腺苷A2a受體在系統性硬化癥相關間質性肺病中的作用及機制研究

戴才俊，董一枝，嚴丹，涂軍偉

浙江大學醫學院附屬金華醫院 金華市中心醫院呼吸與危重癥醫學科，浙江金華 321000

系統性硬化癥（systemic sclerosis，SSc）又稱硬皮病，是一種病因尚未完全明確、診治困難的自身免疫性疾病。該病具有彌漫皮膚或局部器官纖維化、血管病變及免疫學異常三大特征[1-2]；局部內臟器官病變以系統性硬化癥相關間質性肺病（systemic sclerosis associated interstitial lung disease，SSc-ILD）最常見，通常表現為肺部間質性炎癥或纖維化，至今尚缺乏對SSc-ILD的有效治療措施，使其成為硬皮病患者的主要死亡原因之一[3-4]。目前治療SSc-ILD的主要藥物有激素和環磷酰胺等，但效果均欠佳，且有繼發感染、骨髓抑制等嚴重并發癥[5]。因此探明SSc-ILD的發病機制，尋求療效好且副作用小的藥物治療SSc-ILD是一項重要的研究課題。

近年來研究發現腺苷A2a受體（A2a receptor，A2aR）參與炎癥、缺氧、氧化應激損傷等過程[6-8]。在肺缺血再灌注模型中，A2aR激活減少白細胞黏附的同時可抑制活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產生，從而抑制氧化應激反應，減輕肺組織滲出[9]。另有研究發現氧化應激參與SSc-ILD的發生、發展[10-11]。目前A2aR對SSc-ILD的作用及機制研究較少，本研究擬建立次氯酸誘導的小鼠SSc-ILD模型，探討A2aR激活是否通過降低氧化應激水平減輕SSc-ILD的炎癥及纖維化程度。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及標本

選取24只健康雌性Balb/c小鼠[購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2022-0004]，均為6周齡，體質量18～22g。飼養條件：無特定病原體環境，室溫20～24℃，給予充足水和飼料。將小鼠隨機分為三組（n=8）：正常對照組（wild normal control group，WN組）、造模組（wild model group，WM組）、造模+A2aR激動劑（CGS21680）組（WM with CGS21680 group，WMC組）。WN組小鼠背部注射300μl無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），WM組和WMC組小鼠背部注射300μl次氯酸溶液，1次/d，連續造模6周。造模后予腹腔注射給藥，WN組和WM組小鼠腹腔注射0.5ml無菌PBS溶液，WMC組小鼠腹腔注射0.5ml無菌CGS21680溶液,連續注射6周。各組小鼠結束注射2周后，頸椎脫臼法處死小鼠，心臟取血并分離血清，檢測血清晚期氧化蛋白產物（advanced protein oxidation products，AOPP）。取小鼠肺組織分成兩部分：一部分立即用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和馬松染色；另一部分立即置于液氮中，低溫（-80℃）保存備用，測定羥脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）、AOPP、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）含量。本研究經金華市食品藥品檢驗檢測研究院實驗動物倫理委員會審批通過（倫理審批號：AL-JSYJ202209）。

1.2 主要試劑與儀器

磷酸二氫鉀粉末、次氯酸鈉溶液、CGS21680購自美國Sigma公司；終濃度為0.01mol/L的PBS溶液備用；次氯酸配置：166μl次氯酸鈉溶液（含2.6%的活性氯）加入11.1ml磷酸二氫鉀溶液（100mmol/L）中，混合后備用；CGS21680配置：100μg CGS21680溶于10ml PBS溶液中，配置成終濃度10μg/ml備用。HYP試劑盒購自南京建成生物工程研究所。AOPP酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、GSH ELISA試劑盒購自上海博蘊生物科技有限公司。LEICA DM 1000光學顯微鏡購自德國萊卡公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HE染色和馬松染色 常規制作肺組織切片行HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學改變；進一步行馬松染色，膠原纖維呈亮綠色，肌纖維呈紅色，以亮綠色（膠原纖維）為陽性，反映膠原含量，觀察纖維化情況。HE染色切片和馬松染色切片采用LEICA DM 1000光學顯微鏡采圖。

1.3.2 HYP含量測定 根據ELISA試劑盒操作步驟測定各組小鼠肺組織HYP的含量，間接反映膠原纖維含量。

1.3.3 血清及肺組織AOPP及GSH測定 根據ELISA試劑盒操作步驟測定各組小鼠的血清及肺組織AOPP及GSH含量。

1.4 統計學方法

采用SPSS19.0統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，各組數據均進行Shapiro-Wilk正態性檢驗，結果符合正態分布。多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠HE染色肺部病理學變化及馬松染色肺部膠原含量變化的比較

與WN組小鼠比較，WM組小鼠肺部呈現肺泡間隔增厚，伴炎癥細胞滲出，部分肺泡萎縮粘連，血管周圍膠原沉積增多。WMC組小鼠肺部上述變化較WM組小鼠減輕，見圖1、圖2。

圖1 肺部病理學變化（HE染色，×100）

圖2 肺部膠原含量的變化（馬松染色，×100）

2.2 各組小鼠肺組織中HYP含量的變化

WM組小鼠肺組織中HYP含量較WN組小鼠明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）；WMC組小鼠肺組織中HYP含量較WM組小鼠降低，差異有統計學意義（P<0.01），見表1。

表1 各組小鼠肺組織中HYP含量的變化（±s，μg/mg，n=8）

表1 各組小鼠肺組織中HYP含量的變化（±s，μg/mg，n=8）

注：與WM組比較，*P<0.01

組別 肺組織中HYP含量 統計值 P WN組 0.43±0.09*WM組 0.58±0.05 12.13 <0.001 WMC組 0.50±0.04*

2.3 各組小鼠的血清AOPP含量比較

WM組小鼠的血清AOPP含量較WN組小鼠明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）；WMC組小鼠的血清AOPP含量較WM組小鼠降低，差異有統計學意義（P<0.01），見表2。

表2 各組小鼠的血清AOPP含量比較（±s，nmol/ml，n=8）

表2 各組小鼠的血清AOPP含量比較（±s，nmol/ml，n=8）

注：與WM組比較，*P<0.01

組別 血清AOPP含量 統計值 P WN組 11.08±1.55*WM組 14.77±1.30 14.04 <0.001 WMC組 12.23±1.42*

2.4 各組小鼠肺組織AOPP含量的比較

WM組小鼠肺組織中AOPP含量較WN組小鼠明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）；WMC組小鼠肺組織中AOPP含量較WM組小鼠降低，差異有統計學意義（P<0.01），見表3。

表3 各組小鼠肺組織AOPP含量的比較（±s，nmol/mg，n=8）

表3 各組小鼠肺組織AOPP含量的比較（±s，nmol/mg，n=8）

注：與WM組比較，*P<0.01

組別 肺組織AOPP含量 統計值 P WN組 0.36±0.08*WM組 0.56±0.05 15.62 <0.001 WMC組 0.45±0.08*

2.5 各組小鼠肺組織中GSH含量的比較

WM組小鼠肺組織中GSH含量較WN組小鼠明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）；WMC組小鼠肺組織中GSH含量較WM組小鼠升高，差異有統計學意義（P<0.05），見表4。

表4 各組小鼠肺組織中GSH含量的比較（±s，μg/mg，n=8）

表4 各組小鼠肺組織中GSH含量的比較（±s，μg/mg，n=8）

注：與WM組比較，*P<0.01，#P<0.05

組別 肺組織GSH含量 統計值 P WN組 2.50±0.44*WM組 1.89±0.23 8.45 0.002 WMC組 2.14±0.12#

3 討論

硬皮病是一種至今病因尚未完全明確的全身性結締組織病，以自身免疫異常、各組織器官膠原過度沉積和微血管損傷為特征[12-13]。SSc-ILD是硬皮病最常見內臟器官病變之一，通常表現為肺部的炎癥浸潤或纖維化形成，也是硬皮病患者最常見的死亡原因之一[14]。目前尚缺乏對SSc-ILD的有效治療。

越來越多的科學研究運用次氯酸誘導的硬皮病模型進行相關疾病發生及藥物作用機制的研究[15-16]。研究發現氧化應激參與SSc-ILD的發生、發展，系統性氧化應激水平的變化通過循環系統導致肺部氧化應激水平隨之變化，進而導致肺組織中激活的成纖維細胞產生大量ROS，促使成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，導致a-平滑肌肌動蛋白表達增加，Ⅰ型膠原蛋白合成增加，細胞外基質沉積增多，最終導致SSc-ILD的發生發展[10,17-19]。AOPP作為一個循環因子，參與硬皮病模型中氧化應激從皮膚傳播到肺的過程[18]。AOPP屬于大分子尿毒癥毒素，于1996年在慢性腎衰竭患者的血漿中首次發現并報道，是血清白蛋白等被ROS氧化后產生的代謝產物[20]。作為氧化應激的代謝產物，AOPP被認為是反映氧化應激損傷的敏感指標，也發揮著炎癥介質的作用，可引起炎癥細胞聚集，誘導產生更多的ROS，從而加重氧化應激，促進炎癥反應的發生發展[21-22]。慢性腎臟病的研究發現血清AOPP的升高可誘導腎臟AOPP的增加及轉化生長因子β1的表達增加，最終促成腎臟纖維化[23]。使用硬皮病患者的血清孵育成纖維細胞的實驗發現AOPP可誘導其產生過氧化氫和一氧化氮，提示AOPP誘導產生不同類型的ROS參與SSc-ILD的發生、發展[24]。本研究模型中發現造模組小鼠肺組織呈現炎癥及纖維化，HYP含量升高，間接提示膠原纖維含量增加；此外造模組小鼠的血清及肺組織中AOPP含量均升高，而代表抗氧化能力的GSH含量降低，提示氧化還原失衡參與SSc-ILD的發生、發展。

腺苷是機體內的一種內源性嘌呤核苷，在人體各系統廣泛分布，通過其特異性細胞表面受體發揮不同生物學效應[25]。A2aR屬于腺苷受體之一，被證實與氧化應激反應關系密切[9]。在多種疾病模型中發現A2aR可降低相應器官或細胞的氧化應激水平，也可提高相應細胞的抗氧化能力，產生抗氧化損傷作用[26-27]。A2aR的抗炎、抗纖維化作用也在多種疾病模型中得到證實，A2aR的激活抑制炎癥細胞的聚集和炎癥細胞因子的釋放，最終延緩從炎癥到纖維化的進展[28-30]。在亨廷頓舞蹈病中，A2aR的激活可降低神經元的DNA損傷和氧化應激誘導的細胞凋亡[31]；且在膠原誘導的關節炎模型中，A2aR的激活可降低氧化損傷水平，從而在慢性炎癥過程中產生抗炎和緩解組織損傷的保護作用[32]。本研究發現A2aR激動劑組小鼠的肺組織炎癥及纖維化程度較造模組減輕，代表氧化應激水平的血清及肺組織AOPP含量減少，而代表抗氧化能力的GSH含量升高。提示A2aR的激動可通過減輕硬皮病系統性氧化應激水平間接減少肺部ROS的產生，從而調節肺部氧化還原的平衡，減輕肺部的氧化應激水平，最終延緩SSc-ILD的發生、發展。

綜上所述，A2aR的激活可通過抗氧化作用，有效減輕SSc-ILD的炎癥和纖維化程度，延緩其發生、發展。本研究結果可能為今后開發A2aR相關藥物治療SSc-ILD提供一定的實驗基礎。