紫花苜蓿MsHB1基因的克隆及表達分析

李家興,周麗瑩,苑 峰,劉亞玲,欒雅琳,晁躍輝*

(1.北京林業大學草業與草原學院,北京 100083; 2.北京理工大學生命學院,北京 100081;3.內蒙古草業技術創新中心有限公司,內蒙古 呼和浩特 010010)

HB1基因屬于同源異性盒(Homeobox,HB)蛋白家族,它含有典型的HD-Zip轉錄因子結構,由同源異型域(Homeodomain,HD)與亮氨酸拉鏈(Leucine Zipper,LZ)結構域共同構成。它們之間形成的穩定空間結構及兩者之間的相互作用共同決定了該類蛋白作為轉錄因子的功能,如DNA結合特異性、信號傳導、生物和非生物脅迫的調控誘導等[1-2]。Sessa等[3]通過HD-Zip蛋白與DNA結合的方法,從擬南芥(Arabidopsisthaliana)中分離了第一個HD-Zip I亞族轉錄因子AtHB1,發現其主要參與植物葉片發育及植物對脅迫的應答。隨后,HB1基因在向日葵(Helianthusannuus)[4]、棉花(Gossypiumspp)[5]、玉米(Zeamays)[6]、大麥(Hordeumvulgare)[7]、黃花苜蓿(Medicagofalcata)[8]等多種植物中相繼被發現并開展了相關的研究。向日葵在低溫的條件下誘導并積累HaHB1蛋白質,通過提高細胞膜穩定性來抵御低溫脅迫[4]。在干旱、鹽脅迫條件下,棉花通過提高GhHB1基因的表達,參與ABA生物合成,提高了植物ABA含量,進而增強了植物對干旱和高鹽的抵抗能力[5]。HB1轉錄因子可以抑制轉基因蒺藜苜蓿的發育,通過減少根系表面暴露進而提高植物耐鹽性[9]。而紫花苜蓿研究發現,紫花苜蓿MsHB7基因能夠通過降低ABA響應基因(MsABI1和MsSnRK2.6)和抗氧化酶編碼基因(MspxdC和MsCatalase4)的表達,進而降低紫花苜蓿耐鹽性[10]。

作為一種優質的豆科牧草植物,紫花苜蓿營養價值豐富,粗蛋白含量高,含有多種維生素和微量元素等,適合作為飼料喂養家畜,增加畜產品產量[11-12]。現在土地季節性干旱、土壤中鹽堿含量過高等問題嚴重限制了紫花苜蓿的種植,影響了紫花苜蓿的產量和品質[13-14]。因此,深入探索并發掘抗逆響應基因、通過轉基因技術獲得高抗逆能力的紫花苜蓿新品系,已成為紫花苜蓿分子育種的一個重要途徑。植物激素脫落酸是植物響應脅迫信號轉導的主要成員,對植物生長發育的多個環節起到調節作用,如抑制生長和抵抗逆境等方面[15]。楊躍霞等[16]研究證明了外源ABA可以增強紫花苜蓿耐鹽性。同時,李波等[17]研究發現在鹽脅迫的條件下,通過外施ABA可以降低紫花苜蓿幼苗的ROS積累,提高抗氧化酶活性。魏天嬌等[18]發現ABA積累能夠誘導鹽脅迫相關基因的表達,從而提高紫花苜蓿對鹽堿脅迫的耐受性。王英哲等[19]研究發現,通過外施ABA可以提高紫花苜蓿幼苗體內的可溶性糖和游離脯氨酸的含量,提高紫花苜蓿的耐寒性。因此,通過噴施外源ABA在紫花苜?？购?、抗鹽和抗寒等生理過程中起著重要作用。

本文成功克隆紫花苜蓿MsHB1基因,進行了生物信息學分析,原核表達及基因表達特征分析。探討紫花苜蓿MsHB1基因時空差異、激素誘導或鹽脅迫下表達特征,為后續研究MsHB1基因的功能提供了依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料、試劑及儀器

本試驗的紫花苜蓿品種為保定苜蓿,保存于北京林業大學草業與草原學院實驗室;基質為草炭、蛭石、珍珠巖,體積比為3∶3∶1,光周期為14 h/10 h(日/夜),溫度為24℃,濕度為64%。大腸桿菌BL21、DH5α感受態細胞購于天根生化科技(北京)有限公司;克隆載體pMD19-T、原核表達載體pCold-Sumo2、植物總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、PCR純化試劑盒、質粒小提試劑盒、PCR產物純化試劑盒、PrimeSTAR MAX及限制性內切酶購于TaKaRa公司;DL5000 DNA Marker購于湖南艾科瑞生物工程有限公司;彩色預染蛋白Marker(10～170 kD)購于上海碧云天生物技術有限公司?？贵wAnti-strep tag Ⅱ mouse monoclonal antibody和HRP-conjugated goat Anti-mouse IgG購于生工生物工程(上海)股份有限公司;植物激素ABA、6-BA、GA3和IAA購于Sigma公司。水平電泳儀(Wide Mini-Sub Cell GT Cell)、凝膠電泳成像系統(ChemiDocTMXRS+System)和超靈敏化學發光成像儀(ChemiDocTMImaging System)均購于Bio-Rad公司。

1.2 試驗方法

1.2.1MsHB1基因克隆 收集成熟期紫花苜蓿葉片,置于研缽中,加入液氮充分研磨,使用植物總RNA提取試劑盒提取紫花苜蓿總RNA,利用反轉錄試劑盒得到第一鏈cDNA。以紫花苜蓿cDNA為模板,MsHB1-F和MsHB1-R為引物,利用PrimeSTAR MAX進行PCR擴增目的基因,程序為98℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 30 s,30個循環;72℃ 5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析后,連接至克隆載體pMD19-T。連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞,涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養基上,挑取單克隆菌落進行PCR鑒定,將含有正確條帶的單克隆菌落送至北京睿博興科生物公司測序,對測序結果進行比對和分析,將測序正確的克隆載體命名為pMD-HB1。

1.2.2引物設計 基于公布的紫花苜?；蚪M數據[20],通過軟件Primer Premier 5.0進行引物設計(表1)。其中,MsHB1-F和MsHB1-R用于MsHB1基因克隆,pCold-HB1-F和pCold-HB1-R用于原核表達載體構建,MsHB1-RT-F和MsHB1-RT-R用于MsHB1基因熒光定量檢測,MsActin-F和MsActin-R用于內參基因Actin熒光定量檢測。

1.2.3MsHB1生物信息學分析 通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對MsHB1蛋白保守結構域進行分析預測,通過SOPMA(https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)和Swiss-Model(https://swissmodel.expasy.org/)分別對MsHB1蛋白進行二級、三級結構的預測,根據ExPASy數據庫(http://expasy.org/)進行蛋白理化性質分析。采用SignalP 5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)進行蛋白質信號肽的預測,利用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。通過TMHMM-2.0網址(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進行蛋白質跨膜結構預測,在Cell-PLoc網站上(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/)進行亞細胞定位預測。

1.2.4MsHB1原核表達載體構建 使用質粒小提試劑盒提取pMD-HB1質粒,以質粒為模板,pCold-HB1-F和pCold-HB1-R為引物,進行PCR擴增,程序為98℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 30 s,30個循環;72℃ 5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析,對PCR產物進行純化回收,將純化后的PCR產物連接至限制性內切酶NcoI處理后的原核表達載體pCold-Sumo2。連接產物轉化至大腸桿菌BL21感受態細胞,涂在含有氨芐青霉抗性的LB固體培養基上。挑取單菌落進行PCR鑒定,將含有正確條帶的單克隆菌落送至生物公司測序,將測序正確的質粒命名為pCold-HB1。

1.2.5MsHB1蛋白原核表達 挑取含有pCold-HB1單克隆菌落,搖菌培養至OD600= 0.6,分別加入終濃度為0.1,0.2,0.5 mmol·L-1的IPTG,14℃低溫誘導14 h。將大腸桿菌樣品,使用離心機5 000 r·min-1離心10 min,棄掉上清,加入5 mL的1×PBS(pH=7.4)充分重懸菌液。吸取100 μL重懸菌液,混入20 μL的8 mol·L-1尿素溶液,99℃加熱10 min后,將蛋白樣品經SDS-PAGE電泳后,使用考馬斯亮藍染色。為分離可溶性蛋白和非可溶性蛋白,利用細胞破碎儀,設置功率60%,破碎15 min,使用離心機12 000 rpm分離出上清和沉淀。將收集的上清與沉淀樣品,經SDS-PAGE電泳后,使用考馬斯亮藍染色,分析蛋白質的表達情況。對SDS-PAGE電泳后的樣品,進行轉膜,以Anti-strep tag Ⅱ mouse monoclonal antibody單克隆抗體為一抗,HRP-conjugated goat Anti-mouse IgG為二抗,進行WB分析,使用超靈敏化學發光檢測儀進行拍照觀察。

1.2.6MsHB1表達分析 為分析不同組織及發育階段的MsHB1基因表達水平,選取長勢一致的紫花苜蓿植株,選取根、莖、葉三個組織部位,成熟和衰老葉片;100 mmol·L-1的NaCl溶液處理紫花苜蓿樣品,用于分析MsHB1基因鹽脅迫響應;為了分析不同激素對MsHB1表達的影響,對紫花苜蓿植株分別噴施50 μmol·L-1ABA、10 μmol·L-16-BA、50 μmol·L-1GA3、10 μmol·L-1IAA,并在0,0.5,1,2,4,6,8,12,24 h這9個不同的時間點進行取樣。將收集的樣品液氮速凍處理后放至-80℃冰箱儲存。使用植物總RNA提取試劑盒對樣品進行總RNA提取,并反轉錄為第一鏈cDNA。以MsHB1-RT-F和MsHB1-RT-R為引物,MsActin為內參基因,進行熒光定量PCR檢測。所有樣品均設置3個生物學重復,根據2-△△Ct法[21]使用EXCEL 2010進行數據初步處理并作圖,使用SPSS (26.0)軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 MsHB1基因克隆

以紫花苜蓿cDNA為模板,MsHB1-F和MsHB1-R為引物進行PCR擴增,PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析,在750～1 000 bp位置存在一條單一、清晰DNA條帶(圖1)。將上述產物,送至生物公司測序,測序結果顯示:該DNA含有完整的紫花苜蓿MsHB1基因編碼區。將該DNA序列轉化為氨基酸序列后顯示:紫花苜蓿MsHB1與蒺藜苜蓿MtHB1蛋白質的氨基酸序列有高達99%的相似,僅有一個氨基酸的差異(圖2)。

圖1 紫花苜蓿MsHB1基因的克隆Fig.1 Cloning of MsHB1 gene from alfalfa注:M,MB5000 DNA Marker;1,MsHB1基因Note:M,MB5000 DNA Marker;1,MsHB1 gene

圖2 蒺藜苜蓿與紫花苜蓿HB1的氨基酸序列對比Fig.2 Comparison of amino acid sequences of HB1 between Medicago truncatla and alfalfa

2.2 生物信息學分析

MsHB1基因編碼區為864 bp,共編碼288個氨基酸(圖3A),MsHB1蛋白的分子式為C1442H2244N398O471S12,分子量為47.654 KDa,理論等電點為4.77。根據保守域結構分析可知HB1屬于HD-ZIP家族,在65位到120位氨基酸之間含有Homebox的保守結構域(圖3B)。MsHB1蛋白質二級結構分析顯示:其蛋白含有39.93%的α-螺旋和4.86%的β-轉角(圖3C);蛋白質的三級結構分析顯示:其蛋白質主要由自由螺旋和環構成(圖3D)。蛋白質信號肽預測顯示,MsHB1蛋白無信號肽,亞細胞定位預測顯示,MsHB1定位于細胞核。MsHB1蛋白不穩定指數為69.35,推測其為不穩定蛋白,平均親水指數為-0.755,推測其為親水性蛋白。利用MEGA7.0 軟件系統繪制不同植物的HB1蛋白系統發育進化樹,結果顯示紫花苜蓿HB1蛋白與蒺藜苜蓿同源蛋白親緣關系最近(圖4),其次是紅三葉(Trifoliumpratense)。

圖3 紫花苜蓿MsHB1序列及結構分析Fig.3 Sequence and structure analysis of MsHB1 from alfalfa注:(A)MsHB1基因DNA序列和氨基酸序列;(B)MsHB1蛋白保守結構域預測;(C)MsHB1蛋白二級結構預測;(D)MsHB1蛋白三級結構預測Note:(A) DNA and protein sequences of MsHB1 gene;(B) Prediction of conservation domain of MsHB1;(C) Secondary structure prediction of MsHB1 protein;(D) Tertiary structure prediction of MsHB1 protein

圖4 MsHB1蛋白進化樹分析Fig.4 Evolutionary tree analysis of MsHB1 proteins

2.3 MsHB1

將含有pCold-HB1質粒的大腸桿菌BL21,涂布于含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養基上。挑取固體培養基上生長大小一致的單克隆菌落,引物為pCold-2f和pCold-r進行PCR擴增,經瓊脂糖凝膠電泳檢測所選大腸桿菌均能擴增出目標大小的DNA條帶(圖5)。經生物公司測序顯示:該載體含有正確序列的MsHB1基因,無堿基突變、無移碼突變,表明MsHB1原核表達載體構建成功,可以用于后續的試驗。

圖5 pCold-HB1鑒定Fig.5 Identification of pCold-HB1注:M,MB5000 DNA Marker;1～3,pCold-HB1質粒Note:M,MB5000 DNA Marker;1～3,pCold-HB1 plasmid

經誘導后,提取大腸桿菌表達產物,經SDS-PAGE電泳后,進行考馬斯亮藍染色,發現使用三種不同濃度的IPTG誘導后,大腸桿菌能夠表達一個約45KDa的蛋白,而未經誘導的大腸桿菌不能表達該蛋白(圖6)。該結果初步顯示了紫花苜蓿MsHB1表達成功。

圖6 MsHB1蛋白誘導前后的SDS-PAGE檢測Fig.6 SDS-PAGE detection of MsHB1 protein before and after induction注:M,彩色預染Marker(10～170kD);1,未誘導蛋白;2,0.1 mmol·L-1 IPTG誘導蛋白;3,0.2 mmol·L-1 IPTG誘導蛋白;4,0.5 mmol·L-1 IPTG誘導蛋白;方框,目標蛋白Note:M,colour pre-stained Marker (10～170kD);1,uninduced protein;2,0.1 mmol·L-1 IPTG-induced protein;3,0.2 mmol·L-1 IPTG-induced protein;4,0.5 mmol·L-1 IPTG-induced protein;Box,target protein

為分析表達的蛋白質的可溶性,分別將誘導后的菌液樣品利用細胞破碎儀進行破碎,分離上清和沉淀。經SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍染色后,發現三種不同濃度的IPTG誘導的大腸桿菌中均存在淀有明顯的條帶對比,其沉淀中含有存在的目標蛋白大約在45 KDa左右,0.1 mmol·L-1IT-PG與0.2 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1濃度相比,其對MsHB1的誘導能力更強(圖7,8)。

圖7 MsHB1蛋白誘導后沉淀SDS-PAGE檢測Fig.7 SDS-PAGE detection of precipitation for MsHB1 protein after induction注:M,彩色預染Marker(10～170kD);1,0.5 mmol·L-1 IPTG誘導沉淀蛋白;2,0.2 mmol·L-1 IPTG誘導沉淀蛋白;3,0.1 mmol·L-1 IPTG誘導沉淀蛋白;4,未誘導沉淀蛋白;方框,目標蛋白Note:M,colour pre-stained Marker (10～170kD);1,0.5 mmol·L-1 IPTG-induced precipitated protein;2,0.2 mmol·L-1 IPTG-induced precipitated protein;3,0.1 mmol·L-1 IPTG-induced precipitated protein;4,uninduced precipitated protein;Box,target protein

圖8 MsHB1蛋白誘導后上清SDS-PAGE檢測Fig.8 SDS-PAGE of supernatant after induction of MsHB1 protein圖8:M,彩色預染Marker(10～170kD);1,未誘導上清蛋白;2,0.1 mmol·L-1 IPTG誘導上清蛋白;3,0.2 mmol·L-1 IPTG誘導上清蛋白;4,0.5 mmol·L-1 IPTG誘導上清蛋白;方框,目標蛋白Fig.8:M,colour pre-stained Marker (10-170kD);1,uninduced supernatant protein;2,0.1 mmol·L-1 IPTG-induced supernatant protein;3,0.2 mmol·L-1IPTG-induced supernatant protein;4,0.5 mmol·L-1 IPTG-induced supernatant protein;Box,target protein

選IPTG表達量含量高的0.1 mmol·L-1IPTG沉淀誘導蛋白進行Western Blot雜交檢測,0.1 mmol·L-1濃度下誘導的蛋白有條帶顯示(圖9),與SDS-PAGE考馬斯亮藍染色結果大小一致,0.1 mmol·L-1IPTG濃度下原核蛋白成功表達。

圖9 MsHB1蛋白原核表達的Western Blot檢測Fig.9 Western Blot detection of prokaryotic expression of MsHB1 protein注:1～2,0.1 mmol·L-1 IPTG誘導沉淀蛋白樣品;3,未誘導蛋白對照Note:1～2,0.1 mmol·L-1 IPTG induced precipitated protein samples;3,uninduced protein control

2.4 MsHB1不同組織及發育時期表達分析

為分析MsHB1基因在紫花苜蓿根、莖、葉中的表達差異,對MsHB1進行熒光定量RT-PCR檢測,MsHB1基因在根、莖、葉中均有表達,而MsHB1基因在葉中表達水平略高,莖中表達水平最低(圖10)。

圖10 MsHB1基因不同組織的表達分析Fig.10 Expression analysis of MsHB1 gene in different tissues注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Notes:Different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 level.The same as below

收集不同發育時期紫花苜蓿葉片,進行MsHB1熒光定量RT-PCR檢測,結果顯示:MsHB1在不同的葉片發育時期也存在差異,其中幼嫩葉片中的表達量最高,成熟和衰老葉片中的表達量低(圖11)。

圖11 MsHB1基因葉片不同發育階段的表達分析Fig.11 Expression analysis of MsHB1 gene in leaves at different developmental stages

2.5 MsHB1基因對鹽脅迫及外施激素響應

對不同鹽脅迫的樣品,進行熒光定量RT-PCR分析,結果顯示:經過NaCl處理后,與未處理相比,紫花苜蓿中HB1基因的表達水平提升,其中,在6 h達到高峰,隨后逐漸下降,但經24 h處理后,表達水平依為對照水平的1.85倍。因此,MsHB1基因參與NaCl脅迫應答(圖12)。

圖12 紫花苜蓿MsHB1基因的鹽脅迫表達Fig.12 Expression of the MsHB1 gene in alfalfa under salt stress

對植物噴施不同激素,分別在不同時間點采樣,進行熒光定量RT-PCR分析,外源ABA使MsHB1基因的表達水平呈先上升趨勢,在6 h達到頂峰,之后基因表達量緩慢下降,與對照相比,MsHB1仍呈現較高水平,經ABA處理24 h基因表達水平為對照的2.11倍(圖13A);外施GA3后4 h內,MsHB1基因表達變化并不顯著,但在6 h后開始呈現上升的趨勢,在12 h時短暫下降,與對照樣品相比仍具有一定的上升趨勢,在24 h后到達頂峰,是對照樣品的8倍(圖13 B);外源6-BA使MsHB1基因呈現先上升后下降的趨勢,但MsHB1表達水平變化并不太大,在4 h達到頂峰,僅為對照樣品的1.38倍,但在24 h表達水平最低,為對照樣品的0.34倍(圖13C);外源施加IAA使MsHB1短時間內快速下降,隨后緩慢上升(圖13D)。

3 討論

植物在生長發育過程中可能會受到各種不利環境因素的影響,如干旱、低溫、高鹽等非生物因子脅迫。植物抗逆過程如其他生理過程一樣,當植物受到逆境脅迫時,植物能夠采取相應的策略來應對脅迫,在長期適應環境中也演化出了相應的一套復雜的防御網絡機制[22-23]。脫落酸在整合各種脅迫信號和調控下游脅迫反應方面發揮重要作用,在生物和非生物脅迫過程中扮演著關鍵角色[24]。Lechner等[25]研究發現擬南芥中I類HD-Zip轉錄因子ATHB6是ABA反應的負調控因子,能夠通過與MATH-BTB蛋白直接結合,進而引發蛋白泛素化過程。此外,Valde′s等[26]發現擬南芥中另外兩個HD-Zip轉錄因子基因ATHB7和ATHB12的轉錄調控依賴于2C型蛋白磷酸酶(PP2C)的活性,而PP2CS在ABA信號傳導過程中起著重要的調控作用,同時,AtHB7和AtHB12蛋白的結合可以抑制編碼ABA受體基因的轉錄。為深入發掘HB1基因的功能及ABA調控HB1轉錄因子網絡機制提供基礎,本試驗成功構建MsHB1- pCold-Sumo2載體,其與pET載體骨架相似,并轉入大腸桿菌BL21中誘導表達,通過Western Blot驗證MsHB1蛋白表達成功,約為45 KDa左右。本研究與紫花苜蓿MsIPT和MsDREB1原核表達結果一致[27-28],為后續蛋白純化以及納米抗體的制作提供了抗原。

HD-ZIP的I類轉錄因子能夠參與逆境為脅迫或響應激素誘導,尤其響應ABA信號,該家族的基因隨著ABA含量的變化而表達水平會發生變化[29-30]。通過生物信息學對MsHB1蛋白進行分析,構建系統發育樹可知,紫花苜蓿MsHB1蛋白與蒺藜苜蓿同源蛋白親緣關系最近,其次是紅三葉。通過MsHB1表達分析可知,MsHB1在根莖葉中均有表達,推測MsHB1基因在根、莖、葉中均能發揮作用,且參與了植物的生長發育。蒺藜苜蓿HDZip-I亞族轉錄因子HB1在主根和側根分生組織中表達,通過參與根部分生組織中ABA和輔酶信號的復雜相互作用,進而調控側根的生長[9],擬南芥AthHB1主要調控葉片的生長與發育[31],番茄LeHB1則參與調控花發育及果實成熟調控[32]。因此,進一步說明在不同物種中的HB1的表達部位以及功能可能存在一定的差異性。在鹽脅迫和ABA的處理下,MsHB1表達量明顯提高,推測MsHB1可能參與鹽脅迫和ABA信號傳導進程。這與HB1基因在棉花[5]、水稻[29]的表達模式下十分相似。此外,MsHB1可能參與其他激素途徑,如外源GA3,6-BA,IAA均能引起紫花苜蓿的MsHB1基因表達改變。本研究為此后關于MsHB1基因表達功能的研究提供了依據,關于MsHB1深入的生物功能以及調控機制,需進一步探索。

4 結論

本研究克隆了紫花苜蓿MsHB1基因,MsHB1的開放閱讀框867 bp,編碼了288個氨基酸,利用原核體系成功表達出MsHB1蛋白;MsHB1基因在紫花苜蓿根莖葉中均有表達,但莖的基因表達量低于根和葉的表達量;MsHB1參與ABA和NaCl的應答過程,GA3的能夠提高MsHB1表達水平,而6-BA、IAA則會降低MsHB1表達,表明紫花苜蓿MsHB1基因參與多種激素信號傳導途徑。