特異性抗體IgG的效價變化。以包被緩沖液稀釋抗原濃度至10 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃ 過夜。用PBST洗滌3次后，每孔加入150 μL PBST-1.5%牛血清白蛋白進行封閉，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌3次，每孔加入100 μL被檢血清(1∶100)，37 ℃孵育2 h。PBST洗滌3次，加入羊抗小鼠IgG-HRP(1∶1 000)37 ℃孵育1 h。PBST洗滌3次，然后加入可溶性TMB底物100 μL，避光顯色5 min，加入2 mol/L H2SO4(50 μL/孔)終止反應，用BioTek公司的酶標儀測定450 nm處的吸光值。

1.11 重組蛋白的酶活性分析

采用α-磷酸甘油脫氫酶偶聯法對該重組蛋白進行酶活性研究[11]，偶聯反應式如下：

反應的溶液為TE緩沖液(100 mmol/L三乙醇胺，10 mmol/L EDTA)添加0.2 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，0.9個單位的α-磷酸甘油脫氫酶(α-GDH)和1 mmol/L D型甘油醛-3-磷酸(GAP)。加入5 ng/mL的FgTPI開始反應。以質粒pET-28a(+)作為陰性對照。

1.11.1 pH值對酶活性的影響

調節反應體系pH值依次為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。分別測定上述反應體系在各個pH條件下3 min內340 nm處吸光度的變化情況。

1.11.2 溫度對酶活性的影響

選用20、25、30、35、40、45和50 ℃共7個溫度點，分別測定上述反應體系在各溫度條件下3 min內340 nm處吸光度的變化情況。

1.11.3 動力學參數測定

反應混合物的最終體積為1 mL的TE緩沖液，含有GAP(1 mmol/L)、NADH(0.2 mmol/L)、0.9單位的α-GDH和5 ng/mL的FgTPI。通過在最佳溫度和最佳pH值下改變GAP濃度 (0～3 mmol/L)，測量初始速度，然后采用雙倒數法作圖，確定GAP的米氏常數和最大反應速度。

2 結果

2.1 FgTPI基因擴增

PCR克隆基因FgTPI，DNA凝膠電泳顯示，在762 bp處可見明顯片段(圖1)。

2.2 相似物種TPI的BLAST分析

選擇分別來自肝片吸蟲(Fasciolahepatica，簡稱FhTPI)253 aa (GenBank：AGJ83762.1)，捻轉血矛線蟲(Haemonchuscontortus，簡稱HcTPI)247 aa(GenBank：ADR66027.1)，日本血吸蟲(Schistosomajaponicum,簡稱SjTPI)252 aa(GenBank:AAC47855.1),曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni,簡稱SmTPI)252 aa(GenBank:XP_018647623.1),馬來絲蟲(Brugiamalayi,簡稱BmTPI) 247 aa (GenBank:XP_001897269.1)，秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans，簡稱CelTPI)247 aa(GenBank：NP_001366651.1)和人(Homosapiens，簡稱HsTPI)249 aa(GenBank：AAH17917.1)7個物種的TPI與所得大片吸蟲的TPI序列進行比對，結果顯示FgTPI編碼的氨基酸序列與其他物種TPI基因相似性分別為99.60%(肝片吸蟲)、68.25%(人)、67.86%(血吸蟲)。用DNAStar軟件將該ORF所編碼的氨基酸序列與上述GenBank中已經公布的其他物種的TPI氨基酸序列進行分析，發現該序列含有TPI活性功能位點序列AYEPVWAIGTG(圖2)。

A.二級結構與B細胞抗原表位分析；B.疏水性分析；C.三級結構預測。

2.3 FgTPI基因編碼蛋白的分析

FgTPI基因開放閱讀框為762 bp，編碼253個氨基酸，如圖3A所示。分析FgTPI的二級結構，發現該蛋白以α螺旋為主，分別位于24～32、51～63、81～85、105～121、127～161、185～198、216～228、240～247；β折疊相對α螺旋較少，主要位于37～50、90～95、99～104、116～126、162～174、203～211；β轉角區較少；較長的無規則卷曲分別位于13～19、176～181。結合柔性區域和表面可及性的預測結果表明，FgTPI蛋白主要含有6個線性B細胞抗原表位，分別位于氨基酸序列的第3～5、16～20、86～88、178～184、229～231、250～253位。此外，對目的蛋白親疏水性(圖3B)以及三級結構預測(圖3C)均進行了分析。

DNAStar分析顯示,該蛋白分子量為27 794.81 Da,理論等電點pI為8.07。

2.4 重組質粒FgTPI-pET-28a(+)的鑒定

重組質粒FgTPI-pET-28a(+)酶切鑒定分別能得到762 bp的目的基因和相應大小的重組質粒片段，說明該重組質粒構建成功 (圖4)。

M.DNA標準分子量DL2000；1.BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切FgTPI-pET-28a(+)質粒；2.未酶切的FgTPI-pET-28a(+)質粒。

M.蛋白分子量標準；1.未純化的 rFgTPI；2.純化后的rFgTPI。

2.5 rFgTPI純化

大量擴增的重組菌菌液OD600值為0.6～0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，30 ℃誘導6 h，此時上清液表達量最高。菌液12 000 r/min離心20 min，收取上清液，用Ni Sepharose excel純化柱進行蛋白純化。SDS-PAGE分析表明，在上清液中收集到了重組蛋白 rFgTPI(圖5)。

2.6 重組蛋白的Western blot分析

將重組蛋白進行SDS-PAGE之后進行Western blot分析，結果顯示，用感染大片吸蟲的羊血清作為一抗時，32 kDa處有一明顯的識別條帶，而陰性對照組在32 kDa處未有條帶出現，表明重組蛋白具有良好的免疫反應性(圖6)。

M.蛋白分子量標準；1.一抗為大片吸蟲感染羊的血清；2.一抗為陰性血清。

2.7 小鼠血清抗rFgTPI蛋白特異性抗體的檢測

ELISA檢測3組小鼠免疫前后血清中抗體IgG的效價變化。結果顯示，重組蛋白一免、二免、三免后特異性抗體水平較206佐劑組和空白對照組顯著升高(P<0.01)，在三免后其抗體水平達到最大值；而佐劑對照組和空白對照組血清中抗rFgTPI的特異性IgG抗體水平均未出現明顯變化(圖7)。

圖7 ELISA檢測小鼠抗rFgTPI特異性IgG抗體水平

2.8 酶活性的測定

采用α-磷酸甘油脫氫酶偶聯法對rFgTPI進行酶活性的測定，并進一步研究了pH值和溫度對其活性的影響。結果顯示(圖8)，重組蛋白rFgTPI具有一定的TPI活性，其酶促反應最佳pH值為7.5，最佳溫度為35 ℃；pET-28a(+)空載體蛋白不具有TPI活性。

圖8 pH值(a)和溫度(b)對TPI酶活性的影響

酶促反應動力學結果顯示，米氏常數和最大反應速度分別為(0.57±0.1)mmol/L和3 102.4 mmol/(min·L)。

3 討論

隨著現代社會的進步，人們對糧食的需求不斷提高，綠色食品、人與自然和諧共存的概念已成為當今時代的主流，因此，大片吸蟲病作為一種重要的食源性疾病引起了人們的廣泛關注[12]。吸蟲感染是許多發展中國家人類殘疾和死亡的主要原因，并且仍然是 21 世紀醫學面臨的最重要挑戰之一[7]。診斷片形吸蟲病有2種常見的方法：一種是依賴于被屠宰動物肝組織中成蟲的宏觀鑒定，另一種是基于糞便樣本中寄生蟲蟲卵的顯微鏡檢測。然而，這2種方法準確性較低且具有一定的缺點：第1種方法局限性在于不能應用于人類疾病的檢測；第2種方法的缺點在于直到感染晚期才能檢測到蟲卵，而且蟲卵會間歇性地從膽管中分泌出來[13]。近年來，與糞便標本的常規顯微鏡檢查相比，免疫學技術變得更加敏感和特異，并且更受青睞[14]。TCBZ為苯并咪唑類中專用于治療片形吸蟲病的藥物，對片形吸蟲有明顯驅殺效果，對牛和鹿大片吸蟲病等均有效[15]。然而，TCBZ耐藥性蟲株的出現給本病的防治帶來了極大困難，因此，對單一藥物治療大片吸蟲病的依賴性是該病未來面臨的嚴峻挑戰。尋求抗大片吸蟲病候選疫苗成為一種新的治療方法。

TPI是糖酵解途徑中的一種關鍵酶，幾乎存在于所有類型的細胞中[16]。在高等動物中缺乏TPI酶可能會引起溶血性貧血，嚴重的甚至會導致生物個體死亡。目前，在生物體內，TPI的酶學活性沒有其他酶類可以替代。TPI屬于較古老的一類酶家族，其在真核原核分化之前就已經形成[17]。本文成功地克隆了FgTPI基因，并且重組質粒FgTPI-pET-28a(+)在大腸桿菌中呈現可溶性表達。運用BLAST對比，FgTPI與肝片吸蟲TPI的基因相似度高達99.60%。生物信息學分析顯示，該重組蛋白B細胞抗原表位較多，表達的分子量為27 794.81 Da，理論等電點pI為8.07。TPI的酶活性位點附近的殘基序列具有很高的保守性，目前已知的TPI都具有高度保守的序列特征[17]。生物信息學分析發現，FgTPI活性功能位點序列為AYEPVWAIGTG。

目前，TPI在血吸蟲的研究中較為深入，被WHO/TDR推薦為曼氏血吸蟲病的6種候選抗原基因之一[18]。Shomemaker等[19]從曼氏血吸蟲中分離出一段與TPI序列同源的全長cDNA，并在大腸桿菌中表達了SmTPI，通過免疫親和純化可溶性表達產物，又進一步證明該表達產物具有TPI活性，且能被具有免疫保護作用的單克隆抗體(McAb)M.1所識別，說明SmTPI是非常有前景的血吸蟲候選疫苗。此外，日本血吸蟲TPI已經被成功地克隆并表達。Dai等[20]和Zhu等[21]克隆并優化了日本血吸蟲磷酸丙糖異構酶(SjTPI)的密碼子，同時構建了不同類型的疫苗，包括DNA疫苗(pcDNA3.1-SjTPI、pcDNA3.1-SjTPI.opt)、重組蛋白疫苗(rSjTPI)和重組腺病毒疫苗(rAdV-SjTPI.opt)，均誘導了很好的減蟲率和減卵率。本試驗Western blot結果顯示，重組抗原 rFgTPI 具有較好的抗原性；ELISA結果指出，與佐劑對照組和空白對照組相比，rFgTPI誘導小鼠產生了較高水平的特異性IgG抗體，推測重組蛋白在宿主體內可以誘導一定的免疫保護效果，為以后的動物免疫保護試驗及DNA疫苗的制備提供依據。

TPI可以催化3-磷酸甘油醛與二羥丙酮磷酸之間的可逆反應，這一轉換過程存在于幾乎所有包括三糖磷酸脂代謝途徑中，如糖酵解、糖異生、磷酸戊糖途徑及脂肪酸的生物合成等[22]。關于TPI的酶活性分析，α-磷酸甘油脫氫酶偶聯法是常用的一種研究該酶活性的方法，本試驗運用此方法對rFgTPI進行了酶活性測定，結果顯示，FgTPI酶活性測定的最佳反應條件為pH=7.5、溫度35 ℃，而陰性對照pET-28a(+)并未顯示有TPI的活性；酶促反應動力學分析顯示，米氏常數和最大反應速度分別為(0.57±0.1)mmol/L和3 102.4 mmol/(min·L)。本試驗結果與之前報道的其他物種TPI的酶活性分析有一定的相似性，例如，肝片吸蟲TPI(pH =7.6，37 ℃)[23]，日本血吸蟲TPI (pH=7.5，37 ℃)[24]，賈第蟲TPI (pH=7.4，25 ℃)[25]，豬帶絳蟲TPI (pH=7.5，25 ℃)[26]和尖孢鐮刀菌TPI (pH=8.0，37 ℃)[27]。

綜上所述，本文成功克隆表達了FgTPI，并對其抗原性進行了初步分析，為深入研究rFgTPI 的生物學功能及評價其作為大片吸蟲病疫苗候選的潛力奠定基礎。