基于生物信息學(xué)分析PRDM家族在甲狀腺癌中的表達(dá)及臨床意義

李娜 曹狀 程顯斌 向新 胡雪 王思佳

(1吉林省醫(yī)療急救指揮中心,吉林 長(zhǎng)春 130021;2吉林大學(xué)第二醫(yī)院甲狀腺外科; 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 3胃腸結(jié)直腸外科;4乳腺外科; 5吉林省人民醫(yī)院燒傷整形外科)

甲狀腺合成、貯存、分泌甲狀腺素,影響細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和組織代謝,是人體十分重要的內(nèi)分泌器官。甲狀腺癌是最常見(jiàn)的甲狀腺惡性腫瘤。其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢(shì)〔1,2〕。我國(guó)甲狀腺癌以每年20%的速度持續(xù)增長(zhǎng)。甲狀腺癌的主要病理學(xué)類(lèi)型包括甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡狀癌、甲狀腺髓樣癌及甲狀腺未分化癌。甲狀腺乳頭狀癌和濾泡狀癌統(tǒng)稱(chēng)為分化型甲狀腺癌,占成人甲狀腺癌的90%以上。其中甲狀腺乳頭狀癌分化較好,是最常見(jiàn)也是預(yù)后最好的病理類(lèi)型。甲狀腺乳頭狀癌分為4種不同亞型,分別為經(jīng)典型、高細(xì)胞型、濾泡亞型、其他亞型。PRD-BF1和RIZ同源結(jié)構(gòu)域蛋白(PRDM)家族是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族,在人類(lèi)腫瘤的形成與發(fā)展過(guò)程中扮演重要作用〔3〕。目前,PRDM家族共發(fā)現(xiàn)17 個(gè)家族成員〔4〕。研究發(fā)現(xiàn),PRDM蛋白能夠?qū)Σ煌陌谢蜻M(jìn)行調(diào)控,影響癌癥的發(fā)生與發(fā)展。乙型肝炎病毒(HBV)感染患者PRDM1表達(dá)水平與對(duì)照組相比(HBV病毒曾經(jīng)感染者和健康者)顯著升高,其中HBV相關(guān)的肝細(xì)胞癌患者的PRDM1表達(dá)水平最高,PRDM1高表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者預(yù)后較差〔5〕。PRDM1在肺癌細(xì)胞中低表達(dá),低表達(dá)的PRDM1可促進(jìn)肺癌細(xì)胞體外侵襲及體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移,與肺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)〔6〕。PRDM2在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中低表達(dá),其表達(dá)水平的變化受雌二醇和分化劑的調(diào)節(jié),能夠影響精原細(xì)胞GC-1的增殖與凋亡。PRDM2在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤形成中具有潛在的抑癌基因作用〔7〕。PRDM5在結(jié)直腸癌和胃癌細(xì)胞系中表達(dá)降低,將PRDM5轉(zhuǎn)入癌細(xì)胞會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng),表明PRDM5在胃腸道癌癥中發(fā)揮抑癌作用〔3〕。PRDM14在肺鱗癌和肺腺癌中高表達(dá),在癌旁組織中低表達(dá),而且PRDM14表達(dá)水平與肺癌的分化程度顯著相關(guān)〔8〕。

目前僅有少部分研究報(bào)道PRDM家族成員與甲狀腺癌相關(guān)。王璐〔9〕研究發(fā)現(xiàn),PRDM1在甲狀腺組織中表達(dá)明顯高于人體正常組織,而且在甲狀腺疾病中表達(dá)更顯著。Lal等〔10〕研究表明,PRDM2(RIZ1)在甲狀腺癌中表現(xiàn)為腫瘤抑制因子,RIZ1抑癌基因的轉(zhuǎn)錄激活是甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)常見(jiàn)過(guò)程,有可能作為甲狀腺癌潛在新治療靶點(diǎn)。Sorrentino等〔11〕發(fā)現(xiàn),PRDM12在甲狀腺癌中表達(dá)上調(diào)。Liu等〔12〕研究表明,PRDM16在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)下調(diào),PRDM16通過(guò)與其直接下游靶點(diǎn)丙酮酸羧化酶啟動(dòng)子直接結(jié)合,在甲狀腺癌中表現(xiàn)出抗腫瘤作用和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制功能,抑制甲狀腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。Pan等〔13〕研究表明,PRDM16表達(dá)與甲狀腺癌的臨床分期有關(guān),可能成為潛在治療靶點(diǎn)。其他PRDM家族成員在甲狀腺癌中的作用仍然未知。因此,本研究重點(diǎn)探討PRDM家族在甲狀腺癌中的表達(dá)及與甲狀腺癌患者預(yù)后的關(guān)系,對(duì)部分家族成員在甲狀腺癌中的作用機(jī)制進(jìn)行初步分析。

1 材料與方法

1.1PRDM家族在甲狀腺癌中表達(dá)分析 UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)是在線分析癌癥組學(xué)的數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)腫瘤基因組圖譜計(jì)劃(TCGA)可深度挖掘分析PRDM家族在正常組織與腫瘤組織中的表達(dá)。打開(kāi)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù),選擇TCGA,篩選條件為:Gene symbol=PRDM1-PRDM16,TCGA dataset=thyroid cancer。分析PRDM家族在正常組織與腫瘤組織及不同腫瘤分期、種族、性別、年齡、腫瘤分化程度、組織學(xué)亞型、淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1.2PRDM家族與甲狀腺癌預(yù)后的關(guān)系 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)還可評(píng)估PRDM家族的表達(dá)在甲狀腺癌患者中的預(yù)后。使用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù),選擇TCGA,篩選條件為:Gene symbol=PRDM1-PRDM16,TCGA dataset=thyroid cancer。選擇Survival,即可顯示PRDM家族的表達(dá)水平與甲狀腺癌患者預(yù)后的關(guān)系,可在線繪制總生存期(OS)生存曲線,計(jì)算95%可信區(qū)間(CI)、風(fēng)險(xiǎn)比(HR)和P值。

1.3預(yù)測(cè)與PRDM6有關(guān)上游miRNA HMDD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cuilab.cn/hmdd)是一個(gè)包含人類(lèi)疾病相關(guān)聯(lián)的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù),運(yùn)用HMDD數(shù)據(jù)庫(kù)可篩選出與人類(lèi)甲狀腺癌相關(guān)的miRNA。使用HMDD數(shù)據(jù)庫(kù),篩選出disease=thyroid neoplasm的miRNA。這些miRNA即為人類(lèi)甲狀腺癌相關(guān)的miRNA。StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)為一個(gè)RNA靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù),包含了多種模塊,如“miRNA-Target”“RNA-RNA”等。使用StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)可預(yù)測(cè)PRDM6相互作用的miRNA。取 StarBase和HMDD兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)交集為PRDM6在與人類(lèi)甲狀腺癌中相互作用的miRNA。

1.4預(yù)測(cè)PRDM6下游的靶基因 StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)還可以用于預(yù)測(cè)PRDM6下游的靶基因。在StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)“RNA-RNA”模塊中選擇“mRNA-RNA”,在Query Gene中輸入PRDM6為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,得出與PRDM6有關(guān)的下游靶基因。

1.5靶基因的生物學(xué)功能預(yù)測(cè) DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)是生物信息的數(shù)據(jù)庫(kù),整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具,可為大量蛋白及基因提供全面且系統(tǒng)的生物功能注釋信息。運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)與PRDM6有關(guān)的下游靶基因進(jìn)行生物學(xué)分析。篩選條件為“Enter Gene List=與PRDM6有關(guān)的下游靶基因”“Select Identifier”選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”“Select species ”中選擇“Homo sapiens”“List Type”中選擇“Gene List”。選擇數(shù)據(jù)庫(kù)基因本體論(GO)分析中的分子功能(MF)、細(xì)胞成分(CC)、生物過(guò)程(BP)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)對(duì)不同組間PRDM家族成員的差異進(jìn)行比較。應(yīng)用Kaplan-Meier法對(duì)甲狀腺癌患者進(jìn)行生存分析。使用Log Rank檢驗(yàn)比較各組間生存率,對(duì)與PRDM6有關(guān)的下游靶基因進(jìn)行GO功能注釋分析。

2 結(jié) 果

2.1PRDM家族在甲狀腺癌中表達(dá)水平 通過(guò)UALCAN網(wǎng)站分析,PRDM1、PRDM3在甲狀腺癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常組織(P<0.05)。PRDM2、PRDM4、PRDM5、PRDM6、PRDM8、PRDM10、PRDM11、PRDM15、PRDM16在甲狀腺癌組織中表達(dá)水平明顯低于正常組織(P<0.05)。PRDM7、PRDM12在甲狀腺癌組織中與正常組織差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PRDM9、PRDM13、PRDM14在UALCAN網(wǎng)站中無(wú)檢索結(jié)果。根據(jù)不同臨床病理特征進(jìn)行PRDM家族表達(dá)分析,分析在不同分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期)、不同種族(白種人、黑種人、黃種人)、不同性別(男、女)、不同年齡(21～40歲、41～60歲、61～80歲、81～100歲)、不同甲狀腺乳頭狀癌組織學(xué)亞型(經(jīng)典型、高細(xì)胞型、濾泡亞型、其他亞型)、不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0、N1)甲狀腺癌組織與正常組織表達(dá)。PRDM1在上述所有情況中明顯增高(P<0.05)。PRDM2、 PRDM5、PRDM10、 PRDM11、PRDM16五個(gè)成員在上述所有情況中明顯降低(P<0.05)。其他PRDM家族成員分別與不同臨床病理特征間存在關(guān)系。見(jiàn)表1。

2.2PRDM家族與甲狀腺癌預(yù)后分析 使用UALCAN網(wǎng)站得到的生存分析結(jié)果顯示,甲狀腺癌患者PRDM1、PRDM3(又名MECOM)高表達(dá)組總體生存時(shí)間高于低表達(dá)組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PRDM2、PRDM4、PRDM5、PRDM7、PRDM8、PRDM10、PRDM15高表達(dá)組總體生存時(shí)間均低于低表達(dá)組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PRDM6、PRDM11、PRDM12、PRDM16高表達(dá)組總體生存時(shí)間均明顯低于低表達(dá)組(P<0.05)。PRDM9、PRDM13、PRDM14在UALCAN網(wǎng)站中無(wú)檢索結(jié)果。見(jiàn)圖1、圖2。

表1 PRDM家族在正常組織及甲狀腺癌組織中表達(dá)(P值)

續(xù)表1 PRDM家族在正常組織及甲狀腺癌組織中表達(dá)(P值)

圖1 PRDM 1～15表達(dá)與甲狀腺癌患者生存分析結(jié)果

圖2 RPDM16表達(dá)與甲狀腺癌患者生存分析結(jié)果

2.3PRDM6上游miRNA預(yù)測(cè) 通過(guò)HMDD數(shù)據(jù)庫(kù)檢查得到與人類(lèi)甲狀腺癌相關(guān)的miRNA 38個(gè)。根據(jù)StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與PRDM6相互作用的miRNA 共計(jì)70個(gè)。取HMDD數(shù)據(jù)庫(kù)和StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)的交集得到6個(gè)miRNA,分別為hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-625-5p。其中在甲狀腺癌中與PRDM6相關(guān)并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNA為hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-625-5p(P<0.05)。hsa-miR-20a-5p與PRDM6表達(dá)呈正相關(guān);hsa-miR-625-5p與PRDM6表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)圖3。

圖3 PRDM6與miRNA的關(guān)聯(lián)性分析

2.4PRDM6下游靶基因預(yù)測(cè) 通過(guò)使用StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)靶基因預(yù)測(cè)模塊預(yù)測(cè)與PRDM6相互作用的下游靶基因,得到的靶基因分別為L(zhǎng)AS1L、RTEL1-TNFRSF6B、TNRC6A、MTG2、ATP5F1B、TUBA1B、ARHGAP29、MTF2、APEH、HNRNPA1P12、AL16-1909.1、EEF1A1P13、RTEL1、RNA28S5、RNA18S5、RNA18N5、GMPR2、CACTIN、UBE2D3、MPHOSPH10、CABLES1、TONSL、RPS9、GPC6。

2.5PRDM6下游靶基因的GO功能注釋 應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù),將通過(guò)StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)得到的靶基因進(jìn)行GO功能注釋。在BP中,這些基因主要參與基因重組對(duì)雙鏈損傷修復(fù)調(diào)控、DNA修復(fù)、復(fù)制叉處理等過(guò)程。CC方面主要富集于核質(zhì)。MF主要富集于RNA結(jié)合。見(jiàn)表2。

表2 預(yù)測(cè)靶基因的GO功能注釋

3 討 論

甲狀腺癌作為內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤,也是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤,其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)都呈逐年上升趨勢(shì),而且甲狀腺癌也是發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一〔14〕。甲狀腺癌患者早期常常無(wú)明顯癥狀,多數(shù)患者因健康體檢及其他疾病的相關(guān)檢查確診甲狀腺癌。甲狀腺癌具有發(fā)病率不斷升高和不顯著的臨床表現(xiàn),需要對(duì)甲狀腺癌的發(fā)生和診斷中投入更多的研究和關(guān)注。針對(duì)現(xiàn)狀,甲狀腺癌的篩查和診斷主要依據(jù)超聲和細(xì)針穿刺活檢,大多數(shù)患者可明確診斷,但仍有小部分可疑惡性患者無(wú)法確診,對(duì)于這部分患者來(lái)說(shuō),他們中的大多數(shù)選擇手術(shù)治療,但術(shù)后結(jié)果80%為良性,這部分患者接受了過(guò)度且不必要的治療。因此,仍需要提高甲狀腺癌的診斷率。近年來(lái),隨著全球科學(xué)技術(shù)水平的不斷提高,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) BRAF基因突變與非髓樣甲狀腺癌密切相關(guān),基因突變后可引起B(yǎng)RAF激酶活化,進(jìn)而促進(jìn)乳頭狀甲狀腺癌(PTC)和因PTC進(jìn)展的未分化甲狀腺癌(ATC)的發(fā)生;部分PTC病例中可發(fā)現(xiàn)RET/PTC家族易位等等。但對(duì)于甲狀腺癌的診斷仍缺乏特異性的分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。在分子生物學(xué)水平對(duì)甲狀腺癌研究,探究其發(fā)生發(fā)展機(jī)制,有望提高甲狀腺癌的診斷率、治愈率、生存率。

PRDM家族是根據(jù)結(jié)構(gòu)上N末端存在保守的PR結(jié)構(gòu)域而命名〔15,16〕。PR結(jié)構(gòu)域與SET結(jié)構(gòu)域存在相似之處〔17～19〕,SET結(jié)構(gòu)域具有組蛋白或非組蛋白底物的甲基轉(zhuǎn)移酶活性(HMTs)〔16,17,20～22〕,后者可參與基因印記、染色體失活和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種過(guò)程。因與SET結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上的同源性,故PRDM家族也具有HMTs活性,使得PRDM家族能夠直接或間接的參與基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程。PRDM家族在結(jié)構(gòu)上的第2個(gè)顯著特點(diǎn)是含有不同數(shù)目的鋅指結(jié)構(gòu),鋅指結(jié)構(gòu)是一種結(jié)構(gòu)單元,與手指相似而得名,常在DNA結(jié)合蛋白中出現(xiàn),對(duì)鋅離子具有結(jié)合功能,鋅離子能夠保持模體中α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,保證其安裝在DNA的大溝中。含有鋅指結(jié)構(gòu)的PRDM 家族成員存在DNA或RNA識(shí)別和結(jié)合的能力〔23〕,影響基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)過(guò)程。

PRDM家族成員在結(jié)構(gòu)上的獨(dú)特性表明其在功能上存在特殊作用。PRDM蛋白通過(guò)調(diào)控下游靶基因,影響細(xì)胞分化,使細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化〔24〕,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。PRDM蛋白可以影響表觀遺傳修飾和代謝穩(wěn)態(tài)等過(guò)程,對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和免疫細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持產(chǎn)生影響。其中,表觀遺傳學(xué)的主要內(nèi)容就是基因啟動(dòng)子異常甲基化。甲基化能夠引起DNA構(gòu)象、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA與蛋白質(zhì)作用方式改變,抑制基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)〔25〕。另外,大多數(shù)PRDM蛋白可以編碼出存在和不存在PR結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)主要分子變體〔20,26〕,它們是通過(guò)不同啟動(dòng)子的可變剪接或交替使用產(chǎn)生的,兩者作用截然相反,尤其在腫瘤的形成過(guò)程中,通常情況下可以觀察到二者表達(dá)不均衡,在這種狀態(tài)下,PRDM蛋白與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)〔11,27〕。PRDM蛋白的特殊結(jié)構(gòu)和功能說(shuō)明PRDM蛋白有可能作為診斷性腫瘤標(biāo)志物、治療的靶點(diǎn)和反應(yīng)生存預(yù)后的指標(biāo)。

本研究說(shuō)明,PRDM1、PRDM3對(duì)甲狀腺癌的診斷有提示作用,有可能成為甲狀腺癌的診斷性標(biāo)志物;PRDM2、PRDM4、PRDM5、PRDM6、PRDM8、PRDM10、PRDM11、PRDM15、PRDM16在甲狀腺癌組織中表達(dá)水平明顯低于正常組織,說(shuō)明以上PRDM家族成員在甲狀腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用。根據(jù)不同臨床病理特征進(jìn)行PRDM家族表達(dá)情況分析。由本研究結(jié)果可推斷,當(dāng)甲狀腺乳頭狀癌組織中PRDM3和PRDM15表達(dá)水平與正常組織相接近時(shí),病理學(xué)分型很可能為其他亞型甲狀腺乳頭狀癌;當(dāng)確診為甲狀腺乳頭狀癌時(shí),腫瘤組織中PRDM6表達(dá)水平與正常組織相接近時(shí),濾泡亞型甲狀腺乳頭狀癌可能性較大;確診為甲狀腺乳頭狀癌組織中PRDM7和PRDM12表達(dá)水平明顯高于正常組織時(shí),診斷為濾泡亞型甲狀腺乳頭狀癌可能性較大;甲狀腺癌組織中PRDM6表達(dá)降低時(shí),可能提示存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能。由本研究生存分析結(jié)果可以預(yù)測(cè)PRDM6、PRDM11、PRDM12、PRDM16與甲狀腺癌的患者預(yù)后有關(guān),若以上家族成員在甲狀腺癌中高表達(dá)可能提示著其預(yù)后不良。

由以上結(jié)果發(fā)現(xiàn),PRDM6、PRDM11、PRDM16高表達(dá)既與甲狀腺癌患者的診斷有關(guān)又與預(yù)后有關(guān)。說(shuō)明這3個(gè)成員意義重大,可探討其在甲狀腺癌中的作用機(jī)制。通過(guò)對(duì)論文檢索發(fā)現(xiàn)PRDM11和PRDM16已經(jīng)在發(fā)表論文中闡述。因此,本文只針對(duì)PRDM6作用機(jī)制進(jìn)行初步分析,預(yù)測(cè)其上游miRNA及下游靶基因,并對(duì)下游靶基因進(jìn)行GO功能注釋。本研究對(duì)與PRDM6相互作用的下游靶基因進(jìn)行GO功能注釋,發(fā)現(xiàn)這些靶基在通過(guò)基因重組對(duì)雙鏈損傷修復(fù)調(diào)控、DNA修復(fù)、復(fù)制叉處理生物過(guò)程中發(fā)揮作用,具有RNA結(jié)合的分子功能,還可參與核質(zhì)的組成。進(jìn)一步推測(cè),PRDM6可能通過(guò)以上功能參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究?jī)H通過(guò)生物信息學(xué)分析,而未經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果可能存在一定局限性。需完善研究數(shù)據(jù),開(kāi)展相關(guān)細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究,對(duì)所得出的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上,PRDM家族的表達(dá)與甲狀腺癌相關(guān),部分家族成員的表達(dá)與甲狀腺癌預(yù)后及臨床病理特征密切相關(guān)。PRDM家族成員PRDM6可通過(guò)上游miRNA及下游靶基因的相互作用,參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。PRDM家族,特別是PRDM6,可能成為甲狀腺癌診治的新靶點(diǎn)。