白簕根皮乙酸乙酯部位鎮痛抗炎及抗氧化活性研究

梁資就，蔣 林，林青華，林昌源，張仁義，黃小洪，賴信宏，謝孟姣，陳海燕，李芳嬋

（廣西中醫藥大學/廣西高校中藥制劑共性技術研發重點實驗室/廣西壯瑤藥工程技術研究中心，南寧 530200）

白簕［Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr］又名三加、白簕花、簕鉤菜，是五加科五加屬的攀援狀灌木，在中國主要分布于廣西、廣東、云南、臺灣等地［1］?，F代研究表明，白簕主要含有黃酮類、酚類、多糖類、萜類、揮發油類等多種化學成分［2］，具有降血糖、抗炎鎮痛、抗氧化、抗菌等多種生物活性［3］，臨床可用于治療肋間神經痛、風濕性關節腫痛、腰腿疼痛、跌打損傷等。白簕作為一種藥食同源類植物，其嫩葉脆爽、清香，在南方地區常被作為蔬菜或茶葉使用，現已得到學者的廣泛關注［4-6］。白簕的根或根皮入藥稱為三加皮，具有祛風除濕、清熱解毒、散瘀止痛的功效，常用于治療風濕痹痛、濕熱痢疾、黃疸［7］。然而，關于白簕根或根皮的研究卻并不充分，這不利于白簕藥用價值的深入開發，故亟需對其化學成分、藥理活性等方面進行系統研究。

廣西中醫藥大學藥學院課題組前期研究發現白簕根皮的乙酸乙酯部位（BLE）具有較好的生物活性，故本研究以白簕根皮乙酸乙酯部位（BLE）為研究對象，擬采用熱板法、醋酸扭體法、二甲苯致小鼠耳腫脹模型、角叉菜膠致小鼠足腫脹模型及前列腺素E2（PGE2）炎癥介質含量測定對其鎮痛抗炎活性進行研究，并采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法和2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）法對其體外抗氧化能力進行評價，以期為白簕根皮的深入開發提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材及動物 白簕根皮購自廣西玉林藥材市場，經廣西中醫藥大學朱意麟高級實驗師鑒定為五加科五加屬植物白簕的干燥根皮。SPF（無特定病原體動物，Specific pathogen free）級昆明種小鼠（20±2）g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供（許可證號：SCXK 桂2020-0003）。試驗前動物適應性飼養3 d，動物試驗獲得了廣西中醫藥大學實驗動物倫理委員會的批準。

1.1.2 試劑和儀器

1）主要試劑。DPPH 自由基清除能力試劑盒（蘇州格銳思生物科技有限公司，批號：G20220309G）；ABTS 自由基清除能力試劑盒（蘇州格銳思生物科技有限公司，批號：G20220309G）；雷公藤多苷片（遠大醫藥黃石飛云制藥有限公司，批號：20201101）；維生素C 片（東北制藥集團股份有限公司，批號：5210904）；吐溫-80（藥用輔料級，湖南爾康制藥股份有限公司）；甲醇、冰醋酸、無水乙醇、氫氧化鉀、二甲苯、角叉菜膠均為市售分析純。

2）主要儀器。UV-1900i 型紫外分光光度計，島津儀器（蘇州）有限公司；1056310 型冷熱板刺痛儀，北京眾實迪創科技發展有限責任公司；H1650-W 型醫用離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；KQ5200B 型超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；N-1300 型旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；ME204 型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 白簕根皮乙酸乙酯部位溶液的制備 稱取白簕根皮粗粉，加10 倍質量60%乙醇溶液回流提取2次，第一次2.0 h，第二次1.5 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，合并萃取液，回收溶劑，即得。動物試驗前以2%吐溫-80 將其制成懸濁液，備用。

1.2.2 熱板致痛試驗 參照文獻報道方法［8-10］并略做改進：將熱板測痛儀溫度調節至（55±1）℃，將小鼠置于熱板上，篩選出痛閾值在5～30 s 的小鼠進行試驗。選取合格小鼠50 只，隨機分為空白組（2%吐溫-80 溶液）、雷公藤多苷片組（0.1 g/kg）和BLE 高劑量組（26.68 g/kg）、中劑量組（13.34 g/kg）、低劑量組（6.67 g/kg），每組10 只；測定小鼠基礎痛閾值后連續灌胃給藥7 d，每天2 次，分別于末次給藥30、60、90 min 后測定小鼠的痛閾值。

1.2.3 醋酸扭體試驗 參照文獻報道的方法［11］并略做改進，動物分組及給藥方法同“1.2.2”，末次給藥30 min 后，小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液，5 min后觀察并記錄小鼠15 min 內的扭體次數，按式（1）計算。

1.2.4 二甲苯致耳腫脹小鼠模型試驗 參考劉婧等［8］的方法并略做改進：動物分組及給藥方法同“1.2.2”，末次給藥1 h 后，在小鼠右耳廓內外兩面均勻涂抹0.05 mL 二甲苯，左耳不涂，30 min 后處死小鼠，沿小鼠耳根部剪下小鼠兩耳，用直徑6 mm 的打孔器在左右耳相同位置沖下圓形耳片，稱重，分別按式（2）和式（3）計算耳腫脹度（mg）和耳腫脹抑制率（%）。

1.2.5 角叉菜膠致小鼠足腫脹模型試驗及PGE2炎癥介質含量測定 參考文獻報道方法［12］并略做改進：動物分組及給藥方法同“1.2.2”，末次給藥30 min 后，在小鼠右后足趾中部皮下注射1%角叉菜膠溶液0.03 mL，建立足腫脹模型；4 h 后處死動物，剪取小鼠右后足及左后足，分別稱重，分別按式（4）和式（5）計算足腫脹度和足腫脹抑制率。將小鼠右后足充分剪碎置于2 mL 生理鹽水中浸泡2 h 后，于12 000 r/min 離心15 min，取上清液0.5 mL，加入0.5 mol/L 的氫氧化鉀甲醇溶液1.5 mL，置于50 ℃水浴反應20 min，取出放涼至室溫，加2.5 mL 甲醇溶液稀釋，于278 nm 處測定吸光度（A），以吸光度作為PGE2含量，并按式（6）計算炎癥抑制率。

1.2.6 DPPH 自由基清除能力的測定 參考文獻報道的方法［13，14］并略做改進。取150 μL 不同濃度的BLE 溶液（0.02、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL，溶劑為80%甲醇溶液）與150 μL 的DPPH 自由基溶液（按試劑盒說明書配制）置于EP 管中，混勻，室溫下避光反應30 min，取200 μL 置于96 孔板中，于517 nm 處測定吸光度，記做A樣品，按上述方法用等量80%代替DPPH 測定相應樣品，所得吸光度記作A對照，按上述方法用等量80%甲醇溶液代替樣品溶液進行測定，所得吸光度記作A空白，同時以維生素C 片為陽性對照。每組重復測定3 次，按式（7）計算清除率，繪制清除率曲線，計算IC50。

1.2.7 ABTS 自由基清除能力的測定 參考文獻報道的方法［15，16］并略做改進。取10 μL 不同濃度的BLE 溶液（濃度同“1.2.6”）和190 μL 的ABTS 自由基溶液（按試劑盒說明書配制）置于96 孔板中，室溫避光反應6 min，于734 nm 處測定吸光度，記作A樣品，按上述方法用等量無水乙醇代替ABTS 溶液測定相應樣品，所得吸光度記作A對照，按上述方法用等量無水乙醇代替樣品溶液進行測定，所得吸光度記作A空白，同時以維生素C 片為陽性對照。每組重復測定3次，按式（7）計算清除率，繪制清除率曲線，計算IC50。

1.2.8 數據處理 數據采用SPSS 21.0 軟件和Excel 2010 軟件進行處理，試驗數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 認為有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 熱板致痛的試驗結果

由表1 可知，與空白組相比，BLE 溶液各劑量組和雷公藤多苷片組在60 min 時痛閾值均有顯著或極顯著提高；與給藥前相比，除90 min 低劑量組外，BLE 各劑量組和雷公藤多苷片組在各時間點的痛閾值均有顯著或極顯著提高，且各劑量組與雷公藤多苷片組相比，在各時間點均無顯著性差異。結果表明，BLE 溶液各劑量組均具有類似雷公藤多苷片組的鎮痛效果，其中尤以高劑量組為佳。

2.2 醋酸扭體的試驗結果

由表2 可知，與空白組相比，BLE 溶液各劑量組和雷公藤多苷片組均能極顯著減少小鼠醋酸扭體次數，明顯提高對小鼠疼痛的抑制率，且各劑量組的劑量與對疼痛的抑制率呈正相關。結果表明，BLE 溶液各劑量組對醋酸誘發的小鼠疼痛具有良好的抑制作用，且與雷公藤多苷有不一樣的疼痛抑制效果。

表2 BLE 溶液對小鼠醋酸扭體的影響

2.3 二甲苯致耳腫脹小鼠模型的試驗結果

由表3 可知，與空白組相比，BLE 溶液各劑量組和雷公藤多苷片組均能顯著或極顯著降低二甲苯所致的小鼠耳腫脹度，且雷公藤多苷片組與各劑量組間無顯著性差異；BLE 溶液各劑量組的劑量與炎癥抑制率略呈負相關，低劑量組炎癥抑制率稍高于雷公藤多苷片組。結果表明，BLE 溶液各劑量組均具有與雷公藤多苷片組類似的抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹的作用，低劑量組效果最優。

表3 BLE 溶液對二甲苯致耳腫脹小鼠模型的影響

2.4 對角叉菜膠致小鼠足腫脹的試驗結果

由表4 可知，與空白組相比，BLE 溶液高劑量組和雷公藤多苷片組均能極顯著降低角叉菜膠致小鼠足腫脹的腫脹度，兩組間無顯著差異，且高劑量組的炎癥抑制率高于雷公藤多苷片組。結果表明，BLE溶液高劑量組抑制角叉菜膠致小鼠足腫脹的作用與雷公藤多苷片組作用相當，但中、低劑量組抑制效果不明顯。

表4 BLE 溶液對角叉菜膠致小鼠足腫脹模型的影響

2.5 PGE2炎癥介質含量的測定結果

由表5 可知，與空白組相比，BLE 溶液高、中劑量組和雷公藤多苷片組中PGE2的含量均極顯著降低，且3 組間無顯著差異，中劑量組對炎癥介質PGE2的抑制率與雷公藤多苷片組較為接近。結果表明，BLE 溶液高、中劑量組抑制PGE2炎癥介質的效果與雷公藤多苷片組類似。

表5 BLE 溶液對PGE2炎癥介質的影響

2.6 BLE 溶液對DPPH 自由基清除能力的影響

如圖1 所示，當藥液濃度低于0.15 mg/mL 時，BLE 溶液和維生素C 的濃度與DPPH 自由基清除率呈正相關，且BLE 溶液的作用效果優于維生素C；經計算，BLE 溶液與維生素C 的IC50分別為0.029、0.040 mg/mL。結果表明，BLE 溶液清除DPPH 自由基的能力強于維生素C。

圖1 BLE 溶液對DPPH 自由基的清除能力

2.7 BLE 溶液對ABTS 自由基清除能力的影響

如圖2 所示，在濃度為0.02～0.20 mg/mL 時，BLE溶液和維生素C 的濃度與ABTS 自由基清除率呈正相關，經計算，BLE 溶液的IC50為0.033 mg/mL，維生素C 的IC50為0.042 mg/mL。結果表明，BLE 溶液對ABTS 自由基的清除能力與維生素C 相當。

圖2 BLE 溶液對ABTS 自由基清除能力的影響

3 討論

疼痛是臨床上由外傷或疾病引起的常見癥狀，緩解疼痛的藥物可分為中樞性鎮痛藥和解熱鎮痛抗炎藥兩大類。中樞性鎮痛藥的鎮痛效果與阿片受體有關，對急性疼痛有很好的緩解作用；解熱鎮痛抗炎藥主要作用于外周神經系統發揮療效，能夠減少炎癥所造成的疼痛［17］，雷公藤多苷片即為該類臨床常用藥，故本研究以此作為陽性藥。熱板致痛試驗和醋酸扭體試驗分別是研究急性疼痛和炎性疼痛的經典模型，本研究在熱板致痛試驗中發現，與空白組相比，BLE 溶液各劑量組在給藥60 min 后具有與雷公藤多苷片相似的鎮痛效果，且高劑量組鎮痛效果可持續到90 min；在醋酸扭體試驗中發現，BLE 溶液各組呈劑量依賴性的減少小鼠扭體次數，提高疼痛抑制率。由此推斷，BLE 溶液有良好的鎮痛效果。

炎癥是機體對損傷刺激因子所產生的一種防御反應［18］，同時會產生大量的炎癥介質，PGE2作為其中的一種炎癥介質，在炎癥發生的過程中發揮重要作用。本研究在通過二甲苯致小鼠耳腫脹、角叉菜膠致小鼠足腫脹模型探討BLE 溶液抗炎效果過程中發現，BLE 溶液各劑量均能有效抑制二甲苯所致的小鼠耳腫脹度，且效果與雷公藤多苷片相近；BLE溶液高劑量組對角叉菜膠引起小鼠足腫脹的抑制效果與雷公藤多苷片相當，且BLE 溶液高、中劑量組中PGE2含量顯著降低。試驗表明，BLE 溶液具有良好的抗炎效果。

自由基是生命過程中的代謝產物，其參與生命代謝的各個環節，機體自由基的產生與清除處于一種動態平衡中，若自由基過多且不能及時被清除，則會加速衰老，誘發各種疾病，甚至腫瘤［19］。本研究采用DPPH 法、ABTS 法評價BLE 溶液的抗氧化能力，結果表明，BLE 溶液對自由基的清除能力與濃度呈正相關，且抗氧化的能力相當或略優于維生素C。結果表明，BLE 溶液具有較好的體外抗氧化能力。

綜上所述，白簕根皮乙酸乙酯部位有良好的鎮痛抗炎和抗氧化活性，為白簕根皮深入開發研究提供了試驗依據，同時，其鎮痛抗炎的作用機制及其體內抗氧化能力仍需進一步研究。