陽春砂與草果葉片解剖結構分析

楊加珍，徐鶴萌，陳 佳，何 偉，曾亞文

（1.云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所/云南省農業生物技術重點實驗室/農業農村部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，昆明 650205；2.普洱學院，云南 普洱 665000；3.紅河麟源農業科技發展有限公司，云南 河口 661300）

陽春砂（Amomum villosumLour.）與草果（Amomum tsaokoCrevost et Lemaire）均為豆蔻屬多年生草本植物。陽春砂屬亞熱帶半陰性植物，喜高溫、高濕，適合生長在600～800 m 低海拔的熱帶、南亞熱帶溫暖濕潤適當陰蔽的闊葉常綠林地，大多栽培或野生于山地陰濕之處。陽春砂分布于云南、福建、廣東、廣西等省，云南省是陽春砂仁的主產區，其藥材產量占全國的70%以上。草果適宜生長在熱帶、亞熱帶濕熱陰蔽的闊葉林中和1 300～1 800 m 高海拔的林下陰濕處［1］，主要分布在中國云南、廣西和貴州三省的局部地區，在云南省主產于南部、東南部和西南部。葉是植物進行呼吸、光合、蒸騰作用的重要器官，是植物應對逆境脅迫最敏感的部位。生長在不同生態環境中的植物，表現出不同的形態結構，是植物對特定生境的演化適應［2］。葉片解剖結構能夠反映植物對環境變化的響應和適應［3］，葉片的表皮結構特征具有一定的遺傳穩定性，在一定程度上葉片的表皮微形態特征可以反映植物類群間的親緣關系，在植物的種間、種內分類上具有重要的研究意義［4，5］。氣孔是植物進行蒸騰作用、光合作用和氣體交換的重要通道，是研究植物間親緣關系的重要器官［6，7］，氣孔研究已在許多植物中有報道。何荊洲等［8］揭示了25 個蝴蝶蘭品種葉片的氣孔特征指標作為形態指標和評價的重要依據。徐梅等［9］研究得出薯蕷屬（DioscoreaL.）植物葉表皮微形態存在差異，可作為種間分類的依據。陳方永等［10］用楊梅葉片氣孔的相似度作為區別楊梅品種的重要依據。王連珍等［11］揭示櫟屬（QuercusL.）植物葉片氣孔的穩定性特征，可作為該屬植物親緣關系分析和分類的重要依據。近年來在草果與陽春砂在產業發展［12，13］、揮發油的提取［14］、化學成分的鑒定［15］、藥理作用［16］、真假砂仁辨別［17］等研究方面取得了一定的進展，但對其解剖學方面的研究較為鮮見。黃桂玲［18］揭示了砂仁的葉片為背腹型葉，氣孔常分布于下表皮，下表皮還含有油細胞，有一層柵欄組織，海綿組織較疏松，含有草酸鈣結晶，葉脈表面的表皮中含有單個的圓球形的硅質體。唐源江等［19］研究豆蔻屬（AmomumL.）的12 種植物葉片得出砂仁的遠軸面和近軸面均有一層不連續的下皮層，且遠軸面下皮層細胞體積小，近軸面下皮層細胞體積大；草果沒有下皮層細胞，砂仁與草果的葉肉均有1 層柵欄組織，且砂仁葉肉組織含有少量方晶。唐源江等［20］對28 種姜科（Zingiberaceae）植物進行了研究，表明3 種豆蔻屬（AmomumL.）植物的根表皮均由1 層表皮細胞組成，其中砂仁與草果的根含有表皮毛；皮層都由薄壁細胞組成，其中內皮層細胞壁均呈U 形增厚，野草果較明顯，砂仁和草果則不明顯。為了解豆蔻屬2 種植物陽春砂與草果的形態特征及葉解剖結構，本研究采用指甲油印痕法和超薄切片法制片，對2 種植物葉片的上、下表皮氣孔情況、葉片的橫切面以及葉片超微觀結構比較分析。探討二者結構是否存在差異性及葉片形態特征的種間差異，揭示其葉片形態差異的多樣性，以期為豆蔻屬植物的分類和親緣關系研究提供依據，也可以為適應溫暖濕潤及其陰蔽的林下山區溝谷林栽培提供解剖結構依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物材料 陽春砂植株，采自云南省紅河州河口縣老放寨鄉沙仁基地（海拔約700 m），屬于紅河麟源農業科技發展有限公司；草果植株，采自云南省文山州馬關縣。

1.1.2 試驗設備 超薄切片機（EM UC7 型）、倒置熒光顯微鏡（DMI 4000B 型）、玻璃制刀機（EM KMR3 型）、修塊機（EM TRIM2 型）、組織處理機（EM TP 型），德國Lecia 公司；透射電子顯微鏡（TECNAI SPIRIT G2 型），美國FEI公司。

1.1.3 試驗試劑 2.5%戊二醛固定液、0.1 mol/L PBS 緩沖液、1.0%鋨酸、去離子水、無色指甲油、包埋劑、乙醇溶液（30.0%、50.0%、70.0%、80.0%、95.0%、100.0%）、丙酮、甲苯胺藍染液、醋酸雙氧鈾染液、檸檬酸鉛染液。

1.1.4 試驗耗材 玻璃刀、濾紙、雙面刀片、鑷子、牙簽、載玻片、2 mL 離心管、0.5 mL 離心管、蓋玻片、膠頭滴管、酒精燈、透明膠帶。

1.2 方法

1.2.1 植物葉片上、下表皮氣孔觀察 采用指甲油印痕法［21］制片，取植物葉片中部葉脈兩側部分，切成1 cm×2 cm 的小塊，在葉片上、下表皮分別涂一層無色指甲油，待風干后小心用透明膠帶將葉片上、下表皮指甲油輕輕撕下，置于載玻片上制片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，標記氣孔數量、計數，測量氣孔大小及氣孔開度。每片葉片制作3 張切片，每張切片選取10 個清晰視野，分別測量相關指標，取平均值作為該葉片的相關指標數據。

1.2.2 植物葉片橫切面解剖結構觀察 參考鄧立紅［22］的超薄切片技術制片，并加以改進，具體步驟如下：①取樣，采集無病植物葉片，沿著葉脈紋理用雙面刀片切成長條，于載玻片上再分段切成1 mm×2 mm 的小長條，切好后迅速用牙簽挑取放入有2.5%的戊二醛溶液的2 mL 離心管中；②抽真空，放入真空儀中抽真空5 min，抽去氣泡（空氣），使樣品完全浸沒于2.5%戊二醛溶液中；③前固定，2.5%戊二醛溶液固定72 h；④漂洗，用0.1 mol/L 的PBS 緩沖液（磷酸鹽緩沖劑和鹽水組成）漂洗3 次，15 min/次；⑤后固定，1.0% 鋨酸固定1.5 h；⑥再漂洗，用0.1 mol/L 的PBS 漂洗3 次，15 min/次；⑦梯度脫水，30.0%、50.0%、70.0%、80.0%、90.0%、95.0%、100.0%乙醇溶液各級脫水15 min；⑧脫水，100.0%乙醇溶液二次脫水20 min 后，丙酮脫水20 min；⑨包埋，包埋劑+丙酮（1∶1）室溫1 h，包埋劑+丙酮（3∶1）室溫3 h；⑩純包埋過夜，用牙簽輕輕地從2 mL 離心管中取出樣品放在濾紙上，吸干液體（包埋劑+丙酮），選取2 個切樣好的樣品用牙簽挑起，裝入0.5 mL 離心管中（垂直背靠埋在純包埋劑底部），重復3 次；○1聚合，放入聚合箱中，60 ℃聚合24 h，聚合2 次；○12樹脂修塊，聚合成型后，取出樹脂包埋塊，切片機上修去多余樹脂，修成梯形，便于進行半薄定位；○13半薄定位，把多余的樹脂修掉，露出組織塊，便于進行超薄切片，同時，制成半薄切片，用甲苯胺藍染色后再用倒置熒光顯微鏡觀察葉片橫切面解剖結構并拍照；○14超薄切片，將修好的生物樣品切片，厚度50～70 nm，用醋酸雙氧鈾染液和檸檬酸鉛染液染色；在透射電子顯微鏡下觀察超微結構并拍照。

2 結果與分析

2.1 陽春砂與草果葉片表皮氣孔特征比較

如圖1 所示，在觀察的陽春砂和草果葉片材料中，上、下表皮均有氣孔分布，下表皮氣孔分布較多（圖1A、圖1B），下表皮氣孔分布不規則；上表皮氣孔分布較少，且上表皮氣孔大多分布在葉脈附近（圖1C、圖1D）。2 種植物的氣孔器均由2 個保衛細胞和2 個副衛細胞組成，保衛細胞為腎形保衛細胞，副衛細胞近半圓形（圖1E、圖1F、圖1G、圖1H），氣孔器微向外凸。

圖1 陽春砂與草果葉片上、下表皮氣孔分布情況

如表1 所示，陽春砂和草果葉片的氣孔存在一定差異，其中陽春砂葉片的上、下表皮氣孔數目分別比草果葉片的上、下表皮氣孔數目多；草果的上、下表皮氣孔長度比陽春砂的上、下表皮氣孔長度長；草果的上、下表皮氣孔寬度分別比陽春砂的上、下表皮氣孔寬度略寬；草果的上表皮氣孔開度比陽春砂的上表皮氣孔開度略大，草果的下表皮氣孔開度較陽春砂的下表皮氣孔開度小。

表1 陽春砂與草果葉片的上、下表皮氣孔比較

陽春砂的上、下表皮氣孔也存在差異，下表皮氣孔數目比上表皮氣孔數目多13.7 倍，下表皮氣孔寬度比上表皮氣孔寬度寬17.4%，下表皮氣孔開度比上表皮氣孔開度大89.5%，下表皮氣孔長度比上表皮氣孔長度短10.6%。

草果的上、下表皮氣孔也存在差異，草果的下表皮氣孔數目比上表皮氣孔數目多12.5 倍，下表皮氣孔長度比上表皮氣孔長度長12.1%，下表皮氣孔寬度比上表皮氣孔寬度寬15.6%，下表皮氣孔開度比上表皮氣孔開度小42.3%。

2.2 陽春砂與草果葉片橫切面解剖結構特征差異比較

如圖2A、圖2B 所示，從橫切面來看，2 種植物均為異面葉，陽春砂與草果的葉片均由表皮、葉肉和葉脈3 個部分組成。表皮分為上表皮和下表皮，表皮由單層表皮細胞組成，分別稱為上表皮細胞和下表皮細胞。表皮細胞近方形或不規則形，排列緊密，上表皮細胞較大，下表皮細胞較小。下表皮可觀察到氣孔器，對應氣孔器的位置內側處有孔下室。葉肉均包括柵欄組織和海綿組織，二者均有一層柵欄組織，海綿組織不規則分布，有2～6 層細胞不等。草果葉片的柵欄組織和海綿組織的分化較明顯（圖2B），陽春砂葉片的柵欄組織和海綿組織的分化則不太明顯，且草果的柵欄組織排列更加整齊、規則。草果的上、下表皮細胞比陽春砂的上、下表皮細胞大。葉脈均由維管束鞘、木質部、韌皮部組成。

2.3 陽春砂與草果葉片電鏡超微觀結構特征比較

陽春砂與草果的葉片超微觀結構如圖3A、圖3B 所示，其葉肉細胞共有的細胞結構有細胞壁、細胞膜、細胞質、細胞核，原生質體有葉綠體、線粒體。不同的是陽春砂葉片葉肉細胞的葉綠體中含有白色結晶狀的淀粉粒、黑色圓點狀的嗜鋨顆粒，細胞質中含有黑灰色圓點狀的內生菌（圖3A），而草果葉片葉肉細胞的葉綠體中含有灰色圓點狀的脂滴，細胞質中不含內生菌（圖3B）。陽春砂與草果葉片下表皮超微結構的氣孔由2 個保衛細胞圍合而成（圖3C、圖3D），陽春砂的保衛細胞中含有葉綠體，葉綠體中含有淀粉粒（圖3C）；草果的保衛細胞中也有葉綠體，但不含淀粉粒（圖3D）。

圖3 陽春砂與草果葉片橫切面超微觀結構

3 討論

3.1 陽春砂和草果葉片氣孔特征

本研究觀察發現，2 種植物的氣孔器均由2 個保衛細胞和2 個副衛細胞組成，保衛細胞均為腎形保衛細胞，副衛細胞近半圓形。邱東萍等［23］、林植芳等［24］研究表明，陽生植物的氣孔都分布在下表皮，而陰生植物的上、下表皮都有氣孔分布，只是上表皮氣孔分布較少，下表皮氣孔分布較多。陽春砂和草果2 種植物葉片的氣孔上、下表皮均有分布，但大多分布于下表皮，這與黃桂玲［18］對砂仁的研究結果相吻合，與唐源江等［19］對豆蔻屬12 個種的葉片橫切面解剖結構觀察結果一致。陽春砂與草果葉片氣孔的分布特點說明二者具備半陰生植物的結構特征。

3.2 陽春砂和草果葉片橫切面超微結構特征

近年來，對豆蔻屬植物的研究主要集中在葉片表皮表觀特征方面［18，19］，對葉片橫切面結構的研究較為鮮見，本研究主要采用超薄切片法對陽春砂和草果葉片切片后，再用透射電子顯微鏡對其葉片橫切面的解剖結構進行觀察分析。吳濤等［25］研究表明發達的海綿組織是葉片對水分充足、弱光環境的一種適應特性，草果和陽春砂柵欄組織不發達，海綿組織較發達可能是對濕熱陰蔽的闊葉林下、林邊陰濕處條件適應的結果。柵欄細胞是葉片進行光合作用、制造有機物的主要場所，其發達程度與光合強度直接相關，反映植物光合組織的生境適應能力，其厚度影響光合作用中對水分和光能的利用效率［26］。草果的柵欄組織排列整齊，且柵欄組織和海綿組織的分化較明顯，而陽春砂的這2 種組織分化不太明顯，表明草果的光合作用可能更強一些。

本研究發現，陽春砂與草果葉片下表皮超微結構的氣孔由2 個保衛細胞圍合而成，氣孔器的保衛細胞中有葉綠體，蔣雅婷等［27］也觀察到了這一特征。陽春砂和草果的葉肉細胞中葉綠體數目都比較多，但陽春砂的葉綠體內淀粉粒比較大、比較多，這與朱巧玲等［28］觀察的半陰生植物石斛的超微結構相似，這可能是陽春砂和草果長期生長于林下陰蔽環境的結果。嗜鋨小滴的主要成分是葉綠體內的親脂性脂類物質，其生理功能可能是提供脂類倉庫的作用。姜建福等［29］對葡萄屬植物葉片的顯微和超微結構研究表明有些葡萄葉綠體中含有較多的嗜鋨顆粒，預示著含有較強的抗性。范燕萍等［30］對花葉線藝蘭葉片的超微結構研究時在基粒中觀察到有較多較大的淀粉粒，在基質中存在較多嗜鋨滴。陽春砂葉片葉綠體中有較分散且數量少的嗜鋨顆粒，草果中并未發現嗜鋨顆粒，卻積累了較多的脂滴，表明陽春砂對環境的適應性可能會更強一些，還有待進一步的研究。

觀測植物葉片的方法有很多，如印痕法、刮去葉肉法、明膠印跡法、超薄切片法、石蠟切片法等。石蠟切片法和超薄切片法一般適用觀察植物組織的橫切面，本研究采用超薄切片法，而超薄切片對植物組織的要求較高，陽春砂的葉片質地結構緊密，切成的超薄切片容易產生褶皺，影響觀察效果。制作半薄切片時不易得到完整的葉片橫切面，且葉片表面革質，用指甲油印痕法制片印痕效果不佳，拍照后圖片不夠清晰。此外，其他的一些結構特征未能觀察到，存在局限性，試驗方法有待進一步改進。且超薄切片制成的切片較小只能得到部分橫切面，張大鵬等［31］采用冷凍切片法制成的切片觀察效果較好，進一步研究時可采用此種方法。

4 小結

研究表明，陽春砂和草果具備半陰生植物的結構特征，體現出對半陰生環境的適應性。2 種植物雖同屬，大部分結構相似，但還是存在一定的結構差異，這些差異特征較為穩定且均是2 種植物長期適應林下陰濕環境的結果。本研究從電鏡超微觀方面觀察豆蔻屬2 種植物的細胞結構，為該屬植物的進一步研究提供了一定的解剖依據，同時為適應溫暖濕潤、陰蔽的林下生長的植物提供解剖結構依據。