瓊脂擴散法用于放線菌源生防菌劑篩選的活性影響因素

張志剛，王開梅，吳兆圓，萬中義，方 偉

（湖北省生物農藥工程研究中心/湖北省農業科技創新中心生物農藥分中心，武漢 430064）

在使用化合物或提取物進行殺菌活性測試體系中，活性化合物處于持續降解中，而病原菌處于持續增殖的進程中，直接使用活性成分進行測試需要較高的濃度才能顯示出穩定的活性。因此，提高篩選體系敏感度的常用方法是提取、濃縮。在生防殺菌劑的篩選中，提取和濃縮也只能反映生防菌的部分效果。在瓊脂擴散法中使用含有活菌的發酵液，解決了活性成分濃度持續降低而靶標持續增殖引起的假陰性難題。樣品菌能保持持續生長，活性物質總量也保持持續增長，解決了活性成分的分解和培養基對活性成分稀釋的問題，且無需采用提取、濃縮等通用方法，簡化了篩選流程，也降低了篩選成本。瓊脂擴散法為靶標病原菌和發酵液樣品中的活菌（放線菌）同時提供了持續生長的條件。在靶標病原菌持續擴增的同時，發酵液中的活性成分也在持續產生。因此，含有活菌的放線菌源樣品中不僅包括代謝產物（活性化合物），而且在測試的培養過程中，代謝產物還在持續產生。所以在使用瓊脂擴散法對化合物測試時，隨著培養時間的延長，化合物的濃度會降低，抑菌圈會縮小或者消失。因此，在對含有活菌的樣品進行測試時，影響活性反應的因素就更加多樣。使用瓊脂擴散法對生防殺菌劑樣品進行的測試，更接近生防菌在實際應用中的狀態。由于靶標菌和樣品（含有活菌）都處于動態變化中，為了反映含有活菌發酵液的真實活性，減少漏篩，必須對活性反應的影響因子進行深入了解，進而進行合理地調控。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物病原菌 膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeobosporioides）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、灰霉病菌（Botrytis cinerea）、西瓜猝倒病菌（Pythium aphanidematum），菌種由湖北省生物農藥工程研究中心微生物資源研究室保存，菌株長期保存條件為-80 ℃，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基進行活化傳代后用于試驗。

1.1.2 培養基 全營養固體培養基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基粉40 g/L，美國BD 公司）、半營養固體培養基（馬鈴薯葡萄糖無瓊脂培養基粉12 g/L，美國BD 公司；瓊脂粉15 g/L，DH010-4 型，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）、全營養液體培養基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基粉24 g/L，美國BD 公司）、水瓊脂培養基（瓊脂粉15 g/L，DH010-4 型，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）。

1.1.3 標準品及測試用放線菌菌株 標準品有咪鮮胺（Prochloraz，99.5%）、甲霜靈（Metalaxyl，99.7%）；測試用放線菌菌株有A17815、A22193、A65560，陰性對照菌株為A50052。

1.1.4 放線菌發酵液 放線菌發酵液由湖北省生物農藥工程研究中心微生物資源研究室提供。發酵培養基配方為HB-M-19：葡萄糖5.0 g/L，可溶性淀粉40.0 g/L，玉米粉15.0 g/L，豆餅粉25.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，硫酸銨0.5 g/L，溶于約950 mL 無菌水中，調節pH 7.0，用無菌水調節至1 000 mL。

1.1.5 主要儀器、設備 臺式振蕩器、血球計數板、移液器、光學顯微鏡、DH-S10 型手持式組織勻槳機、手持式紅外測溫儀、超聲波振蕩器、牛津杯［（外徑×內徑×高），7.8 mm×6.0 mm×10.0 mm］、100 mm×100 mm 方形培養板、恒溫培養箱、臺式離心機（EPPENDORF5418 型）、Millex-GP 0.22 μm 過濾器、無菌操作臺、數顯游標卡尺。

1.2 方法

1.2.1 培養基及測試培養板制備 全營養固體培養基、半營養固體培養基、全營養液體培養基、水瓊脂培養基滅菌后備用［1，2］。培養板制備分兩步，第一步制作基層，基層可以用全營養固體培養基或者水瓊脂培養基。基層培養基經加熱后移入空白培養板中，加入量為10 mL，靜置冷卻備用。第二步制作病原真菌層，基層培養基完全冷卻凝固后，把孢子懸浮液或菌絲懸浮液（室溫）與全營養固體培養基（40～45 ℃）按1∶1（V∶V）混合成病原菌懸浮培養基，迅速移入第一層基層表面，輕輕晃動培養板，使病原菌懸浮培養基均勻、完整地覆蓋基層，靜置、冷卻備用。病原菌培養基完全冷卻凝固后，在表面加上牛津杯，每個培養板中加入牛津杯的數量和相鄰牛津杯間的距離可根據試驗樣品的數量進行調整，以保證不同樣品形成的抑菌圈不發生交差重疊為準。

1.2.2 發酵液樣品及標準化合物樣品準備 根據試驗設計的需要，發酵液或標準化合物的用藥量調控使用2 種方式［3，4］。一種是使用固定濃度，通過調整加樣體積來控制用藥量；另一種是使用固定加樣體積，把樣品稀釋成不同濃度。發酵液稀釋為12 個濃度：100%（F）（發酵液原液）、50.00%（F）、25.00%（F）、12.50%（F）、6.25%（F）、3.13%（F）、1.56%（F）、0.78%（F）、0.39%（F）、0.20%（F）、0.10%（F）、0.05%（F）。根據需要把標準化合物配制成合適的濃度。咪鮮胺：1.50、0.75、0.37、0.19、0.08、0.04 mg/L。甲霜靈：1.50、0.75、0.37、0.19、0.08、0.04 mg/L。

1.2.3 供試病原真菌感染液制備 ①灰霉病菌孢子懸浮液制備［5］。灰霉病菌在半徑為45 mm 的平皿中以全營養固體培養基進行培養，培養3 周后產生大量真菌孢子。在平皿中加入10 mL 無菌水，用接種環輕刮培養物表面，獲得孢子懸浮液。如果孢子懸浮液中混有少量菌絲，可用雙層滅菌醫用紗布將菌絲濾除。用血球計數板進行孢子計數。用無菌水稀釋到試驗所需要的濃度，備用。②膠孢炭疽菌、番茄枯萎病菌絲懸浮液制備［6，7］。以全營養液體培養基進行擴大培養，培養1 周后的純培養物移入高速攪拌機，以5 000 r/min 的速度攪拌，用無菌水稀釋到試驗所需要的濃度，備用。③西瓜猝倒病菌絲懸浮液制備［8，9］。以全營養液體培養基進行擴大培養，將培養2 d 后的純培養物移入高速攪拌機，以5 000 r/min的速度攪拌，用無菌水稀釋到試驗所需要的濃度，備用。灰霉病菌孢子懸浮液濃度為10 000 個孢子/mL，膠孢炭疽菌、番茄枯萎病菌、西瓜猝倒病菌菌絲懸浮液濃度為30 000 個菌絲/mL［10，11］。

1.2.4 瓊脂擴散法中活性反應的多樣性

1）活性評價指標［12］。瓊脂擴散法中活性基本表現是在樣品周圍形成抑菌圈，在樣品通量小的情況下，通常直接測量抑菌圈大小（半徑、直徑或面積）來標記活性強度。在高通量篩選中，為了方便統計，通常以分級的方式對活性進行記錄。瓊脂擴散法中不同樣品的活性反應不僅表現在抑菌圈的大小，而且在抑菌圈的邊緣和圈內也有不同的活性反應。所以在本研究中，用2 個指標來對抑菌活性進行記錄。指標一是直接測量抑菌圈半徑，指標二是不考慮抑菌圈大小，按抑菌圈內病原菌生長情況進行分級，分級梯度為0、3、7、9。梯度分級標準：0 表示無抑菌圈；3 表示抑菌圈內菌絲生長密度比對照略小，圈內菌絲生長缺損率在30%以下；7 表示抑菌圈內菌絲生長有部分缺損，圈內菌絲生長缺損率為30%～90%；9 表示抑菌圈邊緣清晰，圈內菌絲生長缺損率在90%以上。

2）瓊脂擴散法中不同樣品的活性反應差異。由于本試驗中要加入的樣品為液態，而且加入樣品體積也不盡相同，為了避免樣品直接加在培養基表面引起樣品擴散面積的差異，所以樣品加入牛津杯中。把幾個測試菌株的發酵液配制成不同濃度，按照試驗要求把不同體積的藥液移入到“1.2.1”中提前制備的培養基表面的牛津杯中。培養條件：溫度20 ℃，相對濕度為70%～80%，黑暗。2 d 后記錄所有抑菌圈半徑（指標1）和抑菌圈內病原菌生長情況（指標2）。

1.2.5 瓊脂擴散法中病原菌菌絲懸浮液處理方法對活性反應的影響試驗 瓊脂擴散法中靶標病原菌菌絲相互交織成網狀，需要進行前處理。菌絲的切割處理可能影響菌絲活力。把菌絲通過高速旋轉的刀片進行切割，制成均勻的菌絲懸浮液，以便菌絲能均勻分布在上層固體培養基中，按“1.2.3”中的方法對膠孢炭疽菌、番茄枯萎病菌和西瓜猝倒病菌絲懸浮液進行切割處理，處理時長分別為1、10、60 s。處理后的菌絲懸浮液按“1.2.1”的方法制備感染培養基。以標準菌株A65560 和陰性對照菌株A50052 作為指示菌。標準菌株A65560 和陰性對照菌株A50052 均使用發酵液，加入樣品量為0.06 mL/孔。培養條件：溫度20 ℃，相對濕度為70%～80%，黑暗。觀察培養2 d 的活性反應，記錄抑菌圈形態和病原菌菌絲覆蓋在培養基表面的狀況。

1.2.6 瓊脂擴散法中病原真菌濃度與活性反應的影響試驗 按“1.2.3”中的方法對膠孢炭疽菌、番茄枯萎病菌和西瓜猝倒病菌絲懸浮液進行切割處理，處理時長分別為60、60、1 s。計數各病原菌懸浮液中菌絲濃度，以無菌水調整菌絲濃度達12 000、6 000、3 000、1 500、750 個/mL。處理后的菌絲懸浮液按“1.2.1”中的方法制備感染培養基。感染培養基終濃度分別為60 000、30 000、15 000、7 500、3 750 個/mL。以標準菌株A65560 和陰性對照菌株A50052 作為指示菌。標準菌株A65560 和陰性對照菌株A50052 均使用發酵液，加入樣品量為0.06 mL/孔，重復3 次。培養條件：溫度20 ℃，相對濕度為70%～80%，黑暗。觀察培養2 d 的活性反應，記錄抑菌圈半徑和病原菌菌絲覆蓋在培養基表面的狀況。

1.2.7 瓊脂擴散法中樣品處理及樣品加入量與活性反應的關系 按“1.2.3”中的方法對膠孢炭疽菌、番茄枯萎病菌和西瓜猝倒病菌絲懸浮液進行切割處理，處理時長分別為60、60、1 s。計數各病原菌懸浮液中菌絲濃度，以無菌水調整菌絲濃度達6 000個/mL。處理后的菌絲懸浮液按“1.2.1”中的方法制備感染培養基。感染培養基終濃度為3 000 個/mL。以標準菌 株A22139、A65560、A19790 和 陰 性 對 照 菌 株A50052 作為樣品菌，以咪鮮胺、甲霜靈為標準化合物樣品。對標準菌株A22139、A65560、A19790 樣品進行如下分類和處理：a.發酵液；b.離心上清液，為發酵液經過4 000 r/min 速度離心所得上清液；c.過濾除菌上清液，為發酵液經過濾除菌體及培養基的濾液；d.濾渣，為發酵液過濾后余下的濾渣（含有菌體及培養基），再以無菌水還原到發酵液同等體積，重復操作5 次后所得懸浮液。所有標準菌株樣品按“1.2.2”中的方法進行稀釋。牛津杯中加入樣品量分別為180、90、45、20、10、5、2 μL。重復3 次。培養條件：溫度20 ℃，相對濕度為70%～80%，黑暗。觀察培養2 d 的活性反應，測量并記錄抑菌圈半徑及抑菌圈形態。

2 結果與分析

2.1 瓊脂擴散法中活性反應的多樣性

瓊脂擴散法中樣品在不同區域分布不均勻，因此與其他要求樣品均勻分布的生物測定方法在活性表現方面有獨特之處。樣品活性受到化合物擴散速率及活性特征（抑制或殺滅）的雙重影響。不同的放線菌發酵液樣品和標準化合物樣品在瓊脂擴散法中的活性反應具有多樣性。3 個樣品的測試濃度如表1 所示，測試結果見圖1。如圖1a 所示，樣品咪鮮胺（行1）及樣品A22139 形成的抑菌圈外緣呈毛刺狀，而樣品A65560 形成的抑菌圈外緣平整；如圖1b、圖1c 所示，抑菌圈半徑與樣品濃度呈正相關，但抑菌圈內病原菌生長特征與樣品濃度無關。

圖1 三個樣品的不同濃度與活性反應的關系

表1 三個樣品的測試濃度

2.2 瓊脂擴散法中靶標病原菌菌絲懸浮液處理方法對試驗的影響

標準菌株A65560 用于顯示抑菌圈的形態，陰性對照菌株A50052 用于比較加樣區域與空白區域病原菌菌絲生長狀態。結果（圖2）表明，3 種病原菌對菌絲破碎時間的反應不同。隨著菌絲破碎時間（1、10、60 s）的延長，膠孢炭疽病菌和番茄枯萎病菌的生長狀況更好，培養基表面的菌絲更加均勻；西瓜猝倒病菌則呈現出相反的結果，即隨著菌絲破碎時間（1、10、60 s）的延長，培養基表面的菌絲分布越不均勻，缺損越嚴重。

圖2 不同菌絲破碎時長對菌絲生長的影響

2.3 瓊脂擴散法中靶標病原菌濃度與活性反應的關系

混入上層培養基中靶標菌的濃度會直接影響培養過程中單位面積菌絲的含量。從圖3a、圖3b、圖3c 可以看出，單一濃度（標準菌株A65560）發酵液，引起的抑菌圈半徑（指標1）與混入培養基中靶標菌的濃度呈負相關，同時抑菌圈半徑也有上限。由表2 可知，抑菌圈內部的靶標菌生長特征（指標2）與靶標菌在培養基中的濃度不相關。

圖3 抑菌圈半徑（指標1）與培養基中靶標菌濃度的關系

表2 抑菌圈內部的靶標菌生長特征（指標2）與培養基中靶標菌濃度的關系

2.4 瓊脂擴散法中樣品處理及樣品加入量與活性反應的關系

由表3 可知，同一個樣品作用于同一靶標所形成的抑菌圈半徑大小與樣品加入量呈正相關。含有活菌的發酵液加入量2～180 μL 都能檢出活性，且活性反應強度隨樣品加入量的減少變化不明顯；標準化合物與過濾除菌的發酵液引起的活性反應相似，僅在幾個較大樣品加入量時才能顯示活性，而且隨著樣品加入量的減少，活性反應明顯變弱；發酵液比經過離心的上清液（仍然含有活菌）表現出更強的活性，經過離心的上清液比過濾除菌的上清液也表現出更強的活性，可見活菌的存在可以提高篩選敏感度。

表3 樣品加入量對抑菌圈半徑（指標1）的影響

由表4 可知，同一個樣品作用于不同靶標，形成的抑菌圈形態不一定相同，但是同一樣品作用于同一靶標所形成的抑菌圈形態完全一致，與樣品加入量無關。

表4 樣品加入量與對抑菌圈形態（指標2）的影響

3 小結與討論

當樣品液加入牛津杯后，一方面，樣品中的殺菌活性化合物以牛津杯為中心向周邊的培養基擴散，當抑菌化合物接觸到已經混在培養基中的靶標菌時，靶標菌的菌絲生長受到抑制，因此形成抑菌圈。抑菌化合物擴散的同時，化合物會被培養基稀釋。以牛津杯為中心，樣品濃度由內向外遞減，對靶標菌的抑制作用也由內向外遞減，當濃度降到不足以形成對靶標菌的生長產生抑制作用時，就形成了抑菌圈的邊界。隨著時間的推移，樣品在培養基中的擴散也在持續，培養基中的化合物濃度一直處于動態變化中。如果樣品不包含活菌，抑菌化合物的濃度會持續下降。如果樣品中含有活菌，活菌仍在產生抑菌化合物，則培養基中的抑菌化合物總量會持續增加，并且維持著一定的動態平衡。另一方面，當靶標菌混入培養基后，靶標菌的菌絲會持續擴張生長，隨著時間的推移，單位面積菌絲含量會遞增，對抑菌化合物的反抑制作用增強。菌絲含量和化合物濃度始終處于動態變化中，因此作為這一動態變化的反應——抑菌圈的形成必定會受到這兩方面的綜合影響。同一放線菌菌株的不同樣品類型活性大小表現為發酵液＞離心上清液＞濾渣＞過濾除菌上清液。直接使用發酵液進行篩選不僅操作簡便，而且提高了篩選的敏感度。使用含活菌的生防菌樣品的篩選要求生物測定的培養過程中，活菌仍然保持正常生長狀態。由于待篩選的大多數放線菌的適應培養基和培養條件并不相同，所以普篩中采用相同培養基和培養條件進行分批處理發酵，活性測試結果也只需確定活性的有無。對于通量要求較大的篩選，初篩可以選擇只使用指標2 作為檢測標準，在復篩中才使用測量抑菌圈半徑的指標1。相對于使用化合物或提取物進行的殺菌活性篩選，直接使用發酵液進行篩選不僅降低了樣品制備的高成本，而且還提高了篩選的敏感度。使用含有活菌的樣品進行的生防菌活性測試綜合考慮了抑菌活性化合物及活菌的單一和協作效果，提高了篩選的敏感度。同時，由于樣品及靶標都處于持續生長狀態中，所以影響活性強度的因素也更復雜，為了提高篩選結果的穩定性，需要根據不同病原菌靶標和樣品特征對篩選細節進行調整［13，14］。此外，感染培養基的混合溫度及基層培養基和含靶標菌的上層培養基厚度也對抑菌圈直徑（指標1）有影響，這些影響均可以通過操作的標準化進行控制。使用牛津杯固定樣品的瓊脂擴散法（在樣品量小或者樣品流動性不影響試驗時，可以不使用牛津杯）在其他微生物源生防殺菌劑篩選中的優勢有待進一步研究。