連翹半日花烷型二萜和生物堿類化合物及其抗病毒活性

摘要：研究連翹抗炎、抗病毒活性部位中的化學成分及其抗病毒活性。通過綜合運用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜及高效制備色譜等方法對連翹中的化合物進行分離純化，并根據(jù)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)對化合物的結(jié)構(gòu)進行鑒定，采用MTT法對得到的部分化合物進行抗病毒活性研究。結(jié)果表明，從連翹體積分數(shù)95%乙醇提取物的氯仿部位和乙酸乙酯部位分離得到9個半日花烷型二萜和6個生物堿類化合物。9個半日花烷型二萜分別為：19-hydroxy-ent-labda-8（17）， 13E-dien-15-oic acid （1）；ent-labda-8（17）， 13Z-dien-15， 19-dioic acid （2）；ent-labda-8（17），13E-dien-15，19-dioic acid （3）；3β-hydroxy-8（17），13E-labdadien-15-oic acid （4）；enantio-labda-8（20），13E-dien-15，18-dioic acid （5）；Forsyshiyanin A （6）；Forsyshiyanin B （7）；18-hydroxy-7-oxolabda-8（9），13E-diene-15-oic acid （8）；3-hydroxy-8（17），13E-labdadien-15-oic acid （9）。6個生物堿類化合物分別為：Forsyshiyanine A （10）；（7R）-6，7-dihydro-7-methyl-5H-cyclopenta[c]pyridine （11）；Forsyshiyanine B （12）；（－）-bicuculline （13）；（－）-egenine （14）；（－）-7'-O-methylegenine （15）。其中化合物10、12為首次從連翹中發(fā)現(xiàn)，也是首次從連翹屬植物中發(fā)現(xiàn)。MTT結(jié)果顯示，化合物1、2、10、12對于H1N1流感病毒以及呼吸道合胞病毒的增長具有抑制作用。

關(guān)鍵詞：連翹；半日花烷型二萜；生物堿；抗病毒活性

中圖分類號：R284 " " " " " " " "文獻標志碼：A

連翹（Forsythia suspensa Thunb.vahl）為木犀科（Oleaceae）連翹屬落葉灌木植物，主要分布在陜西、山西、河北、山東、安徽、湖南等地，其果實是一味常見的中藥，于1963年收錄至《中國藥典》。連翹味苦，性微寒，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風熱的功效，臨床常用于治療癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒、風熱感冒、溫病初起、溫熱入營、高熱煩渴、神昏發(fā)斑、熱淋澀痛等癥狀[1]。

連翹中的化學成分眾多，包括苯乙醇苷類、木脂素類、酚酸類、萜類及揮發(fā)油等，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、保肝等活性，但目前的研究大多集中于苯乙醇苷類和木脂素類化合物等含量豐富的化學成分，對于萜類和生物堿類等含量較少的化合物研究得并不多[2]。本課題組在早期研究中[3]，以血小板活化因子（PFA）誘導(dǎo)的大鼠多形核白細胞釋放β-葡萄糖酸苷酶為模型和以H1N1病毒感染的犬腎上皮細胞（MDCK）及呼吸道合包病毒（RSV）感染的喉癌細胞（Hep-2）為模型，發(fā)現(xiàn)連翹95%（體積分數(shù)）乙醇提取物的氯仿部位具有較好的抗炎、抗病毒活性，再借助多種色譜分離手段，從中得到了4個抗炎抗病毒活性良好的生物堿單體。在此基礎(chǔ)上，本研究繼續(xù)對連翹95%（體積分數(shù)）乙醇提取物的氯仿部位和乙酸乙酯部位進行進一步分離和純化，以獲得其中的主要化學成分，并對其進行結(jié)構(gòu)鑒定，最后再對其中的部分化合物進行抗病毒活性研究，為開發(fā)新型抗病毒藥物奠定理論基礎(chǔ)。

1儀器與材料

Autospec-Ultima ETOF 型質(zhì)譜儀（英國Micromass公司）；AVANCE IIITM 400型核磁共振儀（TMS為內(nèi)標，日本電子株式會社）；30～60目聚酰胺（上海今瑞化工產(chǎn)品有限公司）；Sephadex LH-20柱色譜（北京金歐亞科技發(fā)展有限公司）；島津UV240型紫外光譜儀（日本島津公司）；Perkin-Elmer 683型紅外光譜儀（美國Perkin Elmer公司）；GF254薄層色譜硅膠，200～300目、51～70 μm柱色譜硅膠，20×20 cm高效制備薄層硅膠板（青島海洋化工有限公司）；乙醇，氨水，鹽酸（分析純，煙臺魯陽化工有限公司）；石油醚，乙酸乙酯（分析純，天津富宇化工有限公司）；氯仿，丙酮（分析純，煙臺三和化學試劑有限公司）；環(huán)己烷，正丁醇（分析純，天津市優(yōu)譜化學試劑有限公司）。連翹采購自河南省，經(jīng)煙臺大學藥學院生藥教研室趙燕燕老師鑒定，標本保存于煙臺大學藥學院標本室。

2提取與分離

取連翹成熟干燥果實30.0 kg，粉碎后用95%（體積分數(shù)）乙醇回流提取3次，每次2 h。合并提取液，減壓濃縮，得到總浸膏13.1 kg。將浸膏懸浮于水中，用石油醚進行脫色處理，繼而用2%的鹽酸進行萃取。

取酸水層加入氨水調(diào)節(jié)pH至10，后用氯仿進行萃取，合并氯仿部位減壓濃縮得到浸膏（10.4 g）。浸膏通過硅膠柱（4 cm×100 cm）色譜分離，經(jīng)環(huán)己烷-丙酮（體積比95∶5→50∶50）溶劑系統(tǒng)進行梯度洗脫，共得到10個流分（Fr. A1～Fr. A10）。對其中得到的3個主要流分（Fr. A6（2.1 g）、Fr. A7（1.9 g）、Fr. A8（2.9 g））分別經(jīng)過葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜（95%乙醇-乙酸乙酯，體積比1∶1）除去色素，再將Fr. A6經(jīng)過反復(fù)的分離與純化處理后（展開劑V環(huán)己烷∶V丙酮=75∶25），得到化合物10（21 mg）、11（41 mg）；Fr. A7經(jīng)過處理后（展開劑V氯仿∶V丙酮=85∶15），得到化合物12（31 mg）；Fr. A8經(jīng)過處理后（展開劑V氯仿∶V丙酮=90∶10；V環(huán)己烷∶V乙酸乙酯=70∶30），得到化合物13（23 mg）、14（16 mg）、15（22 mg）。

將連翹酸萃取不溶部分進行減壓濃縮，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇反復(fù)萃取，萃取液分別合并，減壓濃縮。乙酸乙酯部位經(jīng)過聚酰胺柱色譜分離，然后分別用去離子水、60%（體積分數(shù)）乙醇洗脫，60%（體積分數(shù)）乙醇洗脫液減壓濃縮，得到浸膏174.5 g。該浸膏通過硅膠柱（10 cm×120 cm）色譜分離，經(jīng)環(huán)己烷-丙酮（體積比95∶5→50∶50）梯度洗脫，共得到20個流分（Fr. B1～Fr. B20）。對其中得到的主要流分進行進一步分離與純化。Fr. B6（15.3 g）經(jīng)過硅膠柱色譜分離、氯仿-丙酮（體積比97∶3→80∶20）梯度洗脫、薄層色譜分析后，合并相同部分，得到Fr. B6.1～Fr. B6.6。對其中的2個主要流分（Fr. B6.5（4.4 g）、Fr. B6.6（5.3 g））分別經(jīng)過葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜（95%乙醇-乙酸乙酯，體積比1∶1）除去色素，F(xiàn)r. B6.5經(jīng)過處理后（展開劑V氯仿∶V甲醇=95∶5；V環(huán)己烷∶V乙酸乙酯=80∶20），得到化合物1（24 mg）、2（21 mg）；Fr. B6.6 經(jīng)過處理后（V氯仿∶V丙酮=85∶15；V環(huán)己烷∶V乙酸乙酯=70∶30），得到化合物3（32 mg）、4（25 mg）、5（22 mg）。Fr. B7（19.4 g）經(jīng)過硅膠柱色譜分離，經(jīng)氯仿-丙酮（體積比97∶3→76∶24）梯度洗脫、薄層色譜分析后，合并相同部分，得到Fr. B7.1～Fr. B7.5。對其中的2個主要流分（Fr. B7.4（5.4 g）、Fr. B7.5（6.3 g））分別經(jīng)過葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜（95%乙醇-乙酸乙酯，體積比1∶1）除去色素，F(xiàn)r. B7.4經(jīng)過處理后（展開劑V氯仿∶V丙酮=75∶25），得到化合物6（15 mg）、8（24 mg）；Fr. B7.5 經(jīng)過處理后（展開劑V氯仿∶V丙酮=80∶20；V環(huán)己烷∶V乙酸乙酯=70∶30），得到化合物7（31 mg）、9（34 mg）。化合物通過核磁共振氫譜和核磁共振碳譜等方法進行結(jié)構(gòu)鑒定，得到其化學結(jié)構(gòu)，如圖1。

3結(jié)構(gòu)鑒定

對上述分離得到的15個化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定。

化合物1 "無色方晶（丙酮）。ESI-MS m/z： 321.2102 [M + H]+ ;分子式為C20H32O3。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ： 5.52 （1H， s， H-14）， 4.81 （1H， s， H-17a）， 4.48 （1H， s， H-17b）， 3.50 （1H， dd， J = 10.7， 5.6 Hz， H-19a）， 3.09 （1H， dd， J = 10.7， 5.6 Hz， H-19b）， 2.35～2.32 （1H， m， H-7a）， 2.21～2.17 （1H， m， H-12b）， 2.07 （3H， s， C16-CH3）， 1.93～1.91 （1H， m， H-12a）， 1.89～1.86 （1H， m， H-7b）， 1.85～1.83 （1H， m， H-3a）， 1.77～1.74 （1H， m， H-1a）， 1.73～1.70 （1H， m， H-6a）， 1.65～1.63 （1H， m， H-11a）， 1.57 （1H， m， H-9）， 1.49～1.46 （1H， m， H-2b）， 1.44～1.42 （1H， m， H-11b）， 1.40～1.38 （1H， m， H-2）， 1.29～1.27 （1H， m， H-6b）， 1.20 （1H， dd， J = 1.8， 12.9 Hz， H-5）， 1.00 （1H， dt， H-1b）， 0.87 （3H， s， C18-CH3）， 0.80～0.78 （1H， m， H-3b）， 0.61 （3H， s， C20-CH3）。13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6） δ： 167.9 （C-15）、159.7 （C-13）、148.3 （C-8）、116.4 （C-14）、107.0 （C-17）、62.9 （C-19）、56.1 （C-5）、56.0 （C-9）、39.6 （C-10， 12）、39.0 （C-4， 1）、38.6 （C-7）、35.6 （C-3）、28.0 （C-18）、24.5 （C-6）、21.8 （C-11）、19.1 （C-2）、18.8 （C-16）、15.6 （C-20）。與19-hydroxy-ent-labda-8（17），13E-dien-15-oic acid標準品共薄層，二者Rf值完全相同。綜合上述理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻[4]報道，鑒定化合物1為19-hydroxy-ent-labda-8（17）， 13E-dien-15-oic acid。

化合物2 "無色結(jié)晶（甲醇）。ESI-MS m/z： 335.2337 [M + H]+;分子式為C20H30O4。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ： 5.62 （1H， s， H-14）， 4.85 （1H， s， H-17b）， 4.68 （1H， s， H-17a）， 2.52～2.50 （1H， m， H-12a）， 2.42～2.39 （1H， m， H-12b）， 2.36～2.33 （1H， m， H-7a）， 2.07 （3H， d， J = 1.2 Hz， C16-CH3）， 2.04～2.01 （1H， m， H-3a）， 1.92～1.90 （1H， m， H-6a）， 1.91～1.88 （1H， m， H-7b）， 1.81～1.79 （1H， m， H-1a）， 1.79～1.76 （1H， m， H-2a）， 1.78～1.74 （1H， m， H-6b）， 1.62 （1H， m， H-9）， 1.59～1.56 （1H， m， H-11a）， 1.49～1.45 （1H， m， H-11b）， 1.45～1.42 （1H， m， H-2b）， 1.32 （1H， dd， J = 12.2， 2.5 Hz， H-5）， 1.14 （3H， s， C18-CH3）， 1.09～1.06 （1H， m， H-1b）， 1.03～1.01 （1H， m， H-3b）， 0.55 （3H， s， C20-CH3）。13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6） δ： 178.8 （C-19）、167.4 （C-15）、159.9 （C-13）、148.3 （C-8）、117.0 （C-14）、106.9 （C-17）、56.2 （C-9）、55.6 （C-5）、43.8 （C-4）、40.6 （C-10）、39.0 （C-1）、38.6 （C-7）、38.2 （C-3）、32.5 （C-12）、29.1 （C-18）、26.3 （C-6）、25.4 （C-16）、22.5 （C-11）、20.1 （C-2）、13.1 （C-20）。與ent-labda-8（17）， 13Z-dien-15， 19-dioic acid標準品共薄層，二者Rf值完全相同。綜合以上理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻報道[5]鑒定化合物 2為ent-labda-8（17）， 13Z-dien-15， 19-dioic acid。

化合物3 "無色方晶（甲醇）。ESI-MS m/z： 335.2363 [M + H]+;分子式為C20H30O4。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ： 5.51 （1H， d， J = 1.2 Hz， H-14）， 4.83 （1H， s， H-17a）， 4.49 （1H， s， H-17b）， 2.31～2.28 （1H， m， H-7a）， 2.21～2.28 （1H， m， H-12a）， 2.05 （3H， d， J = 1.2 Hz， C16-CH3）， 2.00～1.97 （1H， m， H-3a）， 1.95～1.92 （1H， m， H-12b）， 1.92～1.90 （1H， m， H-6a）， 1.85～1.82 （1H， m， H-7b）， 1.80～1.77 （1H， m， H-2a）， 1.78～1.75 （1H， m， H-6b）， 1.76～1.74 （1H， m， H-1a）， 1.65～1.62 （1H， m， H-11b）， 1.56 （1H， m， H-9）， 1.46～1.43 （1H， m， H-11a）， 1.43～1.40 （1H， m， H-2b）， 1.31 （1H， dd， J = 12.3， 2.5 Hz， H-5）， 1.11 （3H， s， C18-CH3）， 1.05 （1H， m， H-1b）， 1.02～0.99 （1H， m， H-3b）， 0.61 （3H， s， C20-CH3）。13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6） δ： 178.8 （C-19）、167.9 （C-15）、159.7 （C-13）、148.3 （C-8）、116.4 （C-14）、107.0 （C-17）、54.5 （C-5）、53.8 （C-9）、43.8 （C-4）、40.4 （C-10）、39.3 （C-12）、39.1 （C-1）、38.6 （C-7）、38.2 （C-3）、28.9 （C-18）、24.2 （C-6）、21.8 （C-11）、20.2 （C-2）、18.8 （C-16）、14.8 （C-20）。與ent-labda-8（17）， 13E-dien-15， 19-dioic acid標準品共薄層，二者Rf值完全相同。基于以上理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻的報道[5]鑒定化合物3為ent-labda-8（17）， 13E-dien-15， 19-dioic acid。

化合物4 "無色結(jié)晶（甲醇）。ESI-MS m/z： 321.2348 [M + H]+;分子式為C20H32O3。1H-NMR （400 MHz， CDCl3） δ： 11.76～11.74 （1H， m， H-1a）， 5.60 （1H， s， H-14）， 4.91 （1H， s， H-17a）， 4.55 （1H， s， H-17b）， 3.32 （1H， dd， J = 11.2， 4.1 Hz， H-3）， 2.42～2.39 （1H， m， H-7a）， 2.32～2.30 （1H， m， H-12a）， 2.32～2.30 （1H， m， H-12b）， 2.08 （3H， d， J = 1.2 Hz， C16-CH3）， 1.96 （1H， m， H-7b）， 1.76 （1H， m， H-6a）， 1.71～1.69 （2H， m， H-2）， 1.64 （1H， m， H-11a）， 1.45 （1H， m， H-9，11b）， 1.40 （1H， m， H-6b）， 1.15 （1H， dt， J= 12.8， 3.6 Hz， H-1b）， 1.09 （1H， dd， J = 2.6， 12.2 Hz ，H-5）， 0.94 （3H， s， C18-CH3）， 0.71 （3H， s， C19-CH3）， 0.66 （3H， s， C20-CH3）。13C-NMR （100 MHz， CDCl3） δ： 171.5 （C-15）、159.9 （C-13）、147.6 （C-8）、114.9 （C-14）、106.8 （C-17）、78.9 （C-3）、55.8 （C-9）、54.6 （C-5）、40.0 （C-12）、39.5 （C-10）、39.2 （C-4）、38.1 （C-7）、37.1 （C-1）、28.5 （C-18）、27.9 （C-2）、24.1 （C-6）、21.7 （C-11）、19.2 （C-16）、15.5 （C-19）、14.5 （C-20）。基于以上理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻報道[6]鑒定化合物4為3β-hydroxy-8（17）， 13E-labdadien-15-oic acid。

化合物5 "無色結(jié)晶（甲醇）。ESI-MS m/z： 335.2442 [M + H]+;分子式為C20H30O4。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ： 5.53 （1H， s， H-14）， 4.51 （1H， s， H-17a）， 4.48 （1H， s， H-17b）， 2.36～2.32 （1H， m， H-7a）， 2.17～2.15 （1H， m， H-12a）， 2.06 （3H， d， J = 1.1 Hz， C16-CH3）， 1.97～1.93 （1H， m， H-12b）， 1.93～1.91 （1H， m， H-7b）， 1.86 （1H， dd， J = 12.4， 2.8 Hz， H-5）， 1.75～1.72 （1H， m， H-1a）， 1.65～1.62 （1H， m， H-9）， 1.64～1.62 （1H， m， H-11a）， 1.56～1.52 （2H， m， H-2）， 1.52～1.49 （2H， m， H-3）， 1.47 （1H， m， H-11b）， 1.39 （1H， m， H-6a）， 1.24 （1H， m， H-6b）， 1.05 （1H， m， H-1b）， 1.01 （3H， s， C18-CH3）， 0.65 （3H， s， C20-CH3）。13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6） δ： 180.1 （C-19）、168.0 （C-15）、159.5 （C-13）、148.0 （C-8）、116.6 （C-14）、107.6 （C-17）、56.1 （C-9）、49.8 （C-5）、47.1 （C-4）、39.6 （C-12）、39.1 （C-10）、38.1 （C-1）、37.7 （C-7）、37.1 （C-3）、26.8 （C-6）、21.5 （C-11）、18.8 （C-16）、18.6 （C-2）、17.0 （C-18）、15.0 （C-20）。基于以上理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)，并結(jié)合文獻報道[7]，鑒定化合物5為enantio-labda-8（20）， 13E-dien-15， 18-dioic acid。

化合物6 "無色結(jié)晶（丙酮）。ESI-MS m/z： 349.2004 [M + H]+;分子式為C20H28O5。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ： 12.14 （2H， br s， C15，18-COOH）， 5.70 （1H， br s， H-14）， 2.84 （1H， dd， J = 17.3， 14.8 Hz， H-6a）， 2.80 （2H， m， H-11）， 2.50 （1H， dd， J = 17.3， 3.5 Hz，H-6b）， 2.35～2.31 （1H， m， H-12a）， 2.24～2.20 （1H， m， H-12b）， 2.14 （3H， s， C16-CH3）， 2.04 （1H， m， H-3a）， 1.95 （1H， m， H-1a）， 1.85 （1H， m， H-2a）， 1.82 （1H， dd， J = 14.7， 3.2 Hz， H-5）， 1.71 （3H， s， C17-CH3）， 1.52 （1H， m， H-2b）， 1.35 （1H， td， J = 13.2， 4.0 Hz， H-1b）， 1.14 （3H， s， C19-CH3）， 1.04 （1H， td， J = 12.8， 3.6 Hz， H-3b）， 0.96 （3H， s， C20-CH3）。13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6） δ： 199.2 （C-7）、168.0 （C-18）、167.8 （C-15）、165.5 （C-9）、158.4 （C-13）、131.2 （C-8）、116.9 （C-14）、49.9 （C-5）、43.7 （C-4）、42.1 （C-10）、39.6 （C-12）、37.1 （C-3）、36.5 （C-6）、35.8 （C-1）、31.5 （C-11）、28.3 （C-19）、19.5 （C-2）、18.6 （C-16）、16.0 （C-20）、11.5 （C-17）。與Forsyshiyanin A標準品共薄層，二者Rf值完全相同。綜合以上理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)，并參考文獻[8]報道鑒定該化合物為Forsyshiyanin A。

化合物7 "無色方晶（丙酮）。ESI-MS m/z： 337.2363 [M+H]+;分子式為C20H32O4。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ： 11.99 （1H， br s， C15-COOH）， 5.58 （1H， br s， H-14）， 4.93 （1H， s， H-17a）， 4.58 （1H， br s， 18-OH）， 4.54 （1H， s， H-17b）， 4.20～4.16 （1H， m， H-7）， 4.14 （1H， br s， 7-OH）， 3.50 （1H， d， J = 10.8 Hz， H-18a）， 3.09 （1H， d， J = 10.8 Hz， H-18b）， 2.17 （1H， m， H-12a）， 2.10 （1H， m， H-9）， 2.08 （3H， s， C16-CH3）， 1.90 （1H， m， H-12b）， 1.80 （1H， m， H-3a）， 1.77 （1H， m， H-6a）， 1.71 （1H， dd， J = 17.1， 2.0 Hz， H-5）， 1.69 （1H， m， H-1a）， 1.50 （1H， m， H-2a）， 1.47 （1H， m， H-2b）， 1.45 （1H， m， H-6b）， 1.43 （1H， m， H-11a）， 1.39 （1H， m， H-11b）， 1.03 （1H， td， J = 13.2， 4.4 Hz， H-1b）， 0.88 （1H， m， H-3b）， 0.84 （3H， s， C19-CH3）， 0.59 （3H， s， C20-CH3）。13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6） δ： 168.0 （C-15）、159.9 （C-13）、150.9 （C-8）、116.4 （C-14）、108.0 （C-17）、72.3 （C-7）、63.1 （C-18）、50.3 （C-9）、48.0 （C-4）、39.8 （C-5）、39.2 （C-12）、39.0 （C-1）、38.5 （C-10）、35.9 （C-3）、31.7 （C-6）、27.8 （C-19）、21.5 （C-11）、19.3 （C-2）、18.9 （C-16）、14.7 （C-20）。與Forsyshiyanin B標準品共薄層，二者Rf值完全相同。基于以上理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)，并參考文獻[8]報道，鑒定化合物為Forsyshiyanin B。

化合物8 "無色方晶（丙酮）。ESI-MS m/z： 335.2473 [M+H]+;分子式為C20H30O4。1H-NMR （400 MHz， CDCl3） δ： 11.98 （1H， br s， -COOH）， 5.59 （1H， br s， H-14）， 4.36 （1H， br s， -OH）， 3.40 （1H， dd， J = 10.8， 4.5 Hz， H-18a）， 3.08 （1H， d， J = 10.8， 4.5 Hz， H-18b）， 2.49 （1H， m， H-6a）， 2.39 （1H， dd， J = 17.3， 3.4Hz， H-6b）， 2.30 （1H， m， H-11a）， 2.27 （1H， m， H-11b）， 2.22 （2H， m， H-12）， 2.09 （3H， s， C16-CH3）， 1.90 （1H， m， H-1a）， 1.78 （1H， m， H-3a）， 1.74 （1H， dd， J = 14.2， 3.2 Hz， H-5）， 1.64 （3H， s， C17-CH3）， 1.60 （1H， m， H-2a）， 1.47 （1H， m， H-2b）， 1.33 （1H， m， H-1b）， 1.03 （3H， s， C20-CH3）， 0.97～0.93 （1H， m， H-3b）， 0.87 （3H， s， C19-CH3）。13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6） δ： 199.3 （C-7）、167.8 （C-15）、167.1 （C-9）、159.9 （C-13）、132.2 （C-8）、116.3 （C-14）、63.1 （C-18）、48.0 （C-5）、39.8 （C-4）、39.2 （C-12）、38.5 （C-10）、36.0 （C-1）、35.5 （C-6）、35.4 （C-3）、27.8 （C-11）、27.4 （C-19）、19.2 （C-2）、18.9 （C-16）、18.7 （C-20）、11.9 （C-17）。綜合以上理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻[9]的報道，鑒定化合物為18-hydroxy-7-oxolabda-8（9）， 13E-dien-15-oic acid。

化合物9 "無色針晶（丙酮）。ESI-MS m/z： 321.2481 [M+H]+;分子式為C20H32O3。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ： 11.98 （1H， br s， -COOH）， 5.63 （1H， s， H-14）， 4.84 （1H， s， H-17a）， 4.43 （1H， s， H-17b）， 4.18 （1H， br s， -OH）， 3.26 （2H， dd， J = 11.2， 4.0 Hz， H-3）， 2.40 （1H， m， H-7a）， 2.32 （1H， m， H-12a）， 2.16 （3H， d， J = 1.2 Hz， C16-CH3）， 1.99 （1H， m， H-7b）， 1.98 （1H， m， H-12b）， 1.75 （1H， m， H-1a）， 1.73 （1H， m， H-2a）， 1.72 （1H， m， H-6a）， 1.70 （1H， m， H-2b）， 1.64 （1H， m， H-11a）， 1.56 （1H， m， H-9）， 1.52 （1H， m， H-11b）， 1.36 （1H， m， H-6b）， 1.16 （1H， td， J = 12.8， 3.6 Hz， H-1b）， 1.09 （1H， dd， J = 12.4， 2.8 Hz， H-5）， 0.98 （3H， s， C18-CH3）， 0.76 （3H， s， C19-CH3）， 0.66 （3H， s， C20-CH3）。13C-NMR （100 MHz， CDCl3） δ： 171.4 （C-15）、163.5 （C-13）、147.7 （C-8）、114.8 （C-14）、106.7 （C-17）、78.8 （C-3）、55.9 （C-9）、54.5 （C-5）、40.1 （C-12）、39.5 （C-10）、39.3 （C-4）、38.0 （C-7）、37.0 （C-1）、28.4 （C-18）、27.8 （C-2）、24.0 （C-6）、21.6 （C-11）、19.3 （C-16）、15.5 （C-19）、14.5 （C-20）。基于以上理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)，并結(jié)合文獻[10]報道，鑒定化合物為3-hydroxy-8（17）， 13E-labdadien-15-oic acid。

化合物10 "無色針狀結(jié)晶（丙酮）。ESI-MS m/z： 260.2005 [M+H]+;分子式為C17H25NO。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ： 7.50 （1H， d， J = 8.2 Hz， H-4）， 6.93 （1H， d， J = 8.0 Hz， H-3）， 3.61 （1H， dd， J = 10.4， H-14b）， 3.26 （1H， d， J = 10.4 Hz， H-14a）， 2.89 （1H， dd， J =18.2， 6.3， H-10b）， 2.78～2.76 （1H， m， H-10a）， 2.35 （3H， s， C11-CH3）， 2.26 （1H， br d， J =13.2 Hz， H-5b）， 1.98～1.96 （1H， m， H-9b）， 1.87～1.85 （1H， m， H-7b）， 1.68～1.66 （1H， m， H-6b）， 1.64～1.62 （1H， m， H-9a）， 1.52～1.50 （1H， m， H-6a）， 1.34 （1H， dd， J = 9.6， 1.9 Hz， H-8a）， 1.23～1.20 （1H， m， H-5a）， 1.09 （3H， s， C12-CH3）， 0.96 （3H， s， C13-CH3）， 0.88～0.86 （1H， m， H-7a）。13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6） δ： 154.6 （C-10a）、154.5 （C-2）、141.8 （C-4a）、133.3 （C-4）、121.0 （C-3）、63.1 （C-14）、51.0 （C-8a）、38.9 （C-8）、38.7 （C-5）、37.2 （C-4b）、35.4 （C-7）、34.1 （C-10）、27.7 （C-13）、26.0 （C-12）、24.0 （C-11）、19.1 （C-9）、19.0 （C-6）。與改良的碘化鉍鉀試劑反應(yīng)結(jié)果呈陽性，基于以上理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)，參考文獻[11]數(shù)據(jù)，可以確定化合物為Forsyshiyanine A。此化合物為首次從連翹中發(fā)現(xiàn)，也是首次從連翹屬中發(fā)現(xiàn)。

化合物11 "無色針狀結(jié)晶（丙酮）。ESI-MS m/z： 134.1201 [M+H]+;分子式為C9H11N。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ： 8.41 （1H， s， H-1）， 8.30 （1H， d， J = 4.8 Hz， H-3）， 7.27 （1H， d， J = 4.8 Hz， H-4）， 3.23 （1H， m， H-8）， 2，89 （1H， m， H-6b）， 2.80 （1H， m， H-6a）， 2.26 （1H， m， H-7b）， 1.55 （1H， m， H-7a）， 1.26 （3H， s， C10-CH3）。13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6） δ： 150.1 （C-5）、147.5 （C-3）、145.1 （C-1）、140.5 （C-9）、120.5 （C-4）、37.5 （C-8）、34.3 （C-7）、31.2 （C-6）、20.1 （C-10）。與改良的碘化鉍鉀試劑反應(yīng)結(jié)果呈陽性，基于以上理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)并參考文獻[12]，可以確定化合物為（7R）-6，7-dihydro-7-methyl-5H-cyclopenta[c]pyridine。

化合物12 "無色針狀結(jié)晶（氯仿）。ESI-MS m/z： 296.1129 [M+H]+;分子式為C18H17NO3。1H-NMR （400 MHz， CDCl3） δ： 8.63 （1H， s， H-1）， 8.40 （1H， d， J = 5.1 Hz， H-3）， 7.56 （1H， d， J = 15.9 Hz， H-7'）， 7.29 （1H， d， J = 5.1 Hz， H-4）， 7.26 （1H， d， J = 8.6 Hz， H-2'）， 7.26 （1H， d， J = 8.6 Hz， H-6'）， 6.79 （1H， d， J = 8.6 Hz， H-3'）， 6.79 （1H， d， J = 8.6 Hz， H-5'）， 6.20 （1H， d， J = 15.9 Hz， H-8'）， 4.45 （1H， dd， J = 9.7， 10.8 Hz， H-8b）， 4.18 （1H， dd， J = 5.4， 10.8 Hz， H-8a）， 3.74～3.70 （1H， m， H-7）， 3.04～3.02 （2H， m， H-5）， 2.41～2.39 （1H， m， H-6b）， 1.92～1.90 （1H， m， H-6a）。13C-NMR （100 MHz， CDCl3） δ： 167.4 （C-9'）、160.2 （C-4'）、155.3 （C-4a）、146.8 （C-3）、145.8 （C-7'）、145.1 （C-1）、141.4 （C-7a）、130.2 （C-6'）、130.2 （C-2'）、125.6 （C-1'）、120.9 （C-4）、116.3 （C-3'）、116.2 （C-5'）、113.7 （C-8'）、66.3 （C-8）、42.5 （C-7）、31.5 （C-5）、27.8 （C-6）。與改良的碘化鉍鉀試劑反應(yīng)結(jié)果呈陽性，綜合上述理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)，并結(jié)文獻[11]報道，可以確定化合物為Forsyshiyanine B。此化合物為首次從連翹中發(fā)現(xiàn)，也是首次從連翹屬中發(fā)現(xiàn)。

化合物13 "無色粉末（丙酮）。ESI-MS m/z： 368.1661 [M+H]+;分子式為C20H17NO6。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ： 7.14 （1H， d， J = 8.0 Hz， H-3'）， 6.73 （1H， s， H-8）， 6.70 （1H， s， H-5）， 6.22 （2H， d， J = 6.4 Hz， -OCH2-）， 6.11 （1H， d， J = 8.0 Hz， H-2'）， 4.08 （1H， d， J = 4.0 Hz， H-1）， 5.98 （2H， d， J = 6.4 Hz， -OCH2-）， 5.78 （1H， d， J = 4.0 Hz， H-9）， 2.66～2.63 （1H， m， H-3a）， 2.60～2.56 （1H， m， H-4a）， 2.47～2.42 （1H， m， H-3b）， 2.45 （3H， s， N-CH3）， 2.10～2.08 （1H， m， H-4b）。13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6） δ： 167.1 （C-7'）、148.5 （C-5'）、146.1 （C-6）、145.3 （C-7）、143.8 （C-4'）、140.2 （C-1'）、130.1 （C-8a）、124.7 （C-6'）、124.6 （C-4a）、115.3 （C-2'）、113.2 （C-3'）、108.1 （C-8）、107.7 （C-5）、103.2 （-OCH2-）、100.7 （-OCH2-）、80.4 （C-9）、64.8 （C-1）、48.7 （C-3）、44.7 （N-CH3）、26.3 （C-4）。與改良的碘化鉍鉀試劑反應(yīng)結(jié)果呈陽性，基于上述理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)，并結(jié)合文獻[13]的報道，可以確定化合物為（－）-bicuculline。

化合物14 "無色針晶（丙酮）。ESI-MS m/z： 370.1366 [M+H]+;分子式為C20H17NO6。1H-NMR （400 MHz， CDCl3） δ： 6.79 （1H， s， H-8）， 6.58 （1H， s， H-5）， 6.52 （1H， d， J = 8.0 Hz， H-3'）， 6.03 （2H， d， J = 1.3 Hz， -OCH2-）， 5.97 （2H， d， J = 1.3 Hz， -OCH2-）， 5.65 （1H， d， J = 8.0 Hz， H-2'）， 5.40 （1H， d， J = 3.0 Hz， H-9）， 3.87 （1H， d， J = 3.8 Hz， H-1）， 2.72～2.70 （1H， m， H-3a）， 2.50 （3H， s， N-CH3）， 2.41～2.38 （1H， m， H-4a）， 2.05～2.01 （1H， m， H-4b）， 1.85～1.83 （1H， m， H-3b）。13C-NMR （100 MHz， CDCl3） δ： 148.4 （C-4'）、146.8 （C-6）、146.7 （C-7）、141.7 （C-5'）、133.3 （C-1'）、128.8 （C-8a）、124.3 （C-4a）、124.2 （C-6'）、114.9 （C-2'）、108.9 （C-3'）、108.6 （C-8）、107.8 （C-5）、102.0 （-OCH2-）、101.2 （-OCH2-）、98.6 （C-7'）、87.2 （C-9）、67.9 （C-1）、46.2 （C-3）、44.2 （N-CH3）、29.4 （C-4）。與改良的碘化鉍鉀試劑反應(yīng)結(jié)果為陽性，綜合以上理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻[14]的報道，確定化合物為（－）-egenine。

化合物15 "無色方晶（丙酮）。ESI-MS m/z： 384.1408 [M+H]+;分子式為C21H21NO6。1H-NMR （400 MHz， CDCl3） δ： 6.76 （1H， d， J = 9.2 Hz， H-3'）， 6.57 （1H， s， H-8）， 6.33 （1H， d， J = 9.2 Hz， H-2'）， 6.25 （1H， s， H-5）， 6.05 （1H， d， J = 1.5Hz， -OCH2-）， 6.03 （1H， d， J = 1.5Hz， -OCH2-）， 6.01 （1H， s， H-7'）， 5.89 （1H， d， J = 1.5Hz， -OCH2-）， 5.86 （1H， d， J = 1.5Hz， -OCH2-）， 5.57 （1H， d， J = 3.8 Hz， H-9）， 3.84 （1H， d， J = 3.8 Hz， H-1）， 3.37 （3H， s， O-CH3）， 3.13 （1H， m， H-3b）， 2.66 （1H， m， H-4b）， 2.64 （1H， m， H-3a）， 2.58 （3H， s， N-CH3）， 2.47 （1H， m， H-4a）。13C-NMR （100 MHz， CDCl3） δ： 148.2 （C-4'）、146.6 （C-6）、145.6 （C-7）、142.1 （C-5'）、136.9 （C-1'）、129.1 （C-8a）、126.2 （C-4a）、120.2 （C-6'）、115.0 （C-2'）、109.7 （C-3'）、108.4 （C-8）、108.3 （C-5）、104.7 （C-7'）、102.1 （-OCH2-）、100.8 （-OCH2-）、87.4 （C-9）、67.9 （C-1）、54.0 （O-CH3）、49.2 （C-3）、44.6 （N-CH3）、26.7 （C-4）。與改良的碘化鉍鉀試劑反應(yīng)結(jié)果為陽性，綜合上述理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)，并結(jié)合文獻[15]的報道，可以確定化合物為（－）-7'-O-methylegenine。

4體外抗病毒活性研究

4.1 藥物細胞毒性測定

將MDCK（1×104個/孔）接種在含有10% FBS的Dullbeccos改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中的96孔微量滴定板上，并孵育過夜。用不同劑量的化合物溶液代替細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d。將MTT試劑添加到細胞上清液中，使MTT的最終濃度為0.5 mg/mL。3 h后除去細胞培養(yǎng)基，將貼壁細胞中的甲臜晶體溶解在DMSO中，測量吸光度。每種化合物一式三份平行測定。

4.2 抗甲型H1N1流感病毒活性研究

以H1N1病毒感染的MDCK為模型，以利巴韋林為對照，對化合物進行體外抗流感病毒活性實驗。化合物對病毒的增長抑制作用通過半數(shù)抑制濃度 IC50 值來表示。

實驗準備：制備甲型 H1N1 流感病毒液，對MDCK細胞進行復(fù)蘇。

實驗過程：利用 MTT 法評價甲型 H1N1 流感病毒對MDCK細胞的細胞毒作用，得到 TC0值（最大無毒濃度）。化合物對病毒的增長抑制作用，采用 MTT 法進行試驗，共設(shè)置成3組：正常細胞對照組、病毒對照組和利巴韋林對照組，向病毒對照組中加入已處理為一定濃度的化合物溶液，將兩組放入培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中，觀察細胞病變，測定OD值，并用Probit法計算出IC50。

4.3 抗呼吸道合胞病毒活性研究

以RSV感染的喉癌細胞為模型，以利巴韋林為對照，對化合物進行體外抗RSV活性實驗。化合物對病毒的增長抑制作用通過半數(shù)有效量 EC50 值來表示。

首先將喉癌細胞凍存處理，RSV病毒液進行活化擴增。后進行病毒滴度測定，利用Reed-Muench法計算得到TCID50（細胞半數(shù)感染量）。利用MTT法研究RSV病毒對Hep-2的細胞毒作用，計算得TC50值即半數(shù)毒性濃度。

化合物對流感病毒的增長抑制作用，采用MTT法進行試驗，共設(shè)置成3組：正常細胞對照組、病毒對照組、利巴韋林對照組。向病毒對照組中加入已處理為一定濃度的化合物溶液，放入培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中觀察細胞病變作用。MTT法進行活細胞染色，在570 nm波長處讀取OD值，根據(jù)OD值判斷不同濃度藥物對病毒的抑制作用，用Probit法計算出EC50。

4.4 數(shù)據(jù)處理及活性實驗結(jié)果

用SPSS20.0軟件對實驗結(jié)果進行分析處理，對IC50和 EC50進行分析。

5結(jié) 論

本研究運用多種色譜分離方法，從河南連翹的抗炎、抗病毒活性部分中得到9個半日花烷型二萜類化合物（化合物1—9）和6個生物堿類化合物（化合物10—15），其中化合物10、12為首次從連翹中發(fā)現(xiàn)，也是首次從連翹屬植物中發(fā)現(xiàn)。采用MTT法，以犬腎細胞為研究對象，同時以利巴韋林為對照，對其中的4個化合物進行抗病毒活性研究，結(jié)果顯示這些化合物具有一定的抗病毒活性，可以為開發(fā)新型的抗病毒藥物提供新思路和數(shù)據(jù)支持。

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Labdane Diterpenoids and Alkaloids from Fruits of Forsythia Suspensa Thunb.vahl and Their Anti-viral Activity

SUN Litong， LI Wei， ZHAO Lin， DAI Shengjun

（School of Pharmaceutical Science， Yantai University， Yantai 264005， China）

Abstract： The chemical components in the anti-inflammatory and antiviral active parts and the antiviral activity of Forsythia suspensa are studied. The compounds in F. suspensa are separated and purified by silica gel column chromatography， Sephadex LH-20 column chromatography and high performance preparation chromatography. The structures of the compounds are identified according to their physicochemical properties and spectral data， and the antiviral activity of some of the compounds is studied by MTT method. The results show that nine labdane diterpenoids and six alkaloids are isolated from the chloroform and ethyl acetate parts of 95% ethanol extract of F. suspensa. The nine labdane diterpenoids are 19-hydroxy-ent-labda-8（17），13E-dien-15-oic acid （1）， ent-labda-8（17），13Z-dien-15，19-dioic acid （2）， ent-labda-8（17），13E-dien-15，19-dioic acid （3）， 3β-hydroxy-8（17），13E-labdadien-15-oic acid （4）， enantio-labda-8（20），13E-dien-15，18-dioic acid （5）， Forsyshiyanin A （6）， Forsyshiyanin B （7）， 18-hydroxy-7-oxolabda-8（9），13E-diene-15-oic aicd（8）， and 3-hydroxy-8（17），13E-labdadien-15-oic acid （9）. The six alkaloids are Forsyshiyanine A （10）， （7R）-6，7-dihydro-7-methyl-5H-cyclopenta[c]pyridine （11）， Forsyshiyanine B （12）， （－）-bicuculline （13）， （－）-egenine （14）， and （－）-7'-O-methylegenine （15）. Among these compounds， 10 and 12 are discovered from F. suspensa for the first time， as well as from the plants of Forsythia genus. MTT results show that compounds 1、2、10 and 12 have inhibitory effects on the growth of H1N1 influenza virus and respiratory syncytial virus.

Key words ： Forsythia suspensa Thunb.vahl; labdane diterpenoid; alkaloid; anti-viral activity