青海草原毛蟲幼蟲感器類型及GqinOBPs表達(dá)分析

南彥斌,王克鑫,潘學(xué)能,何啟月,劉占玲,周淵濤

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,青海 西寧 810016)

感器是昆蟲識(shí)別外界物理和化學(xué)信號(hào)的門戶,在昆蟲的覓食、配偶識(shí)別、產(chǎn)卵、躲避天敵和行為調(diào)節(jié)機(jī)制等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1-2]。昆蟲感器在其軀體的不同部位皆有分布,頭部是感器分布的集中區(qū),觸角和口器上各種感器在昆蟲行為過程和生命活動(dòng)中具有重要作用[3]。根據(jù)化學(xué)感器的形態(tài)將昆蟲化學(xué)感器劃分為毛形感器(Sensilla trichodea)、錐形感器(Sensilla basiconica)、腔錐形感器(Sensilla coeloconica)、刺形感器(Sensilla chaetica)和B?hm氏鬃毛(B?hm bristles) 等5個(gè)大類[4]。目前,對(duì)鱗翅目昆蟲化學(xué)感器的報(bào)道主要以成蟲觸角為主,如:美國(guó)白蛾Hyphantriacunea[5]、華北落葉松鞘蛾ColeophorasinensisYang等[6]成蟲觸角感器的種類、形態(tài)和分布[7]。幼蟲感器研究已經(jīng)報(bào)道的有小菜蛾幼蟲[8]和棉鈴蟲幼蟲[9]掃描電鏡觀察。作為接收和感知化學(xué)信號(hào)的第一道屏障,OBPs在配體的識(shí)別和氣味檢測(cè)中起著至關(guān)重要的作用。在鱗翅目昆蟲中,OBPs根據(jù)其氨基酸序列同源性可分為三類:信息素結(jié)合蛋白(PBPs)、普通氣味結(jié)合蛋白(GOBP)和其他[11]。鱗翅目昆蟲的氣味結(jié)合蛋白(OBPs)在指導(dǎo)嗅覺相關(guān)行為方面具有顯著作用,因此被認(rèn)為是鑒別各種氣味分子的關(guān)鍵候選分子[12]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,鱗翅目、雙翅目、直翅目、半翅目、鞘翅目等多種目的昆蟲的嗅覺傳感機(jī)制得到了廣泛的研究[13-14]。OBPs不同發(fā)育階段的表達(dá)量與其生理功能密切相關(guān)且對(duì)昆蟲識(shí)別外界環(huán)境信息具有重要作用,已被發(fā)展為害蟲防治的重要靶標(biāo)[15]。

青海草原毛蟲(Gynaephoraqinghaiensis)又名草原毒蛾,紅頭黑毛蟲,屬鱗翅目Lepidoptera,毒蛾科Lymantriidae,草原毛蟲屬Gynaephora,是青藏高原發(fā)生最嚴(yán)重的高寒草甸害蟲之一[16-17]。全世界發(fā)現(xiàn)15個(gè)種,亞洲分布最多有13個(gè)種,其中在我國(guó)分布有8個(gè)種,全部為青藏高原特有種,北美洲最少有1個(gè)種[18]。青海草原毛蟲分布密度高、發(fā)生面積大、危害程度嚴(yán)重[19]。據(jù)2003年至2019年青海草原毛蟲研究資料發(fā)現(xiàn),青海草原毛蟲的發(fā)生面積和危害程度在逐年上升[18]。其對(duì)家畜健康和草地生態(tài)系統(tǒng)的影響也越發(fā)嚴(yán)重。目前,關(guān)于青海草原毛蟲的研究涉及生態(tài)分布規(guī)律[20]、地理分布、空間格局和區(qū)系[21]、線粒體全基因組序列測(cè)定與分析[22]及轉(zhuǎn)錄組生信分析[16]等方面,缺乏對(duì)其化學(xué)感器超微結(jié)構(gòu)和化學(xué)感受機(jī)制的研究。本研究通過掃描電鏡(Scanning electron microscopy,SEM)技術(shù)觀察并分析青海草原毛蟲的幼蟲頭部和體軀感器類型、數(shù)量和分布位置,同時(shí)利用qPCR技術(shù)檢測(cè)GqinOBPs基因在青海草原毛卵、幼蟲和蛹的表達(dá)情況,不僅可以深入研究青海草原毛蟲的取食行為機(jī)制和化學(xué)感受機(jī)制奠定基礎(chǔ),也可以為探索害蟲綜合防治的新途徑提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

青海草原毛蟲卵、2-7齡幼蟲采自青海省海北州(36°59′06.6″ N,100°52′19.1″ E,海拔3 095.1 m)。對(duì)采集的部分青海草原毛蟲幼蟲根據(jù)頭殼寬度挑選出6齡幼蟲,進(jìn)行短期飼養(yǎng)直至化蛹以收集蛹期樣品。飼養(yǎng)條件:溫度(26±1)℃,光周期16L∶8D,相對(duì)濕度60%～80%。將采集的卵、實(shí)驗(yàn)室獲得的蛹及另一部分幼蟲根據(jù)齡期分別裝入不同的收集管凍入-80℃冰箱供之后試驗(yàn)取用。

1.2 幼蟲掃描電鏡樣品的制備與超微結(jié)構(gòu)觀察

在-80℃的冰箱內(nèi)選取4頭6齡幼蟲在體視顯微鏡下用鑷子和刀片分離其頭部與胸腹部;對(duì)幼蟲胸腹部進(jìn)行剃毛;剖開胸腹部,用無水乙醇清洗出昆蟲內(nèi)臟;不同濃度的乙醇對(duì)頭部和胸腹部分別進(jìn)行逐級(jí)脫水(30%,50%,70%,80%,90%,100%)3次,每次脫水20 min;取出幼蟲的頭部固定于泡沫板上,胸腹部在泡沫板上先展開,用昆蟲針對(duì)其進(jìn)行固定;固定后的樣品全部于超凈工作臺(tái)中打開風(fēng)扇吹干(時(shí)間:12 h);干燥后的處理樣品再置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上12 h;將干燥后的處理樣品用導(dǎo)電膠固定在樣品臺(tái)上;放入小型離子濺射儀(SBC-12)噴金1 min;之后在青海大學(xué)三江源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行掃描電鏡(JSM-7900F)拍攝。

1.3 掃描電鏡數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

感器的長(zhǎng)度及寬度根據(jù)拍攝照片,借助Image J(U.S National Institute of Health)進(jìn)行測(cè)量,運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件IBM SPSS26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用Adobe Photoshop CS6(Adobe Systems)軟件進(jìn)行感器類型的標(biāo)注并進(jìn)行圖片的排版;感器的鑒定參考Schneiderhe[23]和Zacharuk[24]術(shù)語。

1.4 青海草原毛蟲幼蟲總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

將1.1節(jié)凍存的青海草原毛蟲卵、幼蟲及蛹迅速放入已預(yù)冷的無RNA酶的研缽中,加入液氮并迅速研磨,根據(jù)Trizol提取RNA說明書提取各個(gè)樣品的RNA。結(jié)合超微量紫外分光光度儀(OD260 nm/OD280 nm的范圍為1.8～2.2)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(膠片中呈現(xiàn)出明顯的兩條帶)總RNA的質(zhì)量和濃度。

按照TRUEscript 1 st Strand cDNA Synthesis Kit(艾德萊,北京)說明書去除RNA中的基因組DNA,合成cDNA第1鏈,作為RT-PCR的模板。具體操作方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

針對(duì)已鑒定出的17個(gè)青海草原毛蟲OBPs基因序列[16]。利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)出15對(duì)引物,內(nèi)參基因(EF1-α-F)參考張棋麟等[17]篩出的引物,引物委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers in the study

1.6 青海草原毛蟲OBPs基因的qRT-PCR測(cè)定

以1.4節(jié)合成的青海草原毛蟲2-7齡幼蟲、卵和蛹等不同樣品的cDNA為模板,利用ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增基因。根據(jù)SuperReal Color PreMix試劑盒說明書,冰上操作。擴(kuò)增體系為20 μL:2×SuperReal Color PreMix 10 μL,正反向引物(10 μmol·μL-1)各0.8 μL,cDNA 1 μL(100 ng),ddH2O 7.4 μL。在ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),運(yùn)行條件:95℃ 1 min;95℃ 15 s,60℃ 15 s,循環(huán)40次;72℃ 45 s。以2齡幼蟲為陽性對(duì)照。每個(gè)樣品含3次生物學(xué)重復(fù),每次生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù),通過熔解曲線評(píng)估引物的特異性。

1.7 數(shù)據(jù)分析

青海草原毛蟲OBPs基因在卵、幼蟲及蛹中相對(duì)表達(dá)量利用2-ΔΔCt值法進(jìn)行計(jì)算,通過SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,對(duì)OBPs基因在在卵、幼蟲及蛹中的表達(dá)量差異進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),最后使用Graphpad prism繪制基因的表達(dá)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 青海草原毛蟲幼蟲頭部及口器感器類型與分布

青海草原毛蟲7齡幼蟲的頭部紅色,呈現(xiàn)橢圓形。頭式為下口式,口器為咀嚼式。頭部可見1對(duì)觸角、口器、吐絲器、側(cè)單眼等(圖1a～1b)。青海草原毛蟲7齡幼蟲的頭部、口器及口器周圍總共分布有9種類型的感器,分別是錐形感器的3種亞型(SBⅠ-Ⅲ),刺形感器的2種亞型(SChⅠ-Ⅱ),3種栓錐形感器(SSTⅠ-Ⅲ)1種毛型感器(ST)(表2)。在頭部背面分布著2種感受器,分別是SChⅠ刺形感器和毛形感器,2種感器的外觀比較相似(圖1a)。在頭部正面也分布有SChⅠ刺形感器和毛形感器(圖1c)。吐絲器和內(nèi)唇角質(zhì)齒附近感器較少,在其上面無感器分布(圖1d～1e)。刺形感器的明顯特點(diǎn)是長(zhǎng)直尖銳,基座微凸起,頂端尖銳,感器從基部到頂端變細(xì)窄形成刺狀。根據(jù)長(zhǎng)度、外壁是否光滑、有無刺等特征將刺形感器分為 2個(gè)亞型。在其上唇和上顎部位分布有2種刺形感器,分別為SChⅠ-Ⅱ刺形感器(圖1f),在上唇和上顎部位感器的數(shù)量較少,類型比較單一。下顎須上分布有7種類型的感器,其中下顎須的前端分布有3種錐形感器亞型(SBⅠ-Ⅲ)(圖1h),在基部分布有3種栓錐形感器亞型(SSTⅠ-Ⅲ)(圖1i),在中部分布有2種感器(SBⅠ和STⅡ)(圖1g)。

表2 青海草原毛蟲幼蟲感器的類型及形態(tài)測(cè)量值Table 2 Type and morphometric values of the larval G.qinghaiensis sensilla

錐形感受器的3種亞型(SBⅠ-Ⅲ)長(zhǎng)度分別是(8.73±2.23)μm,(5.78±1.21)μm,(7.92±2.56)μm,基座寬度(4.37±1.21)μm,(4.07±1.76)μm,(5.65±1.68)μm(表2)。錐形感受器根據(jù)其大小和外部形態(tài)分為3個(gè)亞型,即錐形感受器I型、II型和Ⅲ型(圖1 h)。刺形感受器呈刺狀,基部著生于突起的臼狀窩中。刺形感受器SCh Ⅰ長(zhǎng)度是(334.28±18.43)μm,基座寬度(15.25±2.34)μm,SChII長(zhǎng)度是(235.24±13.54)μm,基座寬度(14.64±3.24)(表2)。栓錐形感受器表面光滑無孔,形狀與拇指較為類似,頂部有凸起的錐狀結(jié)構(gòu)。在青海草原毛蟲超微結(jié)構(gòu)中鑒定出3個(gè)亞型,即SSTⅠ-Ⅲ。其長(zhǎng)度分別為(1.16±1.34)μm,(1.90±0.87)μm,(2.06±1.02)μm,基座寬度分別為(2.53±1.65)μm,(4.75±1.31)μm,(3.84±1.67)μm(圖1i,表2)。毛形感受器形如毛發(fā)(圖1c),長(zhǎng)度為(228.26±15.46)μm,寬度為(24.20±1.36)μm(表2)。

2.2 青海草原毛蟲幼蟲觸角感器類型與分布

青海草原毛蟲7齡幼蟲觸角由柄節(jié)、梗節(jié)和鞭節(jié)3部分組成(圖2d),分布有7種類型的感器,分別是腔錐形感器、栓錐形感器的4種亞型(SSTⅠ-Ⅳ)和刺形感器2種亞型(STⅠ-Ⅱ)。其中,鞭節(jié)分布著2種類型的感器,分別是腔錐形感受器(SCo)和栓錐形感受器(SSTⅡ),腔錐形感受器有光滑的圓心空腔,中心具有直立錐形(圖2b)。梗節(jié)端部著生有2種刺形感受器亞型(SChⅠ和SChⅡ)和1種栓錐形感器亞型(SSTⅠ),刺形感器從基部到頂端逐漸變細(xì)變窄形成刺狀(圖2a～2b)。柄節(jié)端部著生有2種栓錐形感器亞型(SSTⅢ,SSTⅣ)(圖2d)。感受器SSTⅢ和SSTⅣ形狀相似,栓錐形感受器表面光滑無孔,形狀與拇指較為類似,頂部有凸起的錐狀結(jié)構(gòu)(圖2c)。

圖2 青海草原毛蟲幼蟲的觸角掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscope images of antenna of G.qinghaiensis larvae注:a～d青海草原毛蟲幼蟲觸角感受器分布圖。SChⅠ,刺形感器;SChⅡ,刺形感器;SCo,腔錐形感器;SSTⅠ,栓錐形感器;SSTⅡ,栓錐形感器;SSTⅢ,栓錐形感器;SSTⅣ,栓錐形感器;F,鞭節(jié);P,梗節(jié);S,柄節(jié)Note:a～d The distribution and type of G.qinghaiensis larvae. SChⅠ,sensilla chaetica;SChⅡ,sensilla chaetica;SCo,sensilla coeloconica;SSTⅠ,sensilla styloconica;SSTⅡ,sensilla styloconica;SSTⅢ,sensilla styloconica;SSTⅣ,sensilla styloconica;F,flagellum;P,pedicel;S,scape

幼蟲鞭節(jié)上腔錐形感器SCo長(zhǎng)度(3.75±1.34)μm,基座寬度(5.08±3.25)μm,栓錐形感器SSTⅡ長(zhǎng)度(2.69±1.01)μm,基座寬度(2.00±1.02)μm,梗節(jié)上2種刺形感受器亞型SChⅠ和SChⅡ的長(zhǎng)度分別是(701.55±15.34)μm,(104.46±9.82)μm,基座寬度分別為(17.09±9.56)μm,(12.65±6.84)μm;栓錐形感器亞型SSTⅠ長(zhǎng)度(12.63±3.24)μm,基座寬度(2.69±7.71)μm,柄節(jié)上栓錐形感器SSTⅢ和SSTⅣ長(zhǎng)度分別為(1.89±0.92)μm,(2.45±1.12)μm,基座寬度分別為(2.87±1.54)μm,(2.62±1.04)μm(表2)。

2.3 青海草原毛蟲幼蟲足與毒腺上感器類型與分布

在青海草原毛蟲幼蟲足與毒腺上共分布有6種感器,其中在胸足上分布有4種感器,分別為刺形感器的3種亞型(SChⅠ-Ⅲ)和1種錐形感器(SB)(圖3a,3b,3c)。刺形感器在胸足的分布十分雜亂且生長(zhǎng)密度較大。SChⅠ的長(zhǎng)度為(410.68±23.02)μm,基座寬度為(24.03±3.34)μm,SChⅡ的長(zhǎng)度為(244.53±17.03)μm,基座寬度為(11.59±2.03)μm,SChⅢ的長(zhǎng)度為(360.13±18.56)μm,基座寬度為(16.73±3.56)μm(表2)。錐形感器在胸足上分布很少,只發(fā)現(xiàn)1處,其長(zhǎng)度為25.29 μm,基座寬度為(21.541±4.03)μm。腹足上分布著刺形感器的4種亞型(SChⅠ-Ⅳ),其中SChⅣ刺形感器的長(zhǎng)度是(749.47±24.45)μm,基座寬度為(15.17±3.45)μm(圖3 d,3e,表2)。它們的分布比較規(guī)整。青海草原毛蟲有1對(duì)尾足,其上只發(fā)現(xiàn)1種刺型感器(SChⅠ)且分布較密(圖3f)。

圖3 青海草原毛蟲幼蟲足與毒腺掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope images of legs and poison glands of G.qinghaiensis larvae注:a-i青海草原毛蟲幼蟲足與毒腺上感受器的分布與類型。SCh Ⅰ,刺形感器;SCh Ⅱ,刺形感器;SCh Ⅲ,刺形感器;SCh Ⅳ,刺形感器;SCo,腔錐形感器;BB,B?hm氏鬃毛Note:a-i The distribution and type of receptors on the feet and poison glands of G.qinghaiensis caterpillar larvae. SCh I,sensilla chaetica;SCh Ⅱ,sensilla chaetica;SCh Ⅲ,sensilla chaetica;SCh Ⅳ,sensilla chaetica;SCo,sensilla coeloconica;BB,B?hm bristles

青海草原毛蟲幼蟲腹部背面具有毒腺,毒腺的形狀不規(guī)則(圖3g,3h),顯微鏡下觀察為肉突狀,其上只發(fā)現(xiàn)B?hm氏鬃毛感器(BB),感器的有無在毒腺上有明顯的分界線(圖3i)。B?hm氏鬃毛感器的長(zhǎng)度為(88.77±6.56)μm,基座寬度為(1.87±0.21)μm。

2.4 青海草原毛蟲OBP基因表達(dá)分析

GqinOBPs在卵、幼蟲和蛹中的表達(dá)水平具有顯著差異(圖4),以二齡幼蟲作為陽性對(duì)照,測(cè)定15個(gè)OBP基因在青海草原毛蟲幼蟲不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量。GqinOBPs中,GqinOBP5、GqinOBP8和GqinOBP12在卵期的表達(dá)量顯著高于其他各期(P<0.05),但GqinOBP15在卵期不表達(dá)。GqinOBP2在二齡幼蟲中的表達(dá)顯著,GqinOBP16在此階段不表達(dá)(P<0.05)。GqinOBP9-11,GqinOBP13-14,GqinOBP17等6個(gè)基因在三齡幼蟲期的表達(dá)顯著(P< 0.05),GqinOBP10在三齡階段的表達(dá)量最高,是二齡幼蟲的約1 018倍,五齡幼蟲的約624倍。但GqinOBP2-3,GqinOBP5-6,GqinOBP16在青海草原毛蟲三齡幼蟲階段不表達(dá)。GqinOBPs在四齡幼蟲階段的表達(dá)不顯著且GqinOBP3-4,GqinOBP6不表達(dá)(P<0.05)。僅GqinOBP3在五齡幼蟲中的表達(dá)量顯著(P<0.05),其余基因在此階段微量表達(dá)或不表達(dá)。GqinOBPs在六齡幼蟲階段表達(dá)不顯著(P<0.05)。GqinOBPs在七齡幼蟲階段全部表達(dá),GqinOBP4在七齡幼蟲中的表達(dá)量最高,是二齡幼蟲的約661倍,三齡幼蟲的約415倍,但在六齡幼蟲期不發(fā)生表達(dá)。GqinOBP3在蛹期不發(fā)生表達(dá),其余基因在蛹期的表達(dá)量不顯著(P<0.05)。在15個(gè)GqinOBPs中GqinOBP4和GqinOBP10在卵、幼蟲和蛹中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定,表達(dá)量較高。GqinOBP2和GqinOBP8在卵、幼蟲和蛹中微量表達(dá),GqinOBP3除在五齡和七齡幼蟲中表達(dá)量較高,在其余發(fā)育階段幾乎不表達(dá),GqinOBP13和GqinOBP16分別在三齡幼蟲和卵階段高表達(dá),在幼蟲其余發(fā)育階段表達(dá)極不穩(wěn)定。

圖4 青海草原毛蟲氣味結(jié)合蛋白基因在卵、幼蟲和蛹Fig.4 Expression profiles of G.qinghaiensis odor-binding protein genes in different developmental stages of larvae注:Egg,卵;2L,二齡幼蟲;3L,三齡幼蟲;4L,四齡幼蟲;5L,五齡幼蟲;6L,六齡幼蟲;7L,7齡幼蟲;Pupa,蛹。統(tǒng)計(jì)分析所用的方法為單因素方差分析(Duncan檢驗(yàn),不同字母代表差異顯著,P<0.05);誤差棒代表3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤Note:2L,second instar;3L,third instar;4L,fourth instar;5L,fifth instar;6L,sixth instar;7L,seventh instar. The method used for statistical analysis was one-way analysis of variance (Duncan test,different letters represent significant difference,P <0.05);error bars represent standard errors for 3 biological replicates

3 討論

不同類型的感器在昆蟲取食、繁殖、棲息等一系列種間和種內(nèi)化學(xué)通訊中具有重要作用[26]。本研究以青海草原毛蟲幼蟲為對(duì)象,采用掃描電子顯微鏡法進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察,結(jié)果顯示,青海草原毛蟲幼蟲觸角上分布有7種感器,分別是腔錐形感器、4種栓錐形感器(SSTⅠ-Ⅳ)和2種刺形感器(SChⅠ-Ⅱ)。胡平等[27]對(duì)桉蝙蛾幼蟲觸角進(jìn)行掃描電鏡拍攝找到8對(duì)感器,分別是 3對(duì)刺形感器、4對(duì)錐形感器和 1對(duì)栓錐形感器。感器類型與青海草原毛蟲幼蟲觸角發(fā)現(xiàn)感器類似,推測(cè)這些類型的感器在青海草原毛蟲幼蟲感受化學(xué)信號(hào)及機(jī)械刺激的過程中起重要作用。

鱗翅目幼蟲頭部感受器主要分布在觸角、下顎和下唇上,并依此選擇寄主植物、完成取食等生命活動(dòng),對(duì)幼蟲頭部化學(xué)感受器進(jìn)行研究可以明確昆蟲食性機(jī)理[28]。青海草原毛蟲幼蟲頭部及口器周圍共分布9種感器,分別是3種錐形感器(SBⅠ-Ⅲ),2種刺形感器(SChⅠ-Ⅱ),3種栓錐形感器(SSTⅠ-Ⅲ)和1種毛型感器(ST)。錐形感受器在食草類昆蟲中具有識(shí)別寄主揮發(fā)物的作用[29]。在青海草原毛蟲幼蟲的下唇須附近未發(fā)現(xiàn)感器,在其下顎須發(fā)現(xiàn)7種感器,這與蛀果類害蟲桃小食心蟲[30]的研究結(jié)果相似,推測(cè)這些感器可能與其食草習(xí)性有關(guān)。刺形感受器在昆蟲寄主選擇、感知幼蟲分泌的產(chǎn)卵阻礙信息素、感受機(jī)械刺激及對(duì)產(chǎn)卵場(chǎng)所的評(píng)估等方面具有顯著作用[26]。青海草原毛蟲幼蟲的上唇分布著刺形感受器的兩種亞型,推測(cè)可能上唇分布的刺形感受器與寄主選擇有關(guān)。研究表明朱紅毛斑蛾[31]幼蟲頭部分布有栓錐形感受器,具有感受機(jī)械和味覺的作用,因此我們認(rèn)為青海草原毛蟲幼蟲頭部栓錐形感受器具有類似功能。在蟲體感受外界環(huán)境刺激、寄主植物釋放的化學(xué)物質(zhì)時(shí),毛形感器能選擇更合適的寄主[32]。因此我們推測(cè)青藏高原氣候多變,為了更好的適應(yīng)環(huán)境,毛型感器的分布為青海草原毛蟲在定位寄主植物時(shí)提供便利。

青海草原毛蟲幼蟲足與毒腺上共分布有6種感器,其中在胸足上分布有4種感器,分別為刺形感器的3種亞型(SChⅠ-Ⅲ)和1種錐形感器(SB)。腹足上分布著刺形感器的4種亞型(SChⅠ-Ⅳ)。它們的分布比較規(guī)整。尾足上只發(fā)現(xiàn)1種刺型感器(SChⅠ)且分布較密。梨小食心蟲幼蟲胸足可以感知溫濕度,青海草原毛蟲同屬鱗翅目昆蟲,推測(cè)其胸足感器在選擇棲息地時(shí)發(fā)揮作用[33]。毒腺位于腹部背面第六節(jié)上,形狀不規(guī)則。其可以分泌有毒粘液,對(duì)外界刺激做出反應(yīng),防御天敵以保護(hù)昆蟲自身。Bohm′s鬃毛感器形狀似短刺,直接接觸后產(chǎn)生反應(yīng)或可感受機(jī)械刺激[34-35]。因此,我們推測(cè)Bohm,s鬃毛感器在青海草原毛蟲幼蟲的毒腺下大量分布具有刺激毒腺產(chǎn)生分泌物的功能。

采用RT-qPCR技術(shù)測(cè)定了GqinOBPs基因在青海草原毛蟲幼蟲不同發(fā)育階段中的表達(dá)量。結(jié)果表明,GqinOBPs基因在青海草原毛蟲幼蟲各蟲態(tài)的表達(dá)具有顯著差異,這與西花薊馬[36]Frankliniellaoccidentalis幼蟲各蟲態(tài)的表達(dá)模式相似。推測(cè)GqinOBPs基因在不同發(fā)育階段、不同齡期發(fā)生表達(dá)差異與其生理功能相關(guān)[37]。GqinOBP5,GqinOBP8和GqinOBP12在卵期高表達(dá),這與桃小食心蟲Carposinasasakii的CsasOBP12,CsasOBP15和CsasOBP21在其卵期表達(dá)情況一致[38]。目前報(bào)道的在卵中高表達(dá)的氣味結(jié)合蛋白基因稀少,2020年李玲[39]首次報(bào)道了在卵中特異性高表達(dá)的GdauOBP28基因,發(fā)現(xiàn)其與卵的發(fā)育相關(guān)。因此推測(cè)在青海草原毛蟲卵期高表達(dá)的3個(gè)基因,可能在卵的生理生化過程中起重要作用。GqinOBP2與GdHsp70-2的表達(dá)情況相似在二齡幼蟲期高表達(dá)。根據(jù)GdHsp70-2的功能推測(cè)GqinOBP2基因可能參與了青海草原毛蟲的生長(zhǎng)發(fā)育過程[40]。GqinOBPs基因在四至六齡幼蟲中微量表達(dá)甚至不表達(dá),與SlitGOBP2基因在斜紋夜蛾中的表達(dá)情況相同[41]。GqinOBPs基因在蛹期微量表達(dá)或者不表達(dá)與Gong等[42]研究的小麥吸漿蟲Sitodiplosismosellana氣味結(jié)合蛋白基因在其蛹期的表達(dá)情況相似,可能由于昆蟲在蛹期不食不動(dòng),不需要啟動(dòng)高級(jí)嗅覺系統(tǒng)[43]。GqinOBP4和GqinOBP10在幼蟲整個(gè)發(fā)育階段表達(dá)顯著具有齡期偏好,與趙航等[44]研究EfurOBP2,EfurOBP4在叉角厲蝽Eocantheconafurcellata幼蟲中高表達(dá)結(jié)果相似。

4 結(jié)論

本研究利用掃描電鏡觀察青海草原毛蟲6齡幼蟲的感受器種類和形狀,并通過實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)技術(shù)測(cè)定GqinOBPs基因在卵、幼蟲和蛹中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)幼蟲觸角上分布有7種感器,頭部及口器周圍共分布9種感器,足上分布有5種感器,毒腺上只有B?hm氏鬃毛感器。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GqinOBP4和GqinOBP10表達(dá)量較好。明確了青海草原毛蟲幼蟲的感受器類型、分布及可能的功能,通過基因表達(dá)譜分析檢測(cè)了各個(gè)基因的表達(dá)情況,對(duì)解析幼蟲感受器感知化學(xué)物質(zhì)的分子機(jī)制,以及研發(fā)特異的行為調(diào)控技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。