干燥對鹽堿地苜蓿營養品質及真菌菌群結構的影響

王志軍,盧 強,丁 霞,馬宏偉,賈玉山,格根圖*

(1.內蒙古農業大學草原與資源環境學院/農業農村部飼草栽培、加工與高效利用重點實驗室,內蒙古 呼和浩特 010020;2.寧夏大學林業與草業學院,寧夏 銀川 750000; 3.內蒙古農業大學沙漠治理學院,內蒙古 呼和浩特 010020;4.內蒙古正時生態農業(集團)有限公司,內蒙古 呼和浩特 010020)

飼草產業作為黃河流域重要的支柱性產業之一,其發展取得了顯著成效,但在產業各環節還存在諸多問題亟待解決。其中最關鍵的問題表現在兩方面:一是黃河流域土壤多數為鹽堿地,影響飼草的正常生長發育;二是由于鹽堿地飼草“產-加-貯”基礎理論研究的匱乏,導致常規的生產加工技術難以實施。從資源高效利用的角度講,探究如何在鹽堿地中生產優質的飼草資源迫在眉睫。據聯合國教科文組織和糧農組織統計,全球鹽堿地面積達到9.55億hm2[1],我國鹽堿地面積總計9 913.3萬hm2[2],主要分布于我國東北、華北及濱海等地。土壤鹽脅迫作為非生物逆境之一,限制了植物的生長和營養物質的積累[3]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)作為一種優質牧草,是當前國內外主要的栽培牧草[4],紫花苜蓿的種植對草食畜牧業的可持續發展以及飼草資源的高效利用具有重要的戰略意義。近年來,隨著“中央1號文件”和中央農村工作會議等政策和會議的高度重視,苜蓿產業已成為飼草發展重要組成部分。由于我國耕地資源緊張,在“綠色-高質量-可持續”發展的方針下,把鹽堿地作為重要的后備耕地資源,發展苜蓿產業是一條重要途徑。而紫花苜蓿在干燥過程中,極易出現霉變現象,導致飼草中產生大量的霉菌毒素,同時,霉菌的滋生會消耗大量的營養物質[5]使得紫花苜蓿的營養品質受到損失。部分產毒霉菌在生長繁殖過程中產生的次級代謝產物霉菌毒素會損害動物的健康同時對其生產性能有負面影響[6],從而給畜牧業帶來巨大的經濟損失。主要的霉菌毒素包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、T2毒素、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮[7]。黃曲霉毒素主要由黃曲霉(Apergillusflavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)產生[8];赭曲霉毒素由多種生長在飼料中的青霉和曲霉菌產生[9];嘔吐毒素是一種常見的鐮刀菌毒素,主要由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)和黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)產生[7]。飼草中的霉菌毒素及霉菌的產生與飼草原料中的霉菌數量和種類息息相關,鑒于此,文中主要對紫花苜蓿干燥過程中的真菌進行剖析,探究紫花苜蓿晾曬過程中霉菌種類變化情況,為苜蓿干草生產提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗在包頭市鑫泰農業科技有限責任公司種植基地進行。地點位于內蒙古包頭市九原區哈林格爾鎮,地處河套平原。地理位置為東經110°37″～110°27″,北緯40°5″～40°17″,海拔937 m,屬北溫帶大陸氣候,干旱多風,全年主導風向為西北風;年平均氣溫6.8℃,7月平均氣溫22.5℃～23.1℃,1月平均氣溫-13.7℃;無霜期約165 d,最大凍土深度1.4 m,年平均降雨量330 mm,年平均蒸發量2 094 mm,日平均風速3 m·s-1;全年日照時數3 177 h,年日照百分率為70%,是全國日照最豐富的地區之一。

表1 試驗地土壤特性Table 1 Soil characteristics of the test site

1.2 試驗材料及設計

試驗采用單因素試驗設計,分別從每個試驗小區中隨機選取3個樣方,試驗以種植第二年的‘中苜3號’紫花苜蓿為原料,初花期刈割,留茬高度為5～8 cm。干燥方式為自然干燥法,分別將晾曬0 h(M_YL)和12 h(M_12 h)的紫花苜蓿切碎至2～3 cm后,取20 g苜蓿樣品置于離心管,并立即放入液氮中速凍,以備實驗室測定真菌多樣性。同時取500 g樣品105℃殺青,65℃下烘干48 h后測定紫花苜蓿營養品質。

1.3 測定指標

干物質(Dry matter,DM)含量采用烘干恒重法[10]測定;粗蛋白質(Crude protein,CP)含量采用FOSS KJ2300全自動凱氏定氮儀[11]進行測定;可溶性蛋白(Soluble protein,SP)和非蛋白氮(Nonprotein nitrogen,NPN)含量均按照三氯乙酸的方法進行測定[12];中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)含量利用FOSS Fibertee 2010全自動纖維分析系統進行測定[13-14];可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrate,WSC)和淀粉含量采用蒽酮-硫酸比色法[15]測定;非結構性碳水化合物(Non-structural carbohydrate,NSC)為淀粉與可溶性碳水化合物之和。

1.4 微生物試驗流程和測定方法

DNA抽提和PCR擴增:首先根據 E.Z.N.A.? soil試劑盒說明書對微生物進行DNA抽提,DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測;用ITS1F (CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2R (GCTGCGTTCTTCATCGATGC) 引物對V3-V4可變區進行PCR擴增。引物由上海美吉生物醫藥科技有限公司提供。擴增體系(20 μL):FastPfu緩沖液4 μL,2.5 × 10-3mol·L-1dNTPs 2 μL,引物(50.8 μmol·L-1)0.8 μL,FastPfu聚合酶0.4 μL,DNA模板10 ng,加無菌水補足20 μL。擴增程序為:95℃預變性 3 min;95℃變性 30 s,45℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,共27 個循環;72℃延伸 10 min。

使用 2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST進行檢測定量,根據Illumina MiSeq平臺標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 2×300的文庫。

菌群組成柱狀圖均采用R語言相關軟件包進行分析及作圖。使用PICRUSt(Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)(http://picrust．github．Io/picrust/)進行菌群的代謝功能預測,其功能預測根據最新的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數據庫比對獲得。

1.5 數據處理與分析

采用Microsoft Office Excel 2007軟件對試驗數據進行預處理,并使用SAS 9.0統計軟件進行方差分析,使用Graphpad 9.0 統計軟件分析微生物數據。

2 結果與分析

2.1 干燥12 h對紫花苜蓿營養品質的影響

鹽堿地紫花苜蓿自刈割至晾曬12 h后的營養品質如表2所示。M_YL中的CP含量為20.4%,經過12 h晾曬后,M_12 h處理中CP含量下降至19.6%,差異顯著(P<0.05)。SP含量也從7.5%降至6.4%。經過12 h晾曬后,總可消化養分(Total digestible nutrients,TDN)的含量從59.7%降至M_12 h的55.6%,差異顯著(P<0.05)。紫花苜蓿原料中的NSC為8.9%,經過12 h晾曬后降至4.4%,差異顯著(P<0.05)。

表2 干燥12 h對紫花苜蓿營養品質的影響Table 2 Effect of dried for 12 hours on nutritional quality of alfalfa

2.2 干燥12 h對紫花苜蓿真菌(屬水平)物種數的影響

對紫花苜蓿原料和自然干燥12 h的真菌群落DNA進行高通量測序數據分析后,繪制群落維恩圖如圖1所示。經干燥12 h后的真菌在屬水平上存在物種數量差異性,紫花苜蓿原料上屬水平的物種總數為150個,而M_12 h時只有74個屬的真菌。M_YL和M_12 h共有的物種數(屬水平)為66個,而原料中特有的84個屬在干燥12 h后降為8個屬。

圖1 干燥12 h后紫花苜蓿真菌屬水平Venn圖Fig.1 Venn diagram of fungal genus abundance in alfalfa hay subsequent to dried for 12 hours

2.3 干燥12 h對紫花苜蓿真菌群落分布

經過對干燥前后紫花苜蓿附著真菌群落的分析,將分類水平總豐度前20的物種篩選制圖。由圖2可知,共有的真菌主要分布在小戴衛霉科(Davidiellaceae)、孢腔菌科(Pleosporaceae)、鏈格孢屬(Alternaria)、隱球酵母科(Cryptococcaceae)、隱球菌屬Cryptococcus)。M_YL中的真菌群落組成與M_12 h存在較大的差異性。在M_YL中存在的物種數要多于M_12 h,M_YL中的真菌以小戴衛霉科為主,以鏈格孢屬、隱球菌屬、假絲酵母屬(Candida)、錐梗孢屬(Dissoconium)、漢納酵母屬(Hannaella)、布勒擔孢酵母屬(Bulleromyces)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)等為輔的微生物群落。而在M_12 h中的真菌群落同樣以小戴衛霉科為主,與M_YL相同的真菌屬除了小戴衛霉科外,還有鏈格孢屬、隱球菌屬等,不同的是增加了赤霉屬(Gibberella)、小不整球殼屬(Plectosphaerellaceae)、匍柄霉屬(Stemphylium)等微生物。

圖2 干燥12 h對紫花苜蓿真菌屬水平豐度值的影響Fig.2 The effect of dried for 12 hours on fungal genus abundance in alfalfa hay

2.4 干燥12 h對紫花苜蓿附著真菌屬水平的物種差異性研究

將上述研究中具有差異性的真菌篩選后進行兩組間差異性分析如圖3所示,左圖代表屬水平的微生物在各組的物種豐度值,右圖代表每個屬級微生物在兩組間的差異程度。其中差異程度較大的是小戴衛霉科和球腔菌科(Mycosphaerellaceae),刈割后的紫花苜蓿經干燥12 h后,小戴衛霉科的豐度值從45.03%增加到72.39%,而球腔菌科從14.04%下降到了1.02%。鏈格孢屬、小不整球殼屬(Plectosphaerellaceae)、匍柄霉屬、赤霉屬(Gibberella)及Lectera均有不同程度的增加。在紫花苜蓿干燥12 h后,所增加的微生物大多屬于霉菌,酵母菌則是大幅度減少。

圖3 干燥12 h對紫花苜蓿屬水平微生物差異性的影響Fig.3 Effect of dried for 12 hours on the difference of alfalfa microorganisms

2.5 紫花苜蓿附著真菌系統進化樹的研究

從圖4系統發育進化樹可以看出,分類豐度值前20的物種分類為13個類別。鏈格孢屬和匍柄霉屬在系統進化樹上位置最近,且同屬于絲孢目(Hyphomycetales)?？傮w而言,20個真菌屬分屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)、子囊菌門(Ascomycotina)。

圖4 基于ITS基因序列建立的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS gene sequences

2.6 干燥12 h對紫花苜蓿附著真菌生態功能群預測

通過對M_YL和M_12 h樣品真菌的歸納,從ITS功能預測分析可知(圖5),M_YL的微生物群落主要由9個生態功能群構成,分別為植物病原-木材腐生菌群(Plant pathogen-Wood saprotroph),植物病原菌群(Plant pathogen),動物病原-真菌-內生菌-植物病原菌群(Animal pathogen-endophyte-Fungal parasite-Plant pathogen-Wood saprotroph),真菌寄生菌群(Fungal parasite-Litter saprotroph),動物病原-內生菌-地衣寄生蟲-植物病原-土壤腐生-木材腐生(Animal pathogen-Endophyte-lichen parasite-Plant pathogen-Soil saprotroph-Wood saprotroph),植物病原-腐爛菌群(Plant pathogen-Undefined saprotroph),動物病原體-內生菌-植物病原體-木材腐生(Animal pathogen-Endophyte-Plant pathogen-Wood saprotroph),腐生菌群(Undefined saprotroph),真菌寄生-腐爛菌群(Fungal parasite-Undefined saprotroph)。M_12 h處理組中除植物病原-腐爛菌群外,同樣具備其余8個生態功能群。

圖5 干燥12 h對紫花苜蓿真菌的生態功能群預測Fig.5 The effect of dried for 12 hours on the ecological functional groups of fungi in alfalfa

3 討論

3.1 干燥對紫花苜蓿營養品質的影響

優質的紫花苜蓿干草粗蛋白質含量可達18%以上,是適口性較好的一種優質飼草資源[16]。Roybal等[17]研究發現,飼草自然晾曬的干燥時間與營養物質的損失呈正相關關系,晾曬一天會導致營養物質的損失率達4%左右。在本研究發現,干燥后粗蛋白質含量顯著下降,與Roybal等研究的研究結果相似。可能是因為植物在刈割后,仍會進行代謝活動,包括呼吸作用[18]等,導致部分蛋白質分解為水溶性氨化物[19]。非結構性碳水化合物是植物中能量貯存的主要形式,也是參與植株生命代謝的重要物質,它包括可溶性碳水化合物(蔗糖和果糖等)和淀粉。M_YL中的非結構性碳水化合物經晾曬12 h后,顯著減少,減少的非結構性碳水化合物占原料中的比值高達50.5%,可能是單糖和多糖等可溶性糖類的分解引起的[20-21]。

3.2 干燥對紫花苜蓿附著真菌的影響

牧草在干燥過程中附著的微生物主要有好氧性細菌、真菌和一些放線菌,其中真菌主要包括酵母菌和霉菌[22-23]。本研究發現,鹽堿地紫花苜蓿真菌以小戴衛霉科、隱球菌屬、鏈格孢屬、漢納酵母屬為優勢菌群,在干燥12 h時,其豐度值逐漸減小。而子囊菌門的真菌多數可在植物體內外營兼性寄生生活,多數可引發各類病害[24]。M_YL處理紫花苜蓿附著真菌豐度值位居前五的有小戴衛霉科、鏈格孢屬、隱球菌屬、假絲酵母屬、錐梗孢屬,M_12 h處理紫花苜蓿附著真菌豐度值位居前5的有小戴衛霉科、鏈格孢屬、赤霉屬、小不整球殼屬、匍柄霉屬。真菌中的赤霉屬對于農業生產而言,危害較大,大多數赤霉菌都能產生特定的毒素及其他活性物質[25],其生長繁殖亦會消耗紫花苜蓿的營養物質,如淀粉等糖類物質[26],它的營養方式為腐生營養型。匍柄霉屬的生長繁殖依賴于紫花苜蓿植株本身的葡萄糖[27]。文中研究發現,紫花苜蓿非結構性碳水化合物損耗量大的原因可能是葡萄糖為霉菌生長繁殖的最適碳源,導致其消耗量增加[28-29]。文中研究紫花苜蓿附著真菌只確定到了屬,沒有具體的種,有待于下一步研究。Pang等人[30]對青貯前紫花苜蓿樣品微生物進行鑒定,發現紫花苜蓿表面主要附著植物乳桿菌、類植物乳桿菌及假腸膜明串珠菌,且數量也存在差異。文中研究發現附著的真菌只有霉菌和酵母菌屬,主要原因在于此次研究重點關注真菌群落的結構特征。

牧草及作物原料表面附著的微生物主要為細菌和好氧真菌,如酵母菌、霉菌以及其他菌群;酵母菌、霉菌屬于異養型微生物,其具有胞內和胞外酶系統,用于將大分子物質分解成細胞新陳代謝可利用的小分子物質,飼料和糧食是其吸收營養物質的供體[31],因此這兩種菌屬群落的增加對飼草干燥是不利的。賈濤等[32]研究發現,牧草飼料中的營養物質損失主要是由于霉菌分解消耗牧草中營養物質時產生的大量熱量導致的。在溫度和濕度較高的情況下,飼草中的甘油和游離脂肪酸等物質會被霉菌分泌的脂肪酶降解,導致飼草發生腐敗現象,進而發霉變質,影響飼草品質[33]。Arinze等[34]研究發現,干草貯藏過程中由于微生物引起的熱害會導致蛋白質、可溶性碳水化合物以及含氮物質的損失以及粗纖維消化率的下降[35]。

當空氣溫度達到25℃～30℃,水分在25%～40%,空氣濕度達到80%～90%時,微生物的活動更加劇烈,此時會導致牧草發生霉變從而引起其營養成分大量損失[36]。本研究發現紫花苜蓿在干燥后除小戴衛霉科、鏈格孢屬、漢納酵母屬和隱球菌屬的豐度值降低外,鹽堿地苜蓿真菌仍包括假盤菌屬、紅冬孢酵母屬、漆斑菌屬、生赤殼科、座囊菌綱、微座孢屬等微生物,干燥到12 h時,這些真菌仍存在,在紫花苜蓿后續的干草調制過程中仍會有不利影響。

4 結論

鹽堿地紫花苜蓿晾曬12 h后干物質含量升高,粗蛋白質、可溶性蛋白質、非結構性碳水化合物含量顯著下降。鹽堿地紫花苜蓿附著真菌隸屬4個真菌門,優勢菌群為小戴衛霉科、隱球菌屬、鏈格孢屬、假絲酵母屬、錐梗孢屬。在干燥12 h后,紫花苜蓿附著真菌菌群多樣性和豐度值逐漸減小。干燥12 h后,紫花苜蓿附著真菌以小戴衛霉科、鏈格孢屬、赤霉屬、小不整球殼屬、匍柄霉屬為主,其營養方式主要為腐生營養型,此類微生物的生長繁殖會消耗紫花苜蓿自身的營養物質,因此在后續紫花苜蓿干草或青貯調制過程中存在霉變的風險。