1-苯基2-硫脲通過p53調控自噬活性來保護斑馬魚神經丘毛細胞?

秦彥筠, 范純新??, 王 建

(1. 上海海洋大學 國家海洋生物科學國際聯合研究中心, 上海201306;2. 上海海洋大學 水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室, 上海201306)

毛細胞是一類感受機械刺激的感覺細胞,存在于所有脊椎動物的內耳中,以及魚類和兩棲類的側線感受器中。內耳毛細胞可以探測環境中的聲音信息,毛細胞的異常會導致人類的感音性耳聾[1]。側線毛細胞用于探測水流運動,在魚類捕食、避敵、群游和趨流等行為中發揮重要作用[2]。毛細胞的結構精細,對抗生素、重金屬離子和噪音等刺激因素異常敏感[3]。因此,毛細胞的再生和存活研究對于人類健康和生物資源保護具有重要意義。

自噬是真核細胞消化溶酶體中大分子和受損細胞器的一個基本分解代謝過程。在正常條件下,細胞自噬通過蛋白質降解和細胞器周轉來平衡細胞的蛋白質合成和細胞器的生物活性,為正常細胞提供生長途徑[4]。而在應激條件下,如饑餓、缺氧或細胞損傷等,自噬也可以作為一種促生存的途徑來響應這些刺激[5]。已有研究表明,在各種類型的聽力損失中,自噬對毛細胞存活具有保護作用[6-7]。Pang等[8]在順鉑的耳毒性實驗中發現,自噬可抑制斑馬魚側線和小鼠耳蝸免受順鉑誘導的毛細胞丟失。細胞自噬與腫瘤抑制蛋白p53基因(Tumor protein p53 gene,tp53)間存在重要的互作,tp53可以通過激活自噬基因,促進細胞自噬的發生[9]。但細胞自噬是否通過p53保護毛細胞尚不清楚。

苯基硫脲(PTU)是酪氨酸酶的抑制劑,常被用于阻斷斑馬魚胚胎的色素形成。近期的研究表明:PTU可以激活斑馬魚胚胎細胞中的細胞自噬,PTU處理導致自噬體和自噬溶酶體形成,溶酶體富集[10]。側線神經丘中的毛細胞與內耳毛細胞同源,且位于體表,易于觀察,已成為感音性耳聾理想的研究模型[11]。本研究中,將利用斑馬魚仔魚分析PTU是否通過促進細胞自噬來保護側線神經丘毛細胞,這個過程是否通過p53發揮作用,從而為進一步理解毛細胞的存活和保護奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本課題所用的野生型AB品系購自國家斑馬魚研究中心,標記毛細胞的Tg(Brn3c:GFP)系為中國海洋大學趙呈天教授課題組惠贈。成體斑馬魚養殖在斑馬魚養殖單元中(海圣),每天早晚喂食新鮮孵化的豐年蟲。室溫控制在26～28 ℃,循環水體PH為7.0～8.0,固定光周期為14 h光照、10 h黑暗。斑馬魚胚胎飼養在藍水(0.3 g/L紅海鹽以及0.4 mg/L亞甲基藍)中,置于28.5 ℃恒溫培養箱中培養。受精后5 d,仔魚出殼后轉移至光照培養箱喂養開口餌料草履蟲,受精后10 d混喂草履蟲和新鮮孵化的鹵蟲,受精后15 d可轉移至水系統飼養,用于后續實驗。有關斑馬魚的所有實驗操作均符合上海海洋大學動物倫理委員會相關規定。

1.2 PTU處理和溶酶體染色

將苯基硫脲(PTU,購買自sigma)用二甲基亞砜(DMSO)溶解后,用新鮮配制的1× Holt’s Buffer (1.75 g/L NaCl、0.05 g/L CaCl2、0.025 g/L KCl和0.5% HEPES) 配制成不同濃度的溶液。將受精后24 h的斑馬魚胚胎浸泡在裝有PTU溶液的12孔板中,每個孔盛放15條斑馬魚,對照組用等量的DMSO溶液處理。將其放置在28.5 ℃恒溫培養箱培養,每天更換新鮮的藥物。

將Lyso Tracker Red DND-99 (Yeasen) 按1∶1 000稀釋,從而得到終濃度為10 μmol/L的工作液,然后將斑馬魚仔魚浸泡在該工作液中于28.5 ℃避光染色1 h。染色完成后,用1× Holt’s Buffer清洗仔魚3次,用麻醉劑MS-222 (0.1 mg/mL) 處理后,將其包埋在1.5%低熔點瓊脂糖中,保持側面貼在薄底小皿底部,并用熒光倒置顯微鏡成像觀察。

1.3 斑馬魚后側線毛細胞標記

用新鮮配制的1× Holt’s Buffer將YO-PRO-1 (Thermo Fisher) 配制成2 μmol/L的染色工作液,然后將受精后3和5 d的斑馬魚仔魚均用該工作液浸泡染色(28.5 ℃避光),1 h后用1× Holt’s Buffer清洗魚體3次,每次5 min。用MS-222麻醉斑馬魚仔魚5 min后,在熒光倒置顯微鏡488 nm通道下對活體斑馬魚側線神經丘毛細胞進行觀察計數。每個實驗的實驗組和對照組樣本量都大于12。

1.4 熒光定量PCR

熒光定量PCR采用諾唯贊公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒。以斑馬魚cDNA為模板,以真核翻譯延伸因子1α1基因 (eef1α1|1) 為內參基因(見表1),每個樣品檢測設置3個平行,利用Applied Biosystem ABI 7500定量PCR儀(ABI 7500)進行熒光定量PCR,根據2-ΔΔCt計算目標基因在不同樣品中的相對表達量,并用t-檢驗對相對表達量進行差異顯著性分析。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.5 整胚原位雜交

收集受精后5 d的斑馬魚胚胎,用4%多聚甲醛(4% PFA)固定后,放置于4 ℃過夜。固定后的樣品用甲醇室溫脫水5 min,再換取新鮮的甲醇放置-20 ℃保存。全程都需要盡量保持RNase-Free的環境。完全脫水后的樣品經PBST (2.5 mL 20×PBS+0.1% Tween-20) 梯度復水后,用10%過氧化氫溶液使胚胎脫色成米黃色,然后用10 μg/mL的蛋白酶K在37 ℃消化通透5 min,換上4% PFA重新室溫固定30 min。加入含反義探針的雜交液,于70 ℃孵育過夜。孵育之后依次經過漂洗、封閉、抗體孵育和漂洗,然后在室溫下用堿性磷酸酶溶液(NBT/BCIP stock solution)避光顯色。顯色完成后,用4% PFA終止顯色反應,經過PBST溶液漂洗后加入100%甘油長期保存,用體式鏡進行觀察并拍照。

1.6 sgRNA的設計和合成

利用CRISPRscan設計靶向于tp53第五外顯子的 sgRNA。合成含有sgRNA靶序列的特異性Oligo:5’端包含T7啟動子序列,3’端包含下游通用引物的互補序列(見表1)。將該特異性Oligo與下游通用Oligo共同進行PCR,然后把所得PCR產物通過利用T7 High Yield RNA Synthesis Kit (Vazyme) 進行體外轉錄合成sgRNA。經過 DNaseⅠ消化后,產物用RNA Clean &Concentrator Kit純化,純化后的產物放置于-80 ℃保存。

1.7 Cas9 mRNA合成

用XbaⅠ限制性核酸內切酶(Thermo Fisher)將質粒pT3TS-nlsCas9nls線性化處理,所得線性化產物用普通DNA產物純化試劑盒(Vazyme)進行純化。用mMessage mMachine T3 Transcription Kit試劑盒體外轉錄獲得Cas9 mRNA,最后用RNA Clean &Concentrator Kit純化終產物,并保存于-80 ℃。

1.8 顯微注射和基因分型

收集1～2細胞期的斑馬魚胚胎,利用顯微注射儀將混合液通過顯微注射針注射到細胞質中。每顆卵注射約300 pg Cas9 mRNA和50 pg sgRNA。注射后的胚胎轉移到藍水中28.5 ℃恒溫培養。將受精后培養約24 h的胚胎用堿裂解法提取DNA。PCR擴增后(見表1)將所得產物送生工生物工程公司進行毛細管電泳檢測,判斷是否敲除成功。將成功注射后的胚胎繼續培養至性成熟,與野生型AB交配獲得子代F1,將F1飼養至一個月以上,剪取它們的尾部組織,然后由堿裂解法進行基因分型,挑選出雜合突變F1并將它們內交,對獲得的子二代F2繼續用堿裂解法進行基因分型以獲得純合突變體。

另外,本研究中還根據野生型基因座和突變型基因座設計基因座特異性的基因分型引物(見表1),對模板DNA進行PCR,確定其DNA的基因型。

2 結果

2.1 PTU促進神經丘毛細胞自噬

本研究中,利用能標記溶酶體的Lyso Tracker探針去觀察細胞內溶酶體和自噬溶酶體的含量情況,以此來反映細胞內的自噬情況。結果顯示:DMSO處理組神經丘在15 min后仍有較清晰的信號輪廓;PTU處理組神經丘中的Lyso Tracker信號雖然早期更強,但信號彌散得更快,15 min后就變得彌散(見圖1A)。為了確定神經丘內發生自噬的細胞類型,對受精后3 d斑馬魚同時進行YO-PRO-1和Lyso Tracker染色,發現溶酶體染色陽性的細胞和YO-PRO-1陽性的毛細胞共定位(見圖1B),這表明:PTU在神經丘中誘導的自噬主要發生在毛細胞中。

(A: 經200 μmol/L PTU處理受精后3 d野生型斑馬魚的溶酶體染色情況。標尺:50 μm。B: 受精后3 d斑馬魚毛細胞和溶酶體染色陽性細胞的共定位。標尺:10 μm。A: Lysosome staining in 3 days post fertilization wildtype zebrafish treated with 200 μmol/L PTU. Scale bar: 50 μm. B: Co-localization of 3 days post fertilization zebrafish hair cells and lysosome-positive cells. Scale bar: 10 μm.)圖1 PTU促進神經丘毛細胞自噬Fig.1 PTU induces neuromast hair cell autophagy

2.2 PTU處理保護神經丘毛細胞

本研究中,利用熒光成像技術,在Tg(Brn3c:GFP)背景下觀察PTU對毛細胞數量的影響。發現在200 μmol/L PTU處理下,實驗組毛細胞數量多于對照組(見圖2A—C)。本文作者還用YO-PRO-1對毛細胞進行活體染色,檢測不同濃度的PTU對斑馬魚神經丘毛細胞的影響。染色結果表明無論是受精后3 d(見圖2B)還是受精后5 d(見圖2C),在200 μmol/L的PTU處理下,毛細胞數量都顯著多于對照組,而當PTU濃度再升高時,毛細胞則沒有顯著增多,甚至在800 μmol/L的時候顯著減少。因此,2種毛細胞標記方法都顯示200 μmol/L的PTU促進毛細胞的存活。

(A: 200 μmol/L PTU處理后,Tp(Brn3c:GFP)轉基因斑馬魚毛細胞成像圖。標尺:25 μm。B: 不同濃度PTU處理受精后3 d野生型斑馬魚的毛細胞定量分析,縱坐標為毛細胞數量。:p<0.001。C: 不同濃度PTU處理受精后5 d野生型斑馬魚的毛細胞定量分析,縱坐標為毛細胞數量。:p<0.05,:p<0.01。A: Imaging of Tg(Brn3.1:GFP) transgenic zebrafish hair cells after 200 μmol/L PTU treatment. Scale bar: 25 μm. B: Quantitative analysis of hair cells in 3 days post fertilization wildtype zebrafish treated with different concentrations of PTU. The Y-axis is the number of hair cells. : p<0.001. C: Quantitative analysis of hair cells in 5 days post fertilization wildtype zebrafish treated with different concentrations of PTU. The ordinate is the number of hair cells. : p<0.05, : p<0.01.)圖2 PTU處理保護神經丘毛細胞Fig.2 PTU treatment protects neuromast hair cells

2.3 敲除斑馬魚tp53基因

據報道,p53在細胞自噬過程中發揮重要作用[12]。為了確定tp53基因是否參與PTU誘導的神經丘毛細胞自噬,本文作者對PTU浸泡過的斑馬魚仔魚用qPCR檢測其tp53表達情況。結果顯示:PTU處理組tp53表達量顯著高于對照組(見圖3A),這表明PTU處理可誘導tp53表達。另外,整胚原位雜交結果表明,tp53基因在斑馬魚側線神經丘發育過程中呈現動態表達。在受精后3 d時表達量較高,而在受精后5 d時表達量顯著降低(見圖 3B)。接下來,利用 CRISPR/Cas9 技術敲除斑馬魚tp53基因。突變的tp53基因座gRNA靶點位置缺少了8個核苷酸CCCTCCAC,推測突變的tp53基因序列提前終止表達,因此其表達產物僅保留了N端的反轉錄激活域和一段殘缺的DNA結合域(見圖3C)。同時,qPCR結果顯示:在受精后5 d斑馬魚中,tp53純合突變體內該基因的表達量顯著低于野生型。這表明:tp53敲除導致無義介導的mRNA降解(見圖3D)。由此可見,在本研究中,本文作者成功地建立了tp53功能缺失的突變體斑馬魚。

(A: 經200 μmol/L PTU處理受精后3 d野生型斑馬魚tp53的表達情況。縱坐標為相對表達水平。:p<0.05。B: tp53基因在斑馬魚后側線神經丘中表達情況,通過整胚原位雜交檢測受精后3 d和5 d時期的野生型斑馬魚中tp53基因的表達情況。標尺:200 μm。C: sgRNA在tp53基因上的靶點(見圖C1),缺失的堿基對(見圖C2)以及預測的突變體p53蛋白結構(見圖C3)示意圖。D: qPCR結果顯示tp53基因在野生型個體和tp53-/-突變體中的相對表達量。縱坐標為相對表達水平。WT:野生型;:p<0.000 1。A: Relative expression of tp53 in 3 days post fertilization wildtype zebrafish treated with 200 μmol/L PTU. The Ordinate is the relative expression level. : p<0.05. B: The expression of tp53 gene in the zebrafish posterior lateral line neuromast. The expression of tp53 gene in wildtype zebrafish at 3 and 5 days post fertilization stages was detected by whole embryo in situ hybridization. Scale bar: 200 μm. C: The schematic diagram of the sgRNA target on the tp53 gene (see figure C1), the missing base pairs (middle see figure C2), and the predicted mutant p53 protein structure (see figure C3). D: qPCR result shows the relative expression of tp53 gene in wildtype and tp53-/- mutant zebrafish. The ordinate is the relative expression level.WT:Wildtype; : p<0.000 1.)圖3 敲除斑馬魚tp53基因Fig.3 Knocking out tp53 in zebrafish

2.4 tp53突變不影響神經丘毛細胞的數量

研究表明:p53參與細胞凋亡調控,p53可以促進細胞凋亡[13]。為了分析tp53突變是否直接影響神經丘毛細胞的數量,本文作者用YO-PRO-1對tp53突變體斑馬魚的神經丘毛細胞進行活體染色,檢測tp53突變是否影響神經丘毛細胞的數量。統計結果顯示,無論是受精后3 d還是受精后5 d,tp53純合突變體的毛細胞數量相較于野生型和tp53雜合突變體都沒有顯著性差異(見圖4)。這說明tp53的突變可能不直接影響神經丘毛細胞的存活。

(A: 受精后3 d tp53雜合子內交子代毛細胞的定量分析。縱坐標為神經丘毛細胞數量。B: 受精后5 d tp53雜合子內交子代毛細胞的定量分析。縱坐標為神經丘毛細胞數量,橫軸中WT、Het和Hom分別代表野生型,雜合型和純合型。A: Quantitative analysis of tp53 heterozygous inbred progeny hair cells at 3 days post fertilization. The ordinate is the number of hair cells in neuromast. B: Quantitative analysis of tp53 heterozygous inbred progeny hair cells at 5 days post fertilization. The ordinate is the number of hair cells in neuromast. WT, Het and Hom in abscissa represents wildtype, heterozygous and homozygous, respectively.)圖4 tp53突變不影響神經丘毛細胞的數量Fig.4 tp53 mutation does not affect the number of neuromast hair cells

2.5 tp53突變減弱PTU對神經丘毛細胞的保護

為了確定tp53突變是否影響斑馬魚神經丘的細胞自噬,本文作者用200 μmol/L PTU處理野生型AB系斑馬魚個體和tp53-/-突變體后觀察其神經丘的Lyso Tracker信號,通過熒光顯微鏡實時成像發現,PTU處理的tp53-/-突變體毛細胞Lyso Tracker信號和野生型染色標記消退的速度接近,在15 min左右依舊能看清細胞的輪廓(見圖5A)。表明tp53缺失后,PTU誘導的毛細胞自噬活性減弱。

為了闡明PTU誘導的神經丘毛細胞增多是否通過tp53發揮作用,本文作者在tp53-/-突變體中檢測PTU處理對神經丘毛細胞數量的影響。經過毛細胞計數后發現,在受精后3和5 d,不同濃度的PTU處理下,除了在高濃度下毛細胞數量略微下調外,其他組毛細胞數量與對照組并沒有顯著差異(見圖5B、C)。這表明PTU誘導毛細胞的增多可能是通過p53來實現的。

3 討論

本研究中,發現PTU處理導致斑馬魚毛細胞溶酶體染色消退的速度較對照組明顯加快,同時毛細胞數量較對照組多。而tp53突變抑制了PTU對溶酶體的活化和毛細胞的保護。溶酶體是自噬泡的降解部位,溶酶體的降解速度反映了自噬的活性[14]。另外,p53可通過轉錄激活促進自噬發生[9]。文獻[8]的研究表明:細胞自噬可以保護毛細胞的存活。因此,本研究結果暗示PTU很可能通過p53誘導毛細胞內自噬溶酶體降解速度加快,從而促進毛細胞的存活。

毛細胞的保護對于人類健康和動物適應環境具有重要意義。凋亡抑制因子、抗氧化小分子和熱激蛋白等在毛細胞保護中都起到重要作用[15-16]。細胞自噬是通過降解異常蛋白和衰老細胞器進而維持細胞存活的重要途徑。He等[6]研究發現:新霉素或慶大霉素處理導致小鼠耳蝸毛細胞的自噬活性增加,若用自噬激活劑增加其自噬活性,則細胞的活性氧水平,凋亡和細胞死亡水平顯著降低,揭示自噬通過抑制氧化應激來保護新霉素誘導的氧化損傷。Pang等[7]研究發現:在老化的耳蝸中miR-34a表達量明顯升高,伴隨吞噬體積累,自噬溶酶體融合受損,從而抑制細胞自噬,進而導致細胞死亡。與上述發現一致,本研究的側線神經丘毛細胞中有明顯的溶酶體信號,在用PTU加速了溶酶體信號的消退情況下,存活的毛細胞增多,這表明細胞自噬對毛細胞的保護在神經丘和內耳毛細胞中是保守的,未來可通過激活細胞自噬以開發保護毛細胞的藥物或方法。另外,本文作者發現的保護神經丘毛細胞的PTU這類小分子化合物可以作為保護內耳毛細胞的候選,進一步在小鼠內耳等模型中確定其功能。

PTU是實驗室用于抑制斑馬魚胚胎色素形成的常用手段。但是,本文作者和以往研究者的工作都顯示出PTU可促進斑馬魚胚胎腦、上皮細胞和毛細胞等多種組織的自噬[10]。細胞自噬與多種生理和病理過程有關,如癌癥、神經退行性疾病和細胞分化等。本文作者發現,PTU對神經丘毛細胞的存活有促進作用,這提示在利用斑馬魚側線神經丘作為模式以研究毛細胞損傷、保護和再生時,需要盡可能避免使用PTU抑制胚胎色素形成,因為PTU的處理可能會對結果造成干擾。