城鎮(zhèn)污水廠(chǎng)尾水排放對(duì)嘉陵江流域微生物群落的潛在影響

李 潤(rùn),秦明森b,李 蕾,王 瑤,唐 贇

(西華師范大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院,b.西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 南充 637009)

伴隨著我國(guó)城鎮(zhèn)化、工業(yè)化的快速發(fā)展以及城鎮(zhèn)人口規(guī)模的不斷擴(kuò)大,污水排放也不斷增加。未經(jīng)處理的城鎮(zhèn)污水會(huì)對(duì)周?chē)寥馈⑺w造成嚴(yán)重污染和生態(tài)影響。因此,如何通過(guò)污水處理,減少污水排放對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害,備受全社會(huì)和科研工作者的關(guān)注[1]。污水處理廠(chǎng)作為城鎮(zhèn)的重要基礎(chǔ)設(shè)施,通過(guò)以生物凈污為主的方式,能有效凈化城鎮(zhèn)污水,降低生態(tài)破壞。但目前受限于技術(shù)和成本,一些處理后的污水仍含有大量有機(jī)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),會(huì)增加排污口水體營(yíng)養(yǎng),進(jìn)而促進(jìn)河床生長(zhǎng)附著型藻類(lèi),影響當(dāng)?shù)厣锶郝涞慕Y(jié)構(gòu)和功能[1-2]。一些生活污水中含有微量污染物,也會(huì)對(duì)水體生物群落造成影響。2000年美國(guó)統(tǒng)計(jì)國(guó)家水質(zhì)數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn),部分污水處理廠(chǎng)的致病菌難以徹底去除,造成了污水處理廠(chǎng)附近39%的地表水受到病原微生物污染[3]。除病原微生物外,大量異源微生物也會(huì)通過(guò)相互作用,影響受納水體微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性[4-6]。微生物在河流生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色,作為主要分解者,能夠有效地降解有機(jī)物質(zhì),維持河流生態(tài)系統(tǒng)的平衡[7]。因此,進(jìn)一步調(diào)查排污水體營(yíng)養(yǎng)和微生物情況,評(píng)估城鎮(zhèn)污水對(duì)當(dāng)?shù)厮w的潛在影響很有必要,且對(duì)于潛在的生態(tài)污染風(fēng)險(xiǎn)治理具有重要的意義。

南充市常住人口556萬(wàn),是四川省人口第二大城市,全域面積1.25萬(wàn)km2。嘉陵江中游流經(jīng)該市,是全市生活、農(nóng)業(yè)、工業(yè)用水的主要來(lái)源,也是承接全市污水排放的主要河流,探究該段城鎮(zhèn)污水對(duì)嘉陵江的潛在生態(tài)危害,對(duì)于保持嘉陵江生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性和功能具有重要意義。基于此,本研究選擇嘉陵江南充段流域的8個(gè)污水處理廠(chǎng),采集污水處理廠(chǎng)進(jìn)水、尾水和附近水的水體樣品,通過(guò)測(cè)定理化性質(zhì)和微生物群落,判斷城鎮(zhèn)生活污水排放對(duì)嘉陵江流域微生物的潛在影響,從而為嘉陵江流域的生態(tài)保護(hù)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)分布與樣品采集

通過(guò)前期調(diào)查,選取了尾水排放至嘉陵江南充段的8個(gè)污水處理廠(chǎng),且污水處理廠(chǎng)位于南充市的主要區(qū)縣。于2021年12月采集各污水處理廠(chǎng)的進(jìn)水、尾水以及排污口下游200～300 m范圍5～10 cm的表層水(后文簡(jiǎn)稱(chēng)附近水)樣品,采樣點(diǎn)信息見(jiàn)表1和圖1,其中污水廠(chǎng)K尾水排至嘉陵江支流,對(duì)應(yīng)的附近水為支流水樣。每個(gè)樣點(diǎn)后綴1、2、3對(duì)應(yīng)進(jìn)水、尾水和附近水樣品,比如B1、B2、B3分別代表污水廠(chǎng)B的進(jìn)水、尾水和附近水。使用污水采樣器采集進(jìn)水、尾水樣品,每個(gè)樣點(diǎn)采集3次,采集后均裝入同一個(gè)已消毒的2.5 L聚乙烯塑料桶;利用便攜式采樣器采集附近水樣品,同樣采集3次后裝入已消毒的2.5 L聚乙烯塑料桶;采樣后2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室放置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 各采樣點(diǎn)信息及編號(hào)Table 1 Information and serial number of each sampling site

1.2 理化性質(zhì)的測(cè)定

1.3 高通量測(cè)序

取1 L水樣以孔徑為0.22 μm的微孔濾膜進(jìn)行抽濾后,將濾膜置于離心管于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋ袨V膜樣品用干冰冷藏寄送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行DNA提取和目標(biāo)片段的高通量測(cè)序。擴(kuò)增目標(biāo)片段為細(xì)菌16S rRNA基因的V4—V5區(qū),引物為515F/907R[9]。高通量測(cè)序采用Illumina NovaSeq 6000測(cè)序平臺(tái),所得原始序列通過(guò)拼接、過(guò)濾、去除冗余序列,得到有效序列。根據(jù)97%的相似性對(duì)有效序列進(jìn)行聚類(lèi),獲得可操作分類(lèi)單元(Operational Taxonomic Units,OTU)及其豐度。使用Silva(Release138,http://www.arb_silva.de)對(duì)OTU進(jìn)行物種鑒定,保留細(xì)菌OTU,并抽平到統(tǒng)一reads深度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究主要分析均在R語(yǔ)言平臺(tái)進(jìn)行。使用“vegan”軟件包計(jì)算微生物α多樣性指數(shù),包括豐富度、均勻度、香農(nóng)威納指數(shù)、辛普森指數(shù)、Chao1指數(shù)以及Ace指數(shù)。微生物β多樣性分析使用“vegan”軟件包進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)。采用Excel 2021處理數(shù)據(jù),考慮到樣品均按照污水處理廠(chǎng)進(jìn)行配對(duì)采樣,故用IBM SPSS Statistics 26.0 軟件上的配對(duì)T檢驗(yàn)分析比較不同水體之間理化和微生物多樣性的差異,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體理化情況

2.2 高通量測(cè)序結(jié)果

高通量測(cè)序結(jié)果顯示:24個(gè)水體樣本共計(jì)得到有效序列884 448條,按最小樣本序列數(shù)36 852抽平分析。序列經(jīng)過(guò)對(duì)比注釋后,得到符合要求的細(xì)菌OTU共6 404個(gè),隸屬57門(mén)161綱410目702科1 428屬2 908種。進(jìn)水中特有OTU共227個(gè),尾水中特有OTU共2 529個(gè),附近水特有OTU共750個(gè),三者共有的OTU有1 022個(gè),進(jìn)水、尾水共有的OTU為1 179個(gè),進(jìn)水與附近水共有的OTU為34個(gè),尾水與附近水共有的OTU為698個(gè)(圖3)。

2.3 微生物群落組成

對(duì)不同采樣點(diǎn)微生物門(mén)分析發(fā)現(xiàn),隨嘉陵江自上而下微生物主要門(mén)的變化無(wú)明顯規(guī)律(圖4)。污水廠(chǎng)進(jìn)水、尾水、附近水水體中的微生物均以變形菌門(mén)(Proteobacteria)為主(圖5a),其在進(jìn)水中的相對(duì)豐度顯著高于尾水(P=0.043)。進(jìn)水中相對(duì)豐度較高還有厚壁菌門(mén)(Firmicutes),其相對(duì)豐度顯著高于尾水(P=0.001)和附近水(P<0.001)。尾水中相對(duì)豐度較高的有擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)、厚壁菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteriota)、Patescibacteria、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi),其中擬桿菌門(mén)顯著高于進(jìn)水(P=0.037)、Patescibacteria和綠彎菌門(mén)顯著高于進(jìn)水和附近水(P<0.001)。附近水中相對(duì)豐度較高的包括放線(xiàn)菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)、擬桿菌門(mén),其中藍(lán)細(xì)菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)的相對(duì)豐度均顯著高于進(jìn)水(P=0.010,P=0.001)和尾水(P=0.014,P=0.012)。

對(duì)污水廠(chǎng)進(jìn)水、尾水、附近水前六的優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行比較(圖5b)發(fā)現(xiàn),進(jìn)水中相對(duì)豐度最高的屬為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter),其相對(duì)豐度顯著高于尾水及附近水(P<0.001);尾水中相對(duì)豐度最高的為從毛單胞菌屬(Comamonadaceae),但其相對(duì)豐度僅顯著高于進(jìn)水(P=0.007);附近水中相對(duì)豐度最高的為Chloroplast,其相對(duì)豐度顯著高于進(jìn)水(P=0.011)和尾水(P=0.012)。此外,與附近水相比,進(jìn)水中水棲菌屬(Enhydrobacter)、毛球菌屬(Trichococcus)、擬桿菌屬(Bacteroides)的相對(duì)豐度更高,而尾水中Saccharimonadales、擬桿菌屬、氣單胞菌屬(Aeromonas)相對(duì)豐度更高。

微生物群落的主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示(圖7):第一主成分(PC1)的貢獻(xiàn)率是38.02%,第二主成分(PC2)的貢獻(xiàn)率是21.87%。結(jié)果表明,污水處理廠(chǎng)進(jìn)水、尾水、附近水的水樣之間的微生物群落組成具有差異性,而不同污水廠(chǎng)相同位置水中的微生物物種組成較為接近。

2.4 微生物群落多樣性

3 討 論

本研究顯示,尾水特有OTU有2 529個(gè),而附近水特有的OTU僅有750個(gè),且尾水中微生物群落多樣性顯著高于附近水以及進(jìn)水。這是因?yàn)?一方面,本研究的污水處理廠(chǎng)均用活性污泥法去除污水中的營(yíng)養(yǎng)物,而活性污泥中的大量微生物會(huì)在去污過(guò)程中進(jìn)入污水處理系統(tǒng),并隨尾水排出;另一方面,尾水與進(jìn)水共有OTU有2 201個(gè),占進(jìn)水OTU的89.40%,這一結(jié)果與進(jìn)水的微生物會(huì)進(jìn)入污水處理系統(tǒng),并在尾水中蓄積[12]相符合,從而增加了污水處理系統(tǒng)的微生物多樣性。同時(shí),尾水中高特異的微生物將隨排污進(jìn)入到嘉陵江,這在理論上能增加水體中生物群落多樣性,而通過(guò)微生物相互作用,可能會(huì)引起自然水體微生物群落的改變[13],但其具體影響效應(yīng)還需要進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)在門(mén)分類(lèi)水平上,污水廠(chǎng)進(jìn)水、尾水、附近水中變形菌門(mén)是第一優(yōu)勢(shì)菌門(mén),其他廢水、湖泊、河流的水體微生物研究也有類(lèi)似結(jié)果[14-16]。這是因?yàn)樽冃尉T(mén)含有大量的光營(yíng)養(yǎng)型、化能自養(yǎng)型和化能異養(yǎng)型細(xì)菌,該類(lèi)群不僅能利用污水中的有機(jī)物,還可以利用河流、湖泊中的氮和磷等污染物[16-17],在各種水體環(huán)境中均具有較強(qiáng)的適應(yīng)性。相較于附近水,厚壁菌門(mén)在進(jìn)水和尾水中相對(duì)豐度更高,這是因?yàn)樵诩S便中厚壁菌門(mén)為最主要的微生物類(lèi)群,它能進(jìn)入污水系統(tǒng),從而在進(jìn)水中具有較高的豐度[18];另一方面,它本身能較好地適應(yīng)厭氧和高營(yíng)養(yǎng)環(huán)境,可以水解污水中的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物等大分子物質(zhì),也是污水處理系統(tǒng)中常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)菌[19]。另外,在自然水體的研究中發(fā)現(xiàn),淡水水體中厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度一旦超過(guò)1%時(shí),便指示水體已經(jīng)受到了污染[20],而本研究中附近水厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度不足1%,這在一定方面上說(shuō)明嘉陵江南充段水體受污染程度較低。藍(lán)細(xì)菌門(mén)在附近水中顯著高于尾水,這是因?yàn)樗{(lán)細(xì)菌門(mén)是一類(lèi)依靠產(chǎn)氧光合作用獲取能量的細(xì)菌,一般多存在于淡水水體中[21-23],而污水處理系統(tǒng)中較高的營(yíng)養(yǎng)以及密閉環(huán)境不利于藍(lán)細(xì)菌生長(zhǎng)。放線(xiàn)菌門(mén)的相對(duì)豐度在附近水中高于進(jìn)水和尾水,這與其適應(yīng)自然水體環(huán)境,具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)有關(guān)[24]。在屬分類(lèi)水平上,進(jìn)水中相對(duì)豐度最高的為不動(dòng)桿菌屬,占總豐度的44%。這是因?yàn)樵摼鷮倨酶粻I(yíng)養(yǎng)水體[25],而進(jìn)水中有機(jī)物、氮、磷等都較高,有利于該菌的生長(zhǎng)發(fā)育。此外,不動(dòng)桿菌相對(duì)豐度在尾水和附近水中相當(dāng),說(shuō)明沿岸的污水處理廠(chǎng)能夠有效去除不動(dòng)桿菌,而考慮到有報(bào)道稱(chēng)污水中的不動(dòng)桿菌包含多種新興致病菌[26],在現(xiàn)有污水處理工藝的基礎(chǔ)上,應(yīng)該進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)它的去除效果,并檢測(cè)可能出現(xiàn)的新興致病菌種類(lèi)。尾水中的優(yōu)勢(shì)菌屬氣單胞菌屬是活性污泥中常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)菌和重要功能菌,能參與污水處理系統(tǒng)中的有機(jī)物、氮磷降解[27]。本文發(fā)現(xiàn),hgcl_clade、CL500-29_marine_group是附近水中的優(yōu)勢(shì)屬,這兩類(lèi)菌能吸收利用水體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),有改善水質(zhì)的作用[28-29],并在多種淡水環(huán)境中也為主要的優(yōu)勢(shì)菌群[28,30]。

4 結(jié) 論

本研究分析了嘉陵江流域上污水處理廠(chǎng)進(jìn)水、尾水、附近水的水體營(yíng)養(yǎng)以及微生物群落情況,結(jié)果表明嘉陵江南充段主要的污水處理廠(chǎng)能顯著降低進(jìn)水的水體營(yíng)養(yǎng),改變進(jìn)水中微生物群落組成,增加微生物多樣性。對(duì)比自然水體發(fā)現(xiàn),污水廠(chǎng)尾水營(yíng)養(yǎng)依舊較高,且水體微生物群落多樣性也更高,其群落含有較多的特有微生物類(lèi)群。同時(shí),本研究結(jié)果也指出,自然水體微生物群落多樣性和主要的屬與水體理化關(guān)系密切,其群落受水體理化的影響更大。綜合來(lái)看,嘉陵江南充段主要的污水處理廠(chǎng)的尾水排放,能通過(guò)直接輸入異源微生物和改變自然水體理化,對(duì)嘉陵江水體微生物造成潛在的影響,需進(jìn)一步降低水體營(yíng)養(yǎng)以及尾水的微生物。