溫度和氮營養鹽對龍須菜生長與光合生理的影響

陳澤宇，丁雨豪，王靜文，倪嘉璇，何昊林，徐加濤，蔣書英，王津果

（1.江蘇省海洋資源開發研究院/江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心/自然資源部濱海鹽沼濕地生態與資源重點實驗室/江蘇海洋大學海洋科學與水產學院，江蘇 連云港 222005；2.南京審計大學，南京 211815；3.連江羅源灣金牌漁業科技有限公司，福州 350512）

龍須菜（Gracilariopsis lemaneiformis）隸屬于紅藻門（Rhodophyta）江蘺科（Gracilariaceae），是中國重要的大型經濟海藻之一，已被廣泛應用于瓊膠提取、生態修復、食藥研發等諸多領域［1-4］。截至2022 年，龍須菜栽培面積和產量均達到歷史最高值，分別為13 924 hm2、610 824 t（干重），成為中國僅次于海帶的第二大栽培海藻［5］。其中，福建省龍須菜栽培面積11 402 hm2，產量319 078 t，成為中國龍須菜栽培主產區。近年來，受人類活動影響，近岸海水環境因子異常變化，栽培海藻面臨各種環境脅迫如溫度升高、海水酸化、營養鹽變化等，龍須菜生長和產量也受到其潛在影響。溫排水是核電站主要的特征排放物，會對近岸海洋生態系統和海水理化性質產生潛在影響，表現為促使局部海水溫度升高，形成一定的溫升區，溫升區內海水溫度比周邊海域水溫高，并伴隨著營養鹽等的劇烈變化，影響著海洋生物的生長、繁殖和群落結構等［6］。

溫度是影響大型海藻生長、光合生理等的關鍵因素。在適宜的溫度范圍內，藻體的生長速率、光合速率和營養鹽吸收速率等隨著溫度的升高而升高，超過最高耐受溫度后，藻體的光合速率和營養鹽吸收速率等降低，進而抑制其生長，生物量減少［7，8］。前人研究表明，在20～35 ℃溫度范圍內，齒形蕨藻（Caulerpa serrulata）、長莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）、線性硬毛藻（Chaetomorpha linum）、芋根江蘺（Gracilaria blodgettii）和縊江蘺（Gracilaria salicornia）5 種熱帶常見大型海藻對無機N、P 的吸收速率隨著溫度的升高而升高［9］；通過比較10、20、30 ℃培養條件下羊棲菜（Hizikia fusiformis）對無機P 的吸收速率，發現其在20 ℃條件下P 吸收速率最高［10］；Zou等［11］將羊棲菜幼苗置于15、25、35 ℃條件下培養4周后測其生長和光合性能等指標，結果顯示25 ℃處理下羊棲菜幼苗的相對生長速率、光合速率和最大相對電子傳遞速率最高。此外，溫度變化對大型海藻的生化組分及形態結構也會產生影響［12，13］。通過研究帚狀江蘺（Gracilaria edulis）在20～36 ℃溫度范圍內的生長和生化組分變化，發現其最佳生長溫度為28 ℃，且在該培養條件下其相對生長速率及葉綠素a、類胡蘿卜素、藻膽蛋白和可溶性蛋白含量最高［14］；陳若陽［15］比較了15、20、25 ℃溫度處理下石莼（Ulva lactuca）的生長和生化組分的變化，結果表明20 ℃處理下的藻體相對生長速率和葉綠素a、類胡蘿卜素的含量最高。另有研究表明，通過測定不同溫度下裂片石莼（Ulva fasciata）的生長、色素含量和葉綠素熒光參數，發現25 ℃培養的藻體生長速率、葉綠素含量和葉綠素熒光參數值較其他溫度條件下的高［16］。

大型海藻的初級生產力主要取決于海水中營養鹽的供應，營養鹽是影響其生長和光合作用的重要環境因子［17，18］。前人研究發現海水中的N、P 通常是限制性營養物質［19］，因此，N、P 加富能潛在促進大型海藻的生長［20，21］。有研究表明，N 限制是影響溫帶沿海地區大型海藻生長的關鍵因素，P 限制則是影響熱帶沿海地區大型海藻生長的主要因素［18］。隨著N 濃度的增加，龍須菜（Gracilaria heteroclada）的生物量和比生長速率大幅度增加，而有效光合量子產量和瓊膠強度均沒有明顯變化［22］；N 加富促進脆江蘺（Gracilaria chouae）的生長，提高其藻紅蛋白、可溶性蛋白和總氮含量，降低其可溶性總糖含量，對葉綠素a含量沒有顯著影響［23］。另有研究表明，N 加富顯著促進滸苔（Ulva prolifera）的相對生長速率、葉綠素熒光參數、光合速率和溶解無機碳的吸收［24］；李文慧等［25］分析了N 加富對緣管滸苔（Ulva linza）生長和生化組分的影響，結果表明隨著N濃度增加，藻體的相對生長速率、N含量、葉綠素和類胡蘿卜素含量及葉綠素熒光參數持續上升，藻體P含量逐漸降低。

目前已有大量關于龍須菜響應非生物因素如溫度和N 濃度變化的研究［26-28］，但關于二者對其耦合作用的研究少見報道。另外，在田灣核電站溫排水區進行經濟貝藻栽培和養殖已成為高效可行的溫排水海域養殖綜合開發利用技術方法。因此，有必要研究不同溫度和N 濃度條件下龍須菜生長、葉綠素熒光參數、光合色素和可溶性蛋白質含量的變化，探究溫度和N 對其生長和光合生理的影響，旨在為核電站溫排水區進行龍須菜栽培提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及培養條件

試驗用龍須菜隨機采自江蘇省連云港田灣核電站溫排水區。將采集到的藻體置于4 ℃便攜控溫箱中帶回實驗室，用過濾滅菌海水清洗表面的污染物及雜藻，挑選健康藻體，將其剪成2 cm 左右的藻段，置于過濾滅菌海水中，在溫度為20 ℃、光照度為100 μmol/（m2·s）、光周期為12 L∶12 D 的智能光照培養箱（GXZ-500C，寧波江南）中預培養7 d。

1.2 試驗設計

試驗選取溫度和氮營養鹽2 個環境因子，設置2個溫度梯度（lower temperature，LT：20 ℃；higher temperature，HT：24 ℃）和3 個N 濃度（lower nitrogen concentration，LN：3.1 μmol/L；medium nitrogen concentration，MN：30.1 μmol/L；higher nitrogen concentration，HN：103.1 μmol/L），即6 個溫度和N 濃度組合處 理 組（LTLN：20 ℃+3.1 μmol/L；LTMN：20 ℃+30.1 μmol/L；LTHN：20 ℃+103.1 μmol/L；HTLN：24 ℃+3.1 μmol/L；HTMN：24 ℃+30.1 μmol/L；HTHN：24 ℃+103.1 μmol/L），每個組合設3 次重復。培養基為1 份天然海水與9 份人工海水充分混合后的滅菌海水，磷濃度為9 μmol/L（由NaH2PO4提供）。培養基中不添加N，即為LN 培養基（3.1 μmol/L N）；向LN培養基中加入100 μmol/L N（由NaNO3供給），即為HN 培養基（103.1 μmol/L N）；MN 培養基由天然海水（30.1 μmol/L N）提供。將（0.20±0.01）g 藻體置于含滅菌海水的500 mL 圓底通氣瓶中，在室外樓頂500 L 不銹鋼水槽中進行藻體戶外培養，每個水槽溫度由單獨的恒溫機分別控制在20、24 ℃，每2 d 更換一次培養液。

1.3 相關指標的測定

1.3.1 室外太陽輻射測定 使用太陽輻射接收器監測試驗期間每日的太陽輻射量并記錄。太陽輻射（PAR）單位為μmol/（m2·s），日劑量單位為MJ/m2。

1.3.2 相對生長速率的測定 每2 d 稱量1 次藻體質量。使用鑷子取出藻體，吸水紙輕輕吸干其表面水分后，稱量。為減少操作誤差，由同一個人進行稱量，并保持吸水時間和吸水紙層數的一致。另外，應盡量減少在空氣中的干露時間，以防損傷藻體生理活性［18］。相對生長速率（RGR，%/d）計算公式如下［29］：

式（1）中：Wt是第t天藻體的鮮重（g），W0是藻體初始鮮重（g），t是培養天數（d）。

1.3.3 葉綠素熒光參數的測定 待龍須菜生長穩定后，采用手持式PAM 葉綠素熒光儀（AquaPen AP 100，捷克PSI）進行葉綠色熒光參數的測定。分別在8：30、10：30、12：30、14：30、16：30，即每2 h 測定一次有效光合量子產量［Y（II）］。在8個水平的光化光強［0，10，20，50，100，200，500，1 000 μmol/（m2·s）］下測定相對電子傳遞速率［rETR，μmol/（m2·s）］，計算公式如下［30］：

式（2）中：Y（II）是有效光合量子產量；0.5 是吸收與總入射光能的比值；PAR 是光化光強［μmol/（m2·s）］。

快速光響應曲線（RLC）根據EILERS 等［31］進行擬合，計算公式如下：

式（3）中：rETR 為相對電子傳遞速率［μmol/（m2·s）］，PAR 為光化光強［μmol/（m2·s）］，a、b、c為擬合參數。

根據擬合參數計算最大相對電子傳遞速率（rETRmax）、光能利用效率（α）及飽和光強（Ik），計算公式如下：

式（4）至（6）中：a、b、c為擬合參數。

1.3.4 光合色素含量的測定 稱取約0.05 g 藻體置于離心管中，加入5 mL 無水甲醇，于4 ℃黑暗靜置處理24 h，取上清液。紫外分光光度計（Ultrospec 3300 pro，英國安瑪西亞）分別測定其在470、653、666 nm 波長處的吸光度值。葉綠素a（Chl a）和類胡蘿卜素（Car）含量的計算公式如下［32］：

式（7）至（8）中：CChla是葉綠素a 的濃度（mg/g）；CCar是類胡蘿卜素的濃度（mg/g）；A470nm、A653nm、A666nm分別為470、653、666 nm 波長處的吸光度值。

稱取約0.10 g 藻體置于研缽中充分研磨，轉移至含10 mL 磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH=6.8）的離心管中，在4 ℃下5 000 r/min 離心15 min 后取上清液。紫外分光光度計分別測定其在455、564、592 nm 波長處的吸光度值。藻紅蛋白（PE）和藻藍蛋白（PC）含量的計算公式如下［33］：

式（9）至（10）中：CPE是藻紅蛋白的濃度（mg/g）；CPC是藻藍蛋白的濃度（mg/g）；A455nm、A564nm、A592nm分別為455、564、592 nm 波長處的吸光度值。

1.3.5 可溶性蛋白質含量的測定 使用BRADFORD 方法［34］進行可溶性蛋白質（SP）含量的測定。稱取約0.10 g 藻體置于含有5 mL 磷酸鹽緩沖液的研缽中充分研磨，在4 ℃下5 000 r/min 離心10 min 后，取上清液1 mL 與5 mL 考馬斯亮藍染料混合，測定其在595 nm 波長處的吸光度值。

1.4 數據統計及分析

試驗數據均以“均值±標準差（X±SD）”表示。使用SPSS 21.0 和Origin 9.0 軟件處理數據，并進行作圖和統計分析。采用K-S檢驗和Levene 檢驗試驗數據的正態性和方差齊性。利用單因素方差（Oneway ANOVA）分析及Turkey’s 多重比較檢驗處理組間的統計學差異。利用雙因素方差（Two-way ANOVA）分析溫度和N 對龍須菜的RGR、rETRmax、α、Ik及Chl a、Car、PE、PC 和SP 含量的交互作用。以P＜0.05作為差異顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 室外太陽輻射

試驗期間室外太陽輻射（實際光強）變化如圖1a 所示。太陽輻射自7：00 開始逐漸升高，于正午12：00 左右達到最高值，為1 164.55 μmol/（m2·s），之后隨著時間的推移而下降，19：00 左右開始趨于平緩。試驗期間，日PAR 劑量如圖1b 所示，其范圍為3.11～9.64 MJ/m2，15 d的平均日劑量為6.88 MJ/m2。

2.2 不同處理下RGR 的變化

雙因素方差分析結果顯示，溫度和N 對龍須菜的RGR均有顯著影響，且二者交互作用顯著（P＜0.05，表1）。如圖2 所示，在同一溫度條件下，RGR 隨著N濃度的增加呈現出顯著升高的趨勢（P＜0.05）。在HN 培養條件下RGR 達到高值，分別為（16.52±0.19）%/d（LTHN）、（18.59±0.12）%/d（HTHN），比MN處理組分別提高30.59%（LTMN）、20.25%（HTMN），表明N 濃度的增加促進了龍須菜的生長；在LN 培養條件下達到最低值，比MN 處理組分別下降30.43%（LTMN）、36.35%（HTMN），表明N 濃度的下降抑制了龍須菜的生長。此外，在LN、MN、HN 培養條件下，HT 處理組的RGR 均顯著高于LT 處理組（P＜0.05），增幅分別為11.82%、22.21%、12.53%，表明溫度的升高促進了龍須菜的生長。

表1 溫度和N 對龍須菜生長及光合參數影響的雙因素方差分析

圖2 不同處理下龍須菜的相對生長速率

2.3 不同處理下葉綠素熒光參數變化

不同處理下龍須菜的Y（II）的日變化如圖3 所示。不同處理組的Y（II）從8：30 到12：30 逐漸下降，隨后呈現上升趨勢，在16：30 達到峰值。在同一N濃度條件下，HT 處理組的Y（II）在0.18～0.24 范圍內波動，均高于LT 處理組，其Y（II）在0.17～0.21 范圍內波動。同一溫度培養條件下，HN 處理組的Y（II）普遍高于LN 處理組。

圖3 不同處理下龍須菜有效光合量子產量的日變化

由圖4 可知，龍須菜的rETR 隨著光強的增加呈現出先升高后降低的趨勢，在HT 培養條件下較高。通過快速光響應曲線計算得出不同處理條件下龍須菜的rETRmax、α、Ik（表2）。雙因素方差分析結果顯示，溫度對rETRmax有顯著影響，N 對rETRmax、α、Ik有顯著影響（P＜0.05），二者交互作用顯著影響光能利用效率（P＜0.05，表1）。如表2 所示，在同一溫度條件下，藻體的rETRmax、Ik隨著N 濃度增加呈現出先升高后降低的趨勢；在LT 條件下，藻體的光能利用效率隨著N 濃度增加而逐漸升高，在HT 條件下，藻體的光能利用效率隨著N 濃度增加呈現出先降低后升高的趨勢。此外，在LN、HN 培養條件下，HT 處理組的rETRmax顯著高于LT 處理組（P＜0.05），增幅分別為44.41%、42.44%；在LN 培養條件下，HT 處理組的光能利用效率顯著高于LT 處理組（P＜0.05），增幅為57.14%；在同一N 濃度條件下，HT 與LT 處理組間的Ik無顯著差異（P＞0.05）。

表2 不同處理下龍須菜的最大相對電子傳遞速率、光能利用效率和飽和光強

圖4 不同處理下龍須菜的相對電子傳遞速率

2.4 不同處理下色素含量變化

不同處理下光合色素含量變化雙因素方差分析顯示，溫度、N 及二者交互作用對龍須菜的Chl a、Car、PE、PC 含量存在顯著影響（P＜0.05，表1）。

如圖5a 所示，在同一溫度條件下，Chl a 含量隨著N 濃度增加而升高。在HN 培養條件下Chl a 含量達到高值（0.15±0.00）mg/g（LTHN）、（0.19±0.00）mg/g（HTHN），比MN 處理組分別提高15.38%（LTMN）、46.15%（HTMN）；在LN 培養條件下達到低值，比MN處理組分別下降23.08%（LTMN）、15.38%（HTMN）。此外，在LN、HN 培養條件下，HT 處理組的Chl a 含量均顯著高于LT 處理組（P＜0.05），增幅分別為10.00%、26.67%；在MN 培養條件下，HT 和LT 處理組間的Chl a含量無顯著差異（P＞0.05）。

圖5 不同處理下龍須菜的葉綠素a（a）、類胡蘿卜素（b）、藻紅蛋白（c）和藻藍蛋白（d）含量

如圖5b 所示，在同一溫度條件下，Car 含量呈現出與Chl a 含量相同的變化趨勢，即隨著N 濃度增加而升高。在HN 培養條件下Car含量達到高值（0.06±0.00）mg/g（LTHN）、（0.07±0.00）mg/g（HTHN），比MN處理組分別提高20.00%（LTMN）、40.00%（HTMN）；在LN 培養條件下達到低值，比MN 處理組分別下降18.11%（LTMN）、34.08%（HTMN）。此外，在MN、HN培養條件下，HT 處理組的Car 含量均顯著高于LT 處理組（P＜0.05），增幅分別為6.00%、7.94%；在LN 培養條件下，HT 處理組的Car 含量顯著低于LT 處理組（P＜0.05），降幅為14.63%。

如圖5c所示，在同一溫度條件下，PE含量隨著N濃度增加呈現出先降低后升高的趨勢。在HN 培養條件下PE 含量達到高值（0.36±0.01）mg/g（LTHN）、（0.38±0.01）mg/g（HTHN），比MN 處理組分別增加157.14%、111.11%。此外，在MN 培養條件下，HT 處理組的PE 含量顯著高于LT 處理組（P＜0.05），增幅為28.57%；在LN、HN 培養條件下，HT 和LT 處理組間的PE 含量無顯著差異（P＞0.05）。

如圖5d 所示，在同一溫度條件下，PC 含量呈現出與PE 含量相同的變化趨勢，即隨著N 濃度增加呈現出先降低后升高的趨勢。在HN 培養條件下PC含量達到高值（0.37±0.02）mg/g（LTHN）、（0.44±0.02）mg/g（HTHN），比MN 處理組 分別增加146.67%、131.58%。此外，在MN、HN 培養條件下，HT 處理組的PC 含量顯著高于LT 處理組（P＜0.05），增幅分別為26.67%、18.92%；在LN 培養條件下，HT 和LT 處理組間的PC 含量無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 不同處理下SP 含量變化

雙因素方差分析結果顯示，N 及二者交互作用對龍須菜的SP 含量存在顯著影響（P＜0.05），溫度對其無顯著影響（P＞0.05，表1）。如圖6 所示，在同一溫度條件下，SP 含量隨著N 濃度增加而升高。在HN 培養條件下SP 含量達到高值（6.79±0.38）mg/g（LTHN）、（7.12±0.45）mg/g（HTHN），比MN 處理組分別提高68.49%（LTMN）、113.81%（HTMN）；在LN培養條件下達到低值，比MN 處理組分別下降23.57%（LTMN）、2.10%（HTMN）。此外，在MN 培養條件下，HT 處理組的SP 含量均顯著低于LT 處理組（P＜0.05），降幅為17.37%；在LN、HN 培養條件下，HT 和LT 處理組間的SP 含量無顯著差異（P＞0.05）。

圖6 不同處理下龍須菜的可溶性蛋白質含量

3 小結與討論

溫度是影響大型海藻生長、光合作用及生理組分的關鍵環境因子［7］。該研究結果顯示，HT 培養條件下龍須菜的相對生長速率高于LT 培養藻體，表明溫度的升高促進了龍須菜的生長。栽培龍須菜的適宜水溫是12～26 ℃，該研究選取的20 ℃和24 ℃的2個溫度梯度均在其生長的適宜溫度范圍內［35］。在適宜的溫度范圍內，溫度的升高有利于大型海藻的生長，這在長莖葡萄蕨藻、齒形蕨藻、線性硬毛藻、縊江蘺、芋根江蘺［9］和真江蘺（Gracilaria asiatitica）、脆江蘺、蜈蚣藻（Grateloupia filicina）、鼠尾藻（Sargassum thunbergii）、海黍子（Sargassum miyabei）［36］及裂片石莼、腸滸苔（Ulva intestinalis）、壇紫菜（Pyropia haitanensis）［37］中均有報道。上述研究［9，36，37］發現在藻體生長的適宜溫度范圍內，隨著溫度的升高，藻體對營養鹽的吸收能力增強，進而促進其生長。藻紅蛋白和藻藍蛋白是將光能轉化為化學能的關鍵色素，其含量直接影響藻體對光能的吸收與轉換，進而影響捕獲光能后將其轉化為化學能的效率［38］。同時，藻體吸收的光能一部分用來驅動光合作用，另外一部分則以葉綠素熒光的形式釋放出來，進而反映光系統II 的光合情況［7］。該研究結果表明，HT 處理組的相對生長速率、有效光合量子產量、最大相對電子傳遞速率、藻紅蛋白和藻藍蛋白含量均高于LT 處理組，表明溫度的升高促進了龍須菜的葉綠素熒光參數水平及光合色素的合成，與裂片石莼［16，37］、石莼［15］、腸滸苔、壇紫菜［37］、羊棲菜［11］中的研究結果一致。分析原因在于溫度影響了藻類的關鍵生理生化過程，進而影響其葉綠素熒光參數及光合色素的合成，最終影響其生長［7］。

氮作為海藻生長的必需養分之一，藻體內含量僅次于碳、氫和氧，在大型海藻的光合作用、細胞結構和活化物質組成等方面起到了重要作用。該研究結果表明，N 濃度降低抑制龍須菜的生長，其濃度適當增加有利于其生長，這種現象在孔石莼（Ulva pertusa）［39］、龍須菜［22］、脆江蘺［23］、石莼［40］、緣管滸苔［25］中均有報道。究其原因在于N 是海藻生長的營養來源和外部信號，其濃度增加一方面刺激藻體生長相關調控基因合成，另一方面使藻體利用營養鹽進行生長的多個生理過程的底物濃度增加，增強其同化作用，進而促進其生長［22］。此外，該研究結果發現N濃度降低抑制龍須菜葉綠素a、類胡蘿卜素、藻紅蛋白、藻藍蛋白和可溶性蛋白質的合成，其濃度增加促進光合色素和可溶性蛋白質的合成，與緣管滸苔［25］、滸苔［24］、龍須菜［27］中的結果一致。分析原因是N 能夠為藻體內各種蛋白質的合成提供營養原料，其濃度的增加增強了以氮為底物的氮代謝，促進了氮同化物的合成［24］。

研究結果發現，盡管溫度和N 的交互作用對龍須菜的最大相對電子傳遞速率、飽和光強的影響不顯著，但二者交互作用顯著影響其相對生長速率、光能利用效率及葉綠素a、類胡蘿卜素、藻紅蛋白和藻藍蛋白含量，在一定程度上表明龍須菜的生長和光合生理特性受到了溫度和N 的共同作用。在HTHN培養條件下，相對生長速率、有效光合量子產量、最大相對電子傳遞速率、光能利用效率及葉綠素a、類胡蘿卜素、藻紅蛋白、藻藍蛋白和可溶性蛋白質含量均達到最高值，表明在適宜溫度范圍內溫度上升時，N 濃度的適當增加有利于龍須菜的生長。

核電站溫排水直接引起排水口附近海域水溫升高和營養鹽變化等，從而對溫排水海域栽培龍須菜造成一定的潛在影響。文章研究溫度和N 濃度對龍須菜生長和光合生理的影響，結果表明，二者對其生長、葉綠素熒光參數及生化組分均有明顯的交互作用，適宜溫度范圍內溫度升高和N濃度增加均會促進龍須菜的生長。因此，核電站溫排水區環境變化在一定程度上會影響龍須菜的生長，為在核電站溫排水區進行龍須菜栽培提供一定的科學支持和理論依據。