5HT2A受體反向激動劑LPM6690061改善普拉克索致PD小鼠躁狂

摘要：為探討5-HT2A受體反向激動劑LPM6690061對普拉克索引起的帕金森病（PD）躁狂小鼠的癥狀改善作用及作用機制，采用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6，-四氫吡啶（MPTP）建立小鼠PD模型，同時腹腔注射PPX建立小鼠PD躁狂模型，后灌胃給予2.0，6.0，18.0 mg/kg LPM6690061進行治療。轉棒、爬桿實驗檢測PD小鼠的運動障礙；懸尾、強迫游泳實驗檢測PD躁狂小鼠的情緒障礙；曠場實驗檢測PD躁狂小鼠的過度活動；Y迷宮實驗檢測PD躁狂小鼠的空間記憶；蘇木精-伊紅染色法檢測海馬體齒狀回（DG）區細胞的損傷；蛋白免疫印跡法檢測小鼠海馬體糖原合酶激酶3β（GSK-3β）、磷酸化GSK-3β（P-GSK-3β）、絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）、磷酸化Akt（P-Akt）、細胞外調節蛋白激酶（Erk）、磷酸化Erk（P-Erk）、環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）、磷酸化CREB（P-CREB）的表達。結果表明，5-HT2A受體反向激動劑LPM6690061可改善普拉克索引起的PD小鼠的躁狂癥狀，抑制Akt/GSK-3β信號通路，降低海馬體P-GSK-3β、P-Akt蛋白的表達；增強Erk/CREB通路，增加海馬體P-Erk和P-CREB蛋白的表達，減少神經元凋亡，改善PD躁狂小鼠的空間記憶能力，減輕海馬體DG區的顆粒細胞損傷。

關鍵詞：帕金森病；普拉克索；躁狂；5-HT2A受體反向激動劑

中圖分類號：R964 " "文獻標志碼：A

5-HT2A Receptor Inverse Agonist LPM6690061 Ameliorates Pramipexole-Induced Mania in Parkinson’s Disease Mice

ZHANG Hong， YIN Zhicong， GUO Chunmin， YU Xin

（School of Pharmacy， Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation （Yantai University），Ministry of Education， Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong. Yantai University， Yantai 264005， China）

Abstract： To elucidate the ameliorative effect and underlying mechanisms of the 5-HT2A receptor inverse agonist LPM6690061 on pramipexole （PPX）-induced mania in mice with Parkinson's disease （PD）， we first established a PD mouse model employing 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6，-tetrahydropyridine （MPTP）. A PD-associated mouse mania model was subsequently induced through intraperitoneal injection of PPX. The mice were then subjected to treatment with 2.0， 6.0， and 18.0 mg/kg LPM6690061. A suite of behavioral and neurobiological assays was employed to assess the impact of LPM6690061. Dyskinesia in PD mice was evaluated using the rotarod and pole tests， while mood disorders in PD-manic mice were assessed through the tail suspension and forced swimming tests. Overactivity symptoms in PD-manic mice were measured via the open-field test， and spatial memory impairments were gauged using the Y-maze test. Neuroanatomical evaluations involved hematoxylin-eosin （HE） staining to detect cellular damage within the granule cells of the hippocampal dentate gyrus （DG）. Western blotting was used to detect the expression of glycogen lyase kinase 3β （GSK-3β）， phosphorylated GSK-3β （P-GSK-3β）， serine/threonine kinase （Akt）， phosphorylated Akt （P-Akt）， extracellular regulating kinase（Erk）， phosphorylated Erk（P-Erk）， cyclic-AMP response binding protein（CREB）， phosphorylated CREB（P-CREB） in the mouse hippocampus. The findings suggest that the 5-HT2A receptor inverse agonist LPM6690061 mitigates the manic symptoms induced by pramipexole in PD mice. It accomplishes this by inhibiting the Akt/GSK-3β signaling pathway， evidenced by decreased expression of P-GSK-3β and P-Akt proteins in the hippocampus. Concurrently， LPM6690061 enhances the Erk/CREB pathway， as indicated by increased expression of P-Erk and P-CREB proteins in the hippocampus. These alterations were accompanied by a reduction in neurons apoptosis， an improvement in spatial memory， and an attenuation of damage to the granule cells in the DG area of the hippocampus.

Keywords： Parkinson's disease; pramipexole; mania; 5-HT2A receptor inverse agonist

帕金森病（Parkinson，s disease， PD）是一種與年齡相關的神經退行性疾病，主要表現為黑質致密部多巴胺（Dopamine， DA）能神經元丟失，臨床表現為震顫、僵硬、運動遲緩等運動癥狀和抑郁、失眠、認知減退、情緒障礙等非運動癥狀[1]。

普拉克索（Pramipexole， PPX）為新一代非麥角堿類選擇性多巴胺D2、D3、D4受體激動劑。該藥能有效改善早期及晚期PD患者的運動癥狀[2]。PPX的不良反應輕微，但其所致的幻覺、躁狂等不良反應值得臨床醫師重視[3， 4]。有文獻表明躁狂的發生可能與腦內DA能過度活躍有關[5]。研究發現，選擇性血清素/5-羥色胺2A（5-Hydroxytryptamine 2A， 5-HT2A）受體拮抗劑能夠減弱DA能的過度活躍，同時又不影響DA能的基礎水平，使其有助于治療以慢性DA能張力升高為特征的疾病，如帕金森精神病（Parkinson’s disease psychosis，PDP）的幻覺和妄想[6]。

匹莫范色林（Pimavanserin）是一種5-HT2A受體部分反向激動劑，于2016年被FDA批準用于治療PDP，山東綠葉制藥有限公司對該化合物進行結構改造，合成了活性更強、代謝更穩定的Pimavanserin衍生物LPM6690061。本課題采用腹腔注射神經毒劑1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methy1-4-pheny1-1，2，3，6-tetrahydropyridine， MPTP）和腹腔注射PPX制作PD躁狂小鼠模型，而后給予LPM6690061進行治療，觀察LPM6690061對PD躁狂小鼠的癥狀改善作用，并初步探討其作用機制。

1試驗材料

1.1實驗動物

雄性C57BL/6小鼠，60只，8～10周齡，質量20～25 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2021-0006，質量合格證流水號：110011221111471256。所有小鼠飼養在山東綠葉實驗動物中心SPF級屏障飼養環境內，溫度保持（23 ± 2）℃，每周更換墊料，自由飲水采食，12 h/ 12 h明暗交替。本研究經過煙臺大學動物倫理委員會批準。

1.2藥品與試劑

5-HT2A受體反向激動劑，山東綠葉制藥有限公司生產；MPTP，批號：J2210584 （上海阿拉丁生化科技股份有限公司） ；PPX，批號：153590 （MedChemExpress， MCE） ；GSK-3β抗體、P-GSK-3β抗體、Akt抗體、P-Akt抗體、Erk抗體、P-Erk抗體、CREB抗體、p -CREB抗體 （Cell Signaling Technology， CST） ；BCA濃度測定試劑盒（增強型）、GAPDH抗體、酶標山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG （碧云天生物技術公司） ；改良HE（蘇木素-伊紅）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3儀器

離心機（上海貝克曼庫爾特有限公司）；酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；全自動化學發光成像凝膠成像系統（北京賽智創業科技有限公司）；石蠟切片機（上海賽默飛世爾科技有限公司）；Vectra3定量病理成像分析系統（上海珀金埃爾默企業管理有限公司）。

2方法

2.1 實驗方案

60只小鼠隨機分為6組：正常對照組（Control組），MPTP-PD模型組（MPTP-PD組），PD-PPX-躁狂模型組（PD-PPX-Mania組），LPM6690061低劑量組（2.0 "mg/kg）、中劑量組（6.0 mg/kg）、高劑量組（18.0 "mg/kg）；每組10只。采用MPTP建立小鼠PD模型[7]。MPTP給藥當天即為實驗第1天。除Control組小鼠每天腹腔注射（i.p.）生理鹽水外，其余組小鼠每天腹腔注射MPTP（25.0 "mg/kg），連續注射21 d建立慢性PD小鼠模型（MPTP-PD模型）。從第8天開始到第32天實驗結束，除Control組和MPTP-PD模型組外，其余組腹腔注射PPX（0.8 "mg/kg）建立PD小鼠躁狂模型（PD-PPX-Mania模型），與MPTP給藥間隔至少為8 h。從第22天開始，給藥組灌胃（i.g.）給予LPM6690061，到實驗結束。具體步驟如圖1。

2.2 小鼠MPTP-PD模型篩選

采用轉棒實驗和爬桿實驗來篩選MPTP-PD小鼠模型，具體方法如下：

（1）轉棒實驗：用來評估小鼠的運動協調性和平衡性。該實驗記錄小鼠從被放在連續加速的旋轉桿（旋轉桿從4 r/min勻加速到40 r/min，時間為10 min）到從桿上掉下來的時間。小鼠需要先經過3輪的訓練，適應在旋轉桿上的運動。分別在第7，14，21，28天進行實驗，每只小鼠記錄3次。

（2）爬桿實驗：用來評價小鼠的運動協調能力。該裝置是由長50 cm，直徑3 cm的粗糙圓柱形木桿和木桿頂部木球組成，木桿纏上麻繩以防滑。將木桿豎直固定，將小鼠放在木桿頂端木球上，當小鼠頭朝下開始爬行時，記錄每只小鼠從頂端爬至底部的時間（小鼠需先經過訓練）。分別在第8，15，22，29天進行實驗。

2.3小鼠躁狂模型篩選和情緒障礙檢測

采用懸尾實驗和強迫游泳實驗來篩選PD-PPX小鼠躁狂模型，并通過懸尾和游泳小鼠的不動時間來檢測動物的絕望行為，判斷動物的情緒障礙，評價LPM6690061對動物躁狂情緒的改善作用，具體方法如下：

（1）在實驗第16天進行懸尾實驗來評價小鼠躁狂模型，在實驗第30天進行藥效學評價。將小鼠尾部末端用醫用膠帶纏出一個能夠使其懸掛在懸尾實驗裝置上的小圈，監控系統記錄小鼠被懸掛后6 min內的行為，分析系統分析懸掛后26 min內小鼠的不動時間。

（2）在實驗第17天進行強迫游泳實驗來評價小鼠躁狂模型，在實驗第31天進行藥效學評價。各游泳箱中的水位應相對持平且深度要超過小鼠的身長，確保小鼠在游泳時，后爪和尾巴不會觸碰底部。水溫保持在25 ℃左右。每只小鼠被放入游泳箱后，記錄6 min內小鼠的不動時間。結束后立即將小鼠放入鋪滿干墊料的盒子內，待毛干后放回籠中。

采用曠場實驗評價LPM6690061對躁狂動物活動增加的改善作用，采用Y迷宮實驗評價LPM6690061對躁狂動物空間記憶的改善作用，具體方法如下：

（1）在實驗第32天進行曠場實驗。實驗裝置為250 mm×250 mm×400 mm的實驗箱，將小鼠放入實驗箱，監控系統記錄10 min，前5 min為適應時間，分析第5-10 min的活動軌跡，結束后將小鼠放回籠子中，使用75%酒精擦拭干凈。

（2）在實驗第33天進行Y迷宮實驗。實驗裝置由三個等長的臂組成，形狀類似字母Y，三條實驗臂分別標記為A，B，C臂。將小鼠放入A臂，使其面朝向迷宮中心，監控系統記錄5 min內小鼠的活動軌跡，結束后將小鼠放回籠子中，用75%酒精擦拭干凈。

2.4 蘇木精-伊紅染色（HE）

行為學實驗結束后，每組隨機取4只小鼠進行HE染色評價海馬體齒狀回（Dentate gyrus， DG）區細胞的損傷情況。小鼠斷頸后采用4%多聚甲醛進行心臟灌注，取腦，4 ℃固定至少24 h。將腦組織脫水后，石蠟包埋，再進行石蠟切片，按照HE染色試劑盒中的步驟對切片進行染色并封片。Vectra 3定量病理成像系統拍攝圖片，Image J 2.0軟件進行分析。

2.5 Western Blot（WB）

行為學實驗結束后，每組隨機取6只小鼠進行WB實驗檢測海馬體GSK-3β/p -GSK-3β，Akt/P-Akt的蛋白表達量。小鼠斷頸后采用PBS緩沖液進行心臟灌注，取腦分離海馬體，加入RIPA裂解液和磷酸酶抑制劑，研磨機研磨后，冰上裂解30 min，后4 ℃，15 000 "rmin-1離心15 min，BCA法配置蛋白，上樣量為50 "μg，進行蛋白電泳，轉膜后，用脫脂牛奶常溫孵育2 h，TBST洗凈后4 ℃過夜孵育一抗，次日常溫孵育二抗至少1 h，采用ECL顯影液顯影。Image J 2.0軟件進行分析，相對積分光密度（IDO）比值表示結果。

2.6統計分析

WB和行為學檢測數據均采用均值±標準差（x ± "s ）表示，結果采用單因素方差分析，對數據進行處理后，P lt; 0.05表示有統計學差異。采用Image J和SPSS "20.0軟件進行統計分析，并使用GraphPad prism 8.0作圖。

3實驗結果

3.1 MPTP-PD小鼠模型的篩選結果

如圖2（a）和（b）所示，同Control組相比，MPTP-PD模型組小鼠的轉棒時間顯著減少（###P lt; 0.001），爬桿時間顯著延長（###P lt; 0.001），提示MPTP-PD模型組小鼠的運動協調性和平衡性嚴重受損，出現了明顯的運動障礙，并且在停止給予MPTP后運動障礙依舊存在，表明PD小鼠造模成功，成模率為100%。

3.2 PD-PPX小鼠躁狂模型的篩選結果

如圖3（a）和（b）所示，與Control組相比，MPTP-PD組小鼠懸尾和游泳的不動時間沒有顯著性差異，PD-PPX-Mania組小鼠懸尾和游泳的不動時間都顯著減少（###P lt; 0.001），躁狂模型組小鼠表現出明顯的活動增加，提示躁狂模型組小鼠出現情緒控制障礙，表明PD-PPX躁狂小鼠造模成功，成模率為100%。

3.3 LPM6690061對PPX-PD躁狂小鼠行為學的影響

如圖4（a）和（b）所示，與PD-PPX-Mania組小鼠相比，2.0，6.0，18.0 mg/kg LPM6690061組小鼠懸尾和游泳的不動時間均顯著延長（***P lt; 0.001），結果具有劑量依賴性，說明LPM6690061可以減少躁狂小鼠的過度活動，改善躁狂小鼠的情緒障礙。

如圖5所示，與Control組相比，PD-PPX-Mania組小鼠曠場運動距離和運動速度顯著增加（###P lt; 0.001），與PD-PPX-Mania組小鼠相比，2.0，6.0，18.0 mg/kg LPM6690061組小鼠曠場運動距離和運動速度顯著減少（***P lt; 0.001），結果具有劑量依賴性，說明LPM6690061可以明顯改善PD-PPX-Mania小鼠的過度活動，改善小鼠的情緒障礙。

Fig. 5 Results of the Open-field Test

如圖6所示，與Control組相比，PD-PPX-Mania組小鼠的自發交替率顯著下降（##P lt; 0.01），與PD-PPX-Mania組小鼠相比，6.0，18.0 mg/kg LPM6690061組小鼠的自發交替率顯著增加（**P lt; 0.01），結果具有劑量依賴性，說明LPM6690061可以明顯改善PD-PPX-Mania小鼠的空間記憶。

3.4 LPM6690061對PD-PPX-躁狂小鼠海馬DG區細胞的影響

如圖7所示，與Control組比較，PD-PPX-Mania組小鼠海馬齒狀回（Dentate gyrus， DG）區細胞的堆積密度下降，說明躁狂小鼠海馬區神經元出現損傷；與PD-PPX-Mania組小鼠相比，各給藥組海馬DG區細胞堆積密度呈劑量依賴性增加，說明LPM6690061對躁狂小鼠海馬區神經元具有一定的保護作用。

3.5 LPM6690061對PD-PPX-躁狂小鼠海馬體相關蛋白表達的影響

如圖8所示，同Control組相比，PD-PPX-Mania組小鼠海馬體P -Akt、P -GSK-3β的表達量顯著提高，P -Erk、P -CREB的表達量顯著降低（###P lt; 0.001），與PD-PPX-Mania組相比，LPM6690061給藥組P -Akt和P -GSK-3β的表達量顯著降低，P -Erk和P -CREB的表達量顯著提高（***P lt; 0.001），呈劑量依賴性，說明LPM6690061可以顯著抑制躁狂小鼠海馬體Akt和GSK-3β的磷酸化，同時顯著增加Erk和CREB的磷酸化。

4 討論

臨床試驗表明，經多巴胺替代療法治療后的PD患者或會出現（輕）躁狂樣癥狀，具體原因尚不明確，但有文獻表明，DA能過度活躍、5-HT表達增加（特別是5-HT2亞型）與這一情緒障礙相關[5， 8-9]。5-HT2A受體通路可通過Akt/GSK-3β介導DA依賴性行為[10]，基于此，有學者認為選擇性5-HT2A受體拮抗劑有助于治療以慢性DA能張力升高為特征的情緒障礙[6]。

本研究在MPTP-PD小鼠模型的基礎上腹腔注射DA受體激動劑PPX建立PD小鼠躁狂模型，而后給予5-HT2A受體反向激動劑LPM6690061進行治療，觀察LPM6690061對PD躁狂小鼠的癥狀改善作用，并初步探討其作用機制。

懸尾實驗、強迫游泳實驗和曠場實驗結果顯示，與躁狂組小鼠相比，LPM6690061給藥組小鼠的過度活動均明顯降低，說明LPM6690061可治療PPX引起的PD小鼠的躁狂癥狀。Y迷宮實驗結果顯示，與躁狂組小鼠相比，LPM6690061給藥組小鼠的空間記憶能力顯著改善，說明LPM6690061可治療PPX引起的PD小鼠的空間記憶損傷。

已有研究發現，海馬體DG區神經元的改變可以影響或逆轉學習和認知靈活性，并對記憶和情緒產生重要影響[11]。HE染色實驗結果顯示，與Control組小鼠相比，躁狂組小鼠海馬體DG區顆粒細胞的堆積密度下降，經LPM6690061治療后，細胞堆積度增加，提示LPM6690061可減輕躁狂小鼠海馬體DG區顆粒細胞的損傷。

Akt及其下游底物GSK-3β被認為在情緒障礙的發病機制和治療機制中發揮重要作用，也因此被定義為情緒穩定劑的分子靶標[12-13]。Erk可以激活細胞質中的一系列底物，在信號識別和傳遞、細胞生長發育、增殖和凋亡等過程中發揮著不可替代的作用。CREB是Erk的下游靶標，廣泛分布于海馬體和大腦皮層[14]。此外，CREB在神經可塑性和神經發生中扮演著一個重要角色，它能增強應激反應，對神經元結構和功能的恢復具有重要意義[15]。拮抗5-HT2A受體可激活Erk/CREB通路，增加其磷酸化水平，起到神經保護和再生作用[16]。本研究觀察到在躁狂組小鼠海馬中P-Akt和P-GSK-3β的水平均顯著增加，P-Erk和P-CREB的水平顯著下降，而經LPM6690061治療后，P-Akt和P-GSK-3β水平均顯著降低，P-Erk和P-CREB的水平均顯著增加，提示LPM6690061對PPX誘導的PD小鼠的躁狂癥狀的治療作用可能與其通過反向激動5-HT2A受體，抑制Akt/GSK-3β信號通路，降低海馬體P-GSK-3β、P-Akt的表達；活化Erk/CREB通路，增加P-Erk和P-CREB的表達有關。

5 結論

5-HT2A受體反向激動劑LPM6690061可改善普拉克索引起的PD小鼠的躁狂癥狀，抑制Akt/GSK-3β信號通路，降低海馬體P-Akt和P-GSK-3β蛋白的表達；可增強Erk/CREB通路，增加海馬體P-Erk和P-CREB蛋白的表達，減少神經元凋亡，改善PD躁狂小鼠的空間記憶能力，減輕海馬體DG區的顆粒細胞損傷。

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