微波輔助低共熔溶劑提取葡萄果渣中原花青素及其穩定性研究

付佳樂，耿 直，陳革豫

（陜西國際商貿學院醫藥學院，西安 712046）

葡萄作為傳統的藥食兼用植物，含有豐富的營養活性物質［1］，如原花青素、蛋白質、多種微量元素、維生素等［2］，其中原花青素含量最高，約占1/5。原花青素是一種多酚類化合物，廣泛分布于黑枸杞、葡萄、銀杏葉、玫瑰等草本植物中，是一種自然強抗氧化劑，能夠提高人體的防御機能，有效保護人體細胞，清除自由基，同時能夠改善皮膚，修復已經破損的細胞等功能［3-5］。葡萄果渣中富含花青素，但經常用作肥料或被丟棄，不但對環境造成污染，同時也浪費了資源［6］。

低共熔溶劑（DESs）在2003 年首次被提出，是一種離子溶液，由一定化學計量比例的氫鍵受體和氫鍵供體構成，具有溶解性強、制備簡單、成本低、不易揮發、可進行生物降解等優點，極大程度地避免了對環境的污染，是近年來運用最廣泛的綠色溶劑之一［7，8］。低共熔溶劑的物理性質可以通過配比加以調節，可以減小輔助配體和氫氧鍵供體含量的加入，通過對萃取溫度的調節，以更大程度地增加提取含量。但低共熔溶劑目前仍處于待開發階段，在原花青素的提取方面報道很少［9，10］。通過試驗研究，以期為低共熔溶劑的開發提供一定的參考和借鑒，也為原花青素的保存提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與材料

儀器與設備：UV1810 型紫外可見分光光度計，上海美普達儀器有限公司；PHS-25 型pH 計，上海偉業儀器廠；TGL-16B 型高速離心機，上海安亭科學儀器廠；KY-MCR-3 型微電腦微波化學反應器，上海秋佐科學儀器有限公司。

材料與試劑：原花青素標椎品（HC89537），上海惠誠生物科技有限公司；葡萄果渣，陜西省咸陽市博惠種植合作社；氯化膽堿（含量98%，V62201125），山東優索化工科技有限公司；乙醇、甲醇、丙三醇、草酸、檸檬酸、氯化鎂、維生素C、過氧化氫等均為分析純，水為純化水。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理 葡萄果渣烘干，粉碎，過40 目篩備用。

1.2.2 低共熔溶劑的制備 按照試驗中處方比例，將不同的氫鍵供體同氯化膽堿進行化學計量融合，置錐形瓶中，80 ℃水浴加熱40 min，靜置，冷卻至室溫。

1.2.3 供試品溶液的制備

1）緩沖液的制備。將1.49%的KCl 溶液與1.7%的HCl 溶液按照體積比25∶67 混合，調節pH 至1.0±0.1［11］。

2）原花青素粗提液的制備。取“1.2.1”項下葡萄果渣細粉0.5 g 于錐形瓶中，加入低共熔溶劑，振搖后微波提取，提取液于3 800 r/min 離心10 min，上清液加緩沖溶液定容至25 mL，待用。

1.2.4 標準品溶液的配制 精密稱定0.025 0 g 原花青素標準品至25 mL 容量瓶中，用適量甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，即得1 mg/mL 的標準品溶液。

1.2.5 標準曲線的繪制 取6 支10 mL 試管，分別加入“1.2.4”項下標準品溶液0、1、2、3、4、5 mL，精密加入4%香草醛-甲醇溶液3 mL、濃鹽酸1.5 mL，搖勻，30 ℃水浴反應30 min，500 nm 波長處測定吸光度［12］。以原花青素濃度C（mg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制原花青素標準曲線圖。

1.2.6 評價指標

原花青素提取率=提取液中原花青素濃度×提取液體積/葡萄果渣質量×（1-葡萄果渣水分含量）。

1.2.7 葡萄果渣中原花青素的提取

1）單因素試驗。①低共熔溶劑類型。按照固定低共熔溶劑摩爾比（氯化膽堿∶氫鍵供體）1∶2、液固比30∶1、微波功率500 W、提取溫度40 ℃、提取時間40 s 的參數進行提取試驗［11-14］。以原花青素提取率為指標，確定低共熔溶劑種類。②低共熔溶劑摩爾比。在液固比30∶1、微波功率500 W、提取溫度40 ℃、提取時間40 s 條件下，用氯化膽堿/丙三醇作提取劑，計算原花青素提取率，確定摩爾比。③微波功率。在液固比30∶1、提取溫度40 ℃、提取時間40 s條件下，以摩爾比1∶3 的氯化膽堿/丙三醇作提取劑進行提取。計算原花青素提取率，確定微波功率。④液固比。在微波功率420 W、提取溫度40 ℃、提取時間40 s 條件下，以摩爾比1∶3 的氯化膽堿/丙三醇作提取劑，考察不同的液固比對原花青素提取量的影響。計算原花青素提取率，確定液固比。⑤提取時間。原花青素提取率會隨提取時間的延長而增加，但提取時間過長會導致原花青素降解，因此通過預試驗結果確定微波提取時間為40 s。⑥提取溫度。溫度過高易導致原花青素發生降解，因此確定提取溫度為40 ℃。

2）正交試驗設計。在單因素試驗結果基礎上，設計正交試驗，得到最佳工藝。

1.2.8 原花青素穩定性研究 以“1.2.7”項下試驗最佳工藝葡萄果渣提取液為原料，以原花青素保留率為評價指標，分別連續間隔1 h 進行測定，考察在pH為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，溫度為4、20、40、60、80 ℃，室內日光燈照下與室內避光，氧化劑（H2O2）濃度為0、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%，還原劑（維生素C）濃度為0、0.04、0.08、0.16、0.32 g/L，K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+等金屬離子對原花青素保留率的影響［15，16］。

式中，A1為檢測溶液原花青素吸光度；A2為初始樣品溶液原花青素吸光度。

2 結果與分析

2.1 線性關系結果

由圖1可知，標準曲線方程為A=1.049C+0.013 1，相關系數R2=0.999，原花青素濃度在0.10～0.50 mg/mL范圍內呈線性關系。

圖1 原花青素濃度-吸光度標準曲線

2.2 葡萄果渣中原花青素的提取工藝單因素試驗結果

2.2.1 低共熔溶劑類型對原花青素提取率的影響由表1 可知，以氯化膽堿/丙三醇為溶劑組提取率最高，為18.86%，其次是氯化膽堿/丙二醇，為18.42%，氯化膽堿/草酸組為17.75%。即多元醇對原花青素的提取率較高，且隨著醇羥基的增加提取率提高，有機酸組的提取率稍低，可能是由于醇羥基和有機酸對原花青素的氫鍵作用更強；糖供體的提取率最低，可能與糖的極性偏大有關。但可以看出多元醇和有機酸供體試驗得到的提取率相差不大，因此，選擇氯化膽堿/丙三醇、氯化膽堿/丙二醇、氯化膽堿/草酸作為提取溶劑，采用正交試驗設計進一步研究。

表1 低共熔溶劑類型對原花青素提取率的影響結果

2.2.2 低共熔溶劑摩爾比對原花青素提取率的影響 由圖2 可知，當摩爾比（氯化膽堿∶氫鍵供體）為1∶3 時，原花青素提取率最大，為19.19%；當摩爾比為1∶2 時，為18.73%；當摩爾比為1∶4 時，為18.67%。因此選擇摩爾比為1∶2、1∶3、1∶4 作為摩爾比的考察因素水平。

圖2 摩爾比對原花青素提取率的影響

2.2.3 微波功率對原花青素提取率的影響 由圖3可知，當微波功率為420 W 時，提取率為19.26%；當微波功率為560 W 時，提取率為18.75%；當微波功率為280 W 時，提取率為18.58%。因此選擇280、420、560 W 作為微波功率的考察水平。

圖3 微波功率對原花青素提取率的影響

2.2.4 液固比對原花青素提取率的影響 由圖4 可知，當液固比為40∶1 時，原花青素的提取率最大，為17.96%。因此選擇30∶1、40∶1、50∶1 作為液固比的考察水平。

圖4 液固比對原花青素提取率的影響

2.3 正交試驗安排及結果

采用L9（34）正交試驗，以原花青素的提取率為評價指標進行試驗研究，正交試驗因素水平與結果分析見表2、表3，方差分析見表4。

表2 葡萄果渣提取工藝因素與水平

表3 正交試驗安排及結果

表4 正交試驗結果方差分析

通過正交試驗結果可以得出，葡萄果渣中原花青素的最佳提取工藝為A3B2C2D2，即在微波功率420 W、提取溫度40 ℃、提取時間40 s、液固比40∶1的條件下，以摩爾比1∶2 的氯化膽堿/丙三醇作提取劑進行提取。通過直觀分析可以看出因素的影響大小為C＞B＞A＞D，即微波功率影響最大，液固比影響最小。

2.4 驗證試驗

對最佳提取工藝進行驗證試驗，由表5 可知，該工藝穩定可行，平均提取率達19.57%。

表5 驗證試驗結果

2.5 原花青素的穩定性研究

2.5.1 pH 對原花青素保留率的影響 pH 對原花青素保留率的影響見表6。通過試驗結果可以看出，當pH≤2 時，5 h 后原花青素的保留率仍在85%以上，當pH≥3 時，5 h 后原花青素的保留率均低于70%，隨著pH 的增大，原花青素穩定性逐漸降低。

表6 pH 對原花青素保留率的影響

2.5.2 溫度對原花青素保留率的影響 由圖5 可知，2 h后60 ℃以及80 ℃的保留率均低于80%，而5 h后只有4 ℃條件下保留率在80%以上，室溫20 ℃條件下接近80%，由此可見，溫度升高，原花青素快速降解，造成原花青素的損失。因此原花青素需在20 ℃以下保存，最佳溫度為4 ℃左右。

圖5 溫度對原花青素保留率的影響

2.5.3 光照對原花青素保留率的影響 由圖6 可知，隨著光照時間的延長，日光燈下原花青素的保留率急劇下降，5 h 后保留率僅有60%，而避光下保留率仍在80%以上。由此可見，較強的光照會使原花青素發生降解。

圖6 光照對原花青素保留率的影響

2.5.4 氧化劑（H2O2）對原花青素保留率的影響 由圖7 可知，反應2 h 后，H2O2溶液組保留率均發生比較明顯下降，為90%以下，5 h 后下降到60%以下；H2O2溶液濃度越高，保留率下降趨勢越明顯?？赡茉蚴荋2O2使原花青素開環生成查爾酮，進一步發生化學反應生成酯類物質。

圖7 H2O2對原花青素保留率的影響

2.5.5 還原劑（維生素C）對原花青素保留率的影響 由圖8 可知，當維生素C 濃度低于0.32 g/L 時，原花青素3 h 的保留率仍為80%以上，5 h 時也沒有大幅度的下降，當濃度達0.32 g/L 時，3 h 后原花青素的保留率急劇下降，由此可見，隨著時間的延長和維生素C 濃度的升高，原花青素的保留率會逐漸降低，但維生素C 濃度低于0.32 g/L 時，原花青素的保留率相對穩定，說明維生素C 也在一定程度上保護原花青素。

圖8 維生素C 對原花青素保留率的影響

2.5.6 金屬離子對原花青素保留率的影響 由圖9可知，加入金屬離子后，隨著時間的延長，原花青素的保留率逐漸降低，其中Zn2+存在條件下，原花青素保留率下降較緩慢，5 h 后保留率仍然在80%左右，在K+、Na+、Ca2+、Mg2+存在條件下，原花青素保留率下降較明顯，4 h 后，保留率均在80%以下，說明這些金屬離子對原花青素的穩定性有一定的破壞作用。

圖9 金屬離子對原花青素保留率的影響

3 討論

1）本試驗選擇低共熔溶劑，與傳統的提取技術相比，可以使得原花青素的提取率提升近20%。一方面，低共熔溶劑簡單易得，造價低廉，穩定性高，綠色環保，在今后的生活生產中還有極大的開發潛能；另一方面，試驗所提取的原花青素不僅能夠運用于食品的添加，在藥用價值上也有著不可估量的前景。

2）穩定性試驗中，發現當pH 為4 時會發生比較劇烈的變化，原花青素的保留率2 h 時已經降到70%以下，其機制仍需進一步研究。在對金屬離子的研究過程中，Zn2+對其保留率的影響比較緩和，這可能與Zn2+分子量稍大，帶有金屬活性等有關，金屬離子對原花青素的影響有待更全面和深入研究。

3）目前原花青素利用的發展前景非常廣闊，如通過制備甲基殼聚糖微納米粒子等多種創新技術，大大提高了植物原花青素的穩定性。但是這些研究方法由于高技術成本、低質量安全性等原因尚未完全得到廣泛推廣應用，相關的化學作用機理也不清楚，原花青素的營養質量和生物穩定性也有待進一步研究。