棕黑錦蛇鱗片特征、脂肪酸和肌肉單糖分析

黃笑然，楊文建，萬祥旭，周思宇，周寶麗，孟 鑫，金志民

（牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

棕黑錦蛇（Elaphe schrenckii）是錦蛇屬（Elaphe）動(dòng)物，人工養(yǎng)殖條件下的棕黑錦蛇在觀賞和食用方面具有較大經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其鱗片特征、脂肪酸和單糖的組成與含量可以對(duì)棕黑錦蛇經(jīng)濟(jì)和保護(hù)價(jià)值進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)資料。相關(guān)學(xué)者對(duì)烏梢蛇及7 種常見蛇類混淆品的鱗片進(jìn)行對(duì)比分析［1］，有研究采用GC-MS 法鑒定出尖吻蝮蛇（Spilotes pullatus）油中的20 種脂肪酸［2］，相關(guān)研究采用氣相色譜法對(duì)微生物單糖、百合多糖和茶多糖樣品中的單糖含量進(jìn)行測(cè)定［3］，棕黑錦蛇鱗片形狀顏色和數(shù)目種類具有明顯特有的性狀。脂肪中脂肪酸和肌肉中單糖的種類與相對(duì)含量也是其食用和藥用價(jià)值的判斷標(biāo)準(zhǔn)之一。棕黑錦蛇鱗片特征為蛇類混淆品鑒定提供基礎(chǔ)資料，探究脂肪酸和單糖的種類與相對(duì)含量，對(duì)棕黑錦蛇食用和藥用價(jià)值的研究進(jìn)行一定補(bǔ)充，進(jìn)一步明確棕黑錦蛇的保護(hù)意義和價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物為2021 年8 月于牡丹江市三道關(guān)林場(chǎng)道路上遭車輛碾壓瀕死的棕黑錦蛇。三道關(guān)林場(chǎng)（129°17′—129°35′E，44°41′—44°51′N）位于牡丹江市西北部，距市區(qū)24 km。

1.2 儀器與試劑

7890A 型氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；SCIENTZ-10N 型冷凍干燥機(jī)，SB-5200DT 型數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RE-5286A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SteREO Discovery V8 型體視顯微鏡（德國ZEISS 公司）；MD-3500 型透析袋（北京翊博生物集團(tuán)有限公司）；葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、果糖購自上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、95%乙醇溶液、氯化鈉、氫氧化鈉、甲醇、吡啶、三氟乙酸、三氯乙酸、鹽酸羥胺、乙酸酐、正己烷、石油醚（30～60 ℃和60～90 ℃）均為市售分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鱗片分析 將棕黑錦蛇頭部表面用清洗液清洗干凈后自然晾干。背部鱗片于超聲波清洗器中清洗10 min，再用去離子水于超聲波清洗器中清洗10 min，重復(fù)3 次，自然晾干；無水乙醇中浸泡3 h 對(duì)自然晾干后背部鱗片進(jìn)行脫水，脫水后鱗片用2 片載玻片夾住，并用夾子夾緊以防止鱗片蜷縮。在解剖鏡下對(duì)頭部頂面、側(cè)面和背部鱗片進(jìn)行觀察拍攝記錄。

1.3.2 脂肪酸組成測(cè)定 稱取40 g 脂肪組織研磨至勻漿，按料液比1∶10（g∶mL）加入正己烷與石油醚（沸程60～90 ℃）的混合溶劑（正己烷和石油醚體積比1∶1），采用超聲波輔助提取法提取脂肪酸，超聲功率為200 W，溫度55 ℃，超聲時(shí)間2 h。抽濾去除殘?jiān)梅忠郝┒啡∩锨逡海?jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（40 ℃）去除有機(jī)溶劑后利用分液漏斗取上清液，即為棕黑錦蛇粗蛇油。

甲酯化：取4～5 滴脂肪酸樣品與2 mL 氫氧化鈉-甲醇溶液（2 mol/L）充分振蕩，沸水浴加熱5 min，冷卻至室溫后加入2 mL 正己烷充分振蕩，靜置分層取上清液供氣相色譜分析。

色譜條件：毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm），載氣為氮?dú)猓至鞅?00∶1，進(jìn)樣體積1 μL，進(jìn)樣口溫度270 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃。初始溫度100 ℃，10 ℃/min 升溫至180 ℃，保持6 min，1 ℃/min 升溫至200 ℃，保持20 min，4 ℃/min 升溫至230 ℃，保持10.5 min。

1.3.3 單糖組成測(cè)定

1）粗多糖提取。取肌肉100 g 洗凈瀝干，研磨至勻漿，按料液比1∶2（g∶mL）加入正己烷和石油醚（沸程30～60 ℃）混合溶液（體積比1∶1），采用超聲輔助提取法，30 ℃提取90 min，抽濾得殘?jiān)厥眨貜?fù)2次。先后按料液比1∶2（g∶mL）加入生理鹽水和NaOH 溶液勻漿后，30 ℃超聲提取40 min，使粗多糖先后溶于生理鹽水和NaOH 溶液，紗布過濾得上清液1 和上清液2，重復(fù)2 次。合并上清液1 和上清液2，70 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，抽濾去雜，獲得濃縮液，加入4 倍體積的95%乙醇溶液于4 ℃靜置12 h 醇沉。醇沉后4 000 r/min 離心20 min，沉淀冷凍干燥后即為粗多糖。加入3%三氯乙酸溶液，攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié)pH 至3.0，4 ℃過夜，4 500 r/min 離心10 min（沉淀即為蛋白質(zhì)），將上清液即多糖溶液調(diào)節(jié)pH 至7.0，再重復(fù)此過程至無沉淀析出。70 ℃濃縮，多糖溶液透析24 h，凍干得精制多糖。

2）多糖水解。稱取30 mg 棕黑錦蛇多糖于具塞試管，加入6 mL 的2 mol/L 三氟乙酸在105 ℃反應(yīng)6 h，冷卻至室溫，70 ℃水浴濃縮至干。經(jīng)1 mL 甲醇溶液溶解后70 ℃真空濃縮至干，重復(fù)3 次，獲得多糖水解干燥品。

3）衍生物制備。稱取3 mg 多糖水解干燥品（對(duì)照品單糖）加入10 mg 鹽酸羥胺和0.5 mL 吡啶，于具塞試管中90 ℃水浴30 min，水浴期間間歇混勻。室溫冷卻后加0.5 mL 乙酸酐，90 ℃水浴30 min，室溫冷卻后0.22 μm 濾膜過濾，獲得棕黑錦蛇單糖衍生物。按照上述步驟但不加入單糖進(jìn)行反應(yīng)，所得溶液即為空白樣品；9 種對(duì)照品單糖經(jīng)衍生后各取100 μL 混合，即為混合對(duì)照品。

4）色譜條件。毛細(xì)管柱：（130 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氮?dú)猓至鞅?0∶1，進(jìn)樣體積1 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度250 ℃。初始溫度140 ℃，10 ℃/min 升溫至240 ℃，保持10 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 軟件對(duì)氣相色譜數(shù)據(jù)預(yù)處理，Origin 2018 軟件完成氣相色譜圖的繪制，預(yù)處理數(shù)據(jù)和色譜圖對(duì)比確定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品間的對(duì)應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品鑒定棕黑錦蛇所含有脂肪酸和單糖的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 棕黑錦蛇鱗片特征

2.1.1 背鱗顯微觀察結(jié)果 圖1 中，背部鱗片呈長(zhǎng)菱形，有脊紋，左右對(duì)稱，有橢圓形端窩2 個(gè)，端窩明顯，靠近游離端。鱗片表面黃棕色。游離端狹尖，質(zhì)地較厚，鱗片腹面有薄膜囊。鱗片表面有縱直的條紋，兩側(cè)有明顯的乳頭狀凸起，分布區(qū)域窄長(zhǎng)，基部邊緣有指紋樣橫紋。

圖1 棕黑錦蛇鱗片

2.1.2 頭部鱗片對(duì)比 圖2 中，棕黑錦蛇頭長(zhǎng)頸細(xì)，頭背黑色，頭腹黃色，背面與腹面交界處鱗片黑色和黃色交錯(cuò)，鱗片形狀規(guī)則，分界線清晰。鼻鱗、頰鱗、眶上鱗、眶前鱗、眶后鱗、顳鱗、上唇鱗均在蛇頭兩側(cè)對(duì)稱分布，總數(shù)目即為單側(cè)鱗片數(shù)的2 倍；下唇鱗圍繞蛇頭下唇連續(xù)分布，以吻鱗正下方的下唇鱗為中心，兩側(cè)對(duì)稱分布，數(shù)目為11+1+11。鱗片的長(zhǎng)寬以蛇頭背面縱向?yàn)殚L(zhǎng)，橫向?yàn)閷捵鳛榕袛鄻?biāo)準(zhǔn)（表1）。

表1 棕黑錦蛇頭部鱗片特征

圖2 棕黑錦蛇頭部鱗片

2.2 脂肪酸組成特征

將經(jīng)過超聲波輔助提取得到的棕黑錦蛇油脂經(jīng)甲酯化反應(yīng)后，采用氣相色譜法進(jìn)行脂肪酸組成分析。脂肪酸組成定性分析利用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照，定量分析采用峰面積歸一化法。棕黑錦蛇油脂脂肪酸氣相色譜圖如圖3 所示，脂肪酸種類及相對(duì)含量如表2 所示。

表2 棕黑錦蛇蛇油中脂肪酸的種類及含量

圖3 棕黑錦蛇脂肪酸樣品氣相色譜圖

圖3 中，棕黑錦蛇油脂中脂肪酸含量豐富，共檢出15 種脂肪酸，以不飽和脂肪酸為主，十七碳一烯酸（C17∶1）、山崳酸（C20∶0）未檢測(cè)出，存在一定量的十四碳以下脂肪酸。飽和脂肪酸（SFA）豆蔻酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、木焦油酸相對(duì)含量共有31.236%；不飽和脂肪酸（UFA）相對(duì)含量共有63.246%，其中單不飽和脂肪酸（MUFA）棕櫚油酸、油酸、花生一烯酸、芥酸、神經(jīng)酸相對(duì)含量占37.659%，多不飽和脂肪酸（PUFA）亞油酸、亞麻酸、花生二烯酸、二十二碳二烯酸相對(duì)含量占25.587%，UFA 與SFA 比值為2.02，UFA 占比較高。SFA 中棕櫚酸（22.600%）含量最高，其次是硬脂酸（5.280%）和豆蔻酸（2.800%），UFA 中油酸（34.200%）和亞油酸（22.200%）含量最高，其次是棕櫚油酸（2.960%）和亞麻酸（2.950%）。

2.3 肌肉單糖組成氣相色譜特征

圖4 中，各單糖的保留時(shí)間依次為葡萄糖醛酸1.26 min、半乳糖醛酸2.13 min、鼠李糖4.29 min、阿拉伯糖4.49 min、木糖4.68 min、甘露糖7.55 min、葡萄糖7.73 min、半乳糖8.06 min、果糖11.94 min，將樣品、空白對(duì)照、混合對(duì)照品的氣相色譜圖進(jìn)行對(duì)比，通過保留時(shí)間判斷棕黑錦蛇多糖樣品在葡萄糖醛酸和葡萄糖處有吸收峰。其中葡萄糖吸收峰面積占69.13%，葡萄糖醛酸占14.32%，保留時(shí)間1.13 min和1.40 min 處的吸收峰因缺少標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照無法判斷種類，峰面積各占8.51%和8.04%。依據(jù)空白譜圖鑒定保留時(shí)間3.24 min 和4.19 min 處吸收峰不是由單糖引起形成的。

圖4 棕黑錦蛇肌肉單糖氣相色譜圖

3 討論

3 種錦蛇背部鱗片均為黃棕色，基部邊緣有指紋樣橫紋，靠近游離端的橢圓形端窩和縱直條紋；黑眉錦蛇鱗片整體呈菱形或卵圓形，左右不對(duì)稱，無脊紋；王錦蛇鱗片整體呈長(zhǎng)橢圓形，游離端狹尖且質(zhì)地較薄，鱗片腹面無薄膜囊［1］。同一屬3 種錦蛇鱗片微觀特征之間的差異，說明可以通過背部鱗片對(duì)蛇類混淆品進(jìn)行鑒定。棕黑錦蛇的頰鱗、眶前鱗、眶后鱗數(shù)目與王錦蛇、百花錦蛇、紅點(diǎn)錦蛇、雙斑錦蛇相同［4-6］，吻鱗、鼻間鱗、額鱗、頂鱗的數(shù)目與黑眉錦蛇和王錦蛇相同［1］，說明頭部鱗片也可以作為蛇類混淆品鑒定的依據(jù)。

棕黑錦蛇所測(cè)定的脂肪酸中油酸、棕櫚酸、亞油酸和硬脂酸的相對(duì)含量較高，與烏梢蛇、緬甸蟒和中華眼鏡蛇相同［7-9］。與棕黑錦蛇脂肪酸相對(duì)含量由大到小依次是油酸（34.200%）、棕櫚酸（22.600%）、亞油酸（22.200%）、硬脂酸（5.280%）相比，烏梢蛇是油酸（41.360%）、棕櫚酸（23.720%）、亞油酸（7.200%）、硬脂酸（7.140%），緬甸蟒是油酸（50.700%）、棕櫚酸（22.100%）、亞油酸（9.800%）、硬脂酸（7.800%），中華眼鏡蛇是油酸（39.420%）、棕櫚酸（25.040%）、亞油酸（15.760%）、硬脂酸（11.190%）。雖然相對(duì)含量較高的脂肪酸種類相同，但是其中棕黑錦蛇油酸含量低于其他3 種蛇類，亞油酸含量高于其他3 種蛇類，而亞油酸是人體不能自身合成的必需脂肪酸，具有抗癌、抗糖尿病、降低血液和肝臟膽固醇與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的作用。

本研究利用三氟乙酸水解、鹽酸羥胺衍生并通過氣相色譜分析測(cè)得棕黑錦蛇肌肉多糖由葡萄糖和葡萄糖醛酸組成。有研究利用三氟乙酸水解，通過高效液相色譜法分析皺紋盤鮑（Haliotis discus hannaiIno）肌肉多糖中單糖主要由葡萄糖組成［10］；也有研究利用木瓜蛋白酶酶解，通過高效液相色譜測(cè)定皺紋盤鮑腹足的粗多糖主要由葡萄糖和半乳糖2 種單糖組成［11］。這些結(jié)果不同于本研究中提取的多糖，可能與物種及多糖提取方法有關(guān)。棕黑錦蛇肌肉中測(cè)得的葡萄糖醛酸，能與許多體內(nèi)外毒物及其代謝產(chǎn)物結(jié)合成無毒的葡萄糖醛酸結(jié)合物后排出體外，具有保肝護(hù)肝和排毒解毒的作用，還可用于關(guān)節(jié)炎和結(jié)締組織疾病以及風(fēng)濕性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的輔助治療。

4 結(jié)論

本研究分析棕黑錦蛇頭部和背部鱗片，測(cè)定油脂中脂肪酸和肌肉多糖中單糖的種類和相對(duì)含量，表明棕黑錦蛇頭部鱗片數(shù)目和形態(tài)與背部鱗片的顯微特征均能作為與其他蛇類混淆品鑒別的依據(jù)，蛇類鱗片間的特征差異對(duì)于蛇類鑒定有著一定的作用。脂肪酸以不飽和脂肪酸含量最大，其中亞油酸的相對(duì)含量較其他蛇類高，在藥用方面具備一定的價(jià)值。肌肉多糖中測(cè)得的葡萄糖醛酸，可用于排毒護(hù)肝、輔助治療關(guān)節(jié)炎，具有一定的研究?jī)r(jià)值。