鵝頸藤壺多糖提取、理化性質及N-糖鏈表達譜分析研究?

王 茹, 姜媛媛, 林 川, 潘 琳, 管守德, 于廣利, 2, 呂友晶,4??, 李國云, 2??

(1. 中國海洋大學 海洋藥物教育部重點實驗室, 山東省糖科學與糖工程重點實驗室, 醫藥學院,山東 青島 266003;2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室, 海洋藥物與生物制品功能實驗室, 山東 青島 266237;3. 中國海洋大學 物理海洋教育部重點實驗室, 海洋高等研究院, 山東 青島 266100;4. 青島海洋生物醫藥研究院, 海洋藥物與生物制品功能實驗室, 山東 青島 266061)

藤壺Amphibalanus(Balanus) 是分布廣泛的海洋污損生物[1],其幼體可以隨海洋流移動,成體可以附著在船只和大型海洋生物體上,因此對海防、海運交通、工業和漁業等均有危害[2]。藤壺亞目是目前為止海洋生物群落中種類最為豐富和最重要的類群之一。常見的藤壺外型有兩種[3]:一是鵝頸型藤壺,俗稱“海雞腳”或“狗爪螺”隸屬圍胸目茗荷科[4],背甲呈兩片對稱扁平外殼,由金星幼體經變態發育后成為成體;另一種是圓椎型藤壺,它的外殼由復雜石灰質組成,外型類似縮小的火山。

藤壺的生活史分為兩個階段:營浮游生活幼蟲階段和成體固著生活階段[5],其黏附過程又可細分為四個階段[6]。(1)藤壺膠分泌[7]:藤壺幼蟲發育到腺介幼蟲時期后,會游到材料表面利用觸角進行探索,判斷此處基底是否適合生長[8],找到合適的表面時,幼蟲體內的水泥腺體等結構組織中就會產生相應的生理反應,開始分泌藤壺膠進行黏附。藤壺膠是藤壺分泌的一種多蛋白復合物,它使藤壺牢固附著在各種基質表面[9],藤壺膠的主要成分是蛋白質,約占藤壺膠總量的90%,其余為碳水化合物、脂質和無機灰分等[10];(2)永久黏附:基底材料的質地、粗糙度、表面能、顏色等都與幼蟲附著密切相關,當附著基質適宜生長時,腺介幼蟲分泌膠質[11]黏附在基底上,之后將開始其不可逆的永久性附著過程;(3)變態反應:藤壺幼體黏附在基底表面后將開啟為期一周左右的變態反應過程[12];(4)成長階段:牢固黏附的藤壺在不斷蛻皮過程中逐漸成長[13]。 在鵝頸藤壺黏附過程中,其幼體中合成了一種沉降誘導糖蛋白復合物(Settlement Inducing Protein Complex, SIPC),誘導其沉降。SIPC是一種高分子量多糖也是一種接觸信息素,已被確定為鵝頸藤壺定居的主要媒介,由分子量為76、88和98 kDa的三個主要亞基組成[14],均具有扁豆凝集素結合糖鏈[15],SIPC亞基中的糖鏈單元對鵝頸藤壺的幼體附著有重要作用[16],可以高效誘導同物種的幼體附著[17]。SIPC涉及成體-幼體和幼體-幼體的相互作用,在鵝頸藤壺的整個生命周期中均有表達[18]。

糖鏈是三大高分子化合物之一[19],在自然界中廣泛存在,N-糖鏈最初是在卵清蛋白的生化分析中發現的,其通過乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)與天冬酰胺(Asn)殘基的氨基側鏈共價相連,N-糖基化是蛋白質翻譯后重要的修飾形式[20],細胞內至少超過50%的蛋白質都是有糖鏈修飾的,多糖的糖鏈部分承載著重要的生物學信息[21],在粘附識別、分化發育、信號轉導免疫應答以及蛋白受體調節中發揮著重要作用[22]。SIPC 亞基中的糖鏈單元對鵝頸藤壺的幼體附著有重要作用,為了進一步研究N-糖鏈在鵝頸藤壺幼體沉降中的作用以及糖鏈單元在鵝頸藤壺附著黏附過程中的作用,本研究分別提取鵝頸藤壺肌肉質柄和背甲中的多糖,對其分子量分布、單糖組成、總糖含量及蛋白質含量等基本理化性質進行分析;采用液質聯用分析方法對鵝頸藤壺成體與幼體肌肉質柄中的N-糖鏈進行分析比較,以期從糖鏈的角度,為探尋鵝頸藤壺附著機理提供糖組分依據。

圖1 鵝頸藤壺N-糖鏈表達譜示意圖Fig.1 The N-glycans expression profiling of Gooseneck barnacle

1 材料與儀器

1.1 試劑與材料

鵝頸藤壺,采自中國南海海域得國家自然科學基金委員會共享航次計劃項目(項目批準號:42049905)的資助,該航次(航次編號NORC2021-05)由“東方紅”三號科考船實施;PNGase F 酶購自New England BioLabs(USA);氰基硼氫化鈉,碳酸氫銨購自Sigma-Aldrich(USA);甲醇,乙腈(色譜純)購自德國Merck公司;醋酸鈉,硼酸購自國藥集團化學試劑有限公司;木瓜蛋白酶(Papain),購自美國Amresco 公司;L-半胱氨酸(L-cysteine)、甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、氨基半乳糖(GalN)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)、巖藻糖(Fuc)、1-苯基-3-甲基5-吡唑啉酮(PMP)、Pronase酶、鄰氨基苯甲酸(2-AA)購自Sigma-Aldrich(USA)。

1.2 實驗儀器

Bioprep-24生物樣品均質儀,杭州奧盛儀器有限公司產品;5430R離心機,德國Eppendorf公司產品;RVC 2-18真空離心濃縮儀,德國Christ公司產品;ME204E電子分析天平,瑞士Mettler Toledo公司產品;R-3 HB水浴鍋,瑞士Buchi公司產品;FD-1C-50冷凍干燥儀,北京博醫康實驗儀器有限公司產品;TM-1F渦旋振蕩器,德國Wiggens公司產品;Hypercarb色譜柱(150 mm×2.1 mm, 3 μm),美國Thermo Scientific公司產品;Agilent 1290超高效液相色譜儀,美國Agilent Technology公司產品;LTQ Orbitrap XL質譜儀,美國Thermo Scientific公司產品;高效液相色譜儀,天津博納艾杰爾。

2 實驗方法

2.1 鵝頸藤壺多糖的提取

鵝頸藤壺背甲和肌肉質柄在烘箱內干燥,研磨并粉碎。取外殼粉末20 g于10 mL氯仿/甲醇 (4∶1,v/v) 溶液中浸泡脫脂24 h,離心棄去上清液,沉淀晾干后,加500 mL 1% NaOH溶液于30 ℃水浴加熱12 h,用1% HCl中和。中和后離心保留上清液,加4倍體積95%乙醇,4 ℃冰箱靜置過夜沉淀多糖。離心去掉上清液得沉淀,于60 ℃下干燥0.5 h。將干燥沉淀復溶,于截留分子量為7 000 Da的透析袋中透析除鹽,最后,透析液減壓濃縮、冷凍干燥得到鵝頸藤壺背甲多糖。取肌肉質柄處粉末10 g加至250 mL 0.1 mol·L-1乙酸鈉緩沖液(pH=6.0)、1 g木瓜蛋白酶、5 mmol·L-1EDTA二鈉和5 mmol·L-1半胱氨酸的混合液中,于60 ℃水浴攪拌反應24 h。反應混合物離心(5 000 r·min-1,30 min)除去沉淀,向上清液中加入4倍體積95%乙醇,4 ℃冰箱靜置過夜沉淀多糖,離心得沉淀,于60 ℃下干燥0.5 h。將干燥沉淀加水復溶,于截留分子量為7 000 Da的透析袋中透析除鹽,最后,透析液減壓濃縮、冷凍干燥得到藤壺肌肉質柄處多糖粗品。

2.2 鵝頸藤壺多糖理化性質分析

2.2.1 單糖組成 單糖組成采用PMP柱前衍生高效液相色譜法測定。樣品濃度為5 mg/mL;色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18 (150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH=6.7)-乙睛(體積比=83∶17);流速1 mL/min;柱溫30 ℃;進樣體積10 μL;檢測器:紫外檢測器;檢測波長:245 nm;信號采集:45 min;樣品處理:完全酸水解,準確稱取背甲、肌肉質柄所得多糖1 mg,加200 μL水,在加200 μL 4.0 mol·L-1三氟乙酸,于安瓿瓶中密封保存,105 ℃水解反應6 h后,加入甲醇除去過量三氟乙酸,再用少量蒸餾水復溶,得酸水解產物;PMP衍生:使用微量移液器,準確移取兩種多糖及甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖標準品各100 μL,分別加入100 μL 0.3 mol·L-1NaOH水溶液和120 μL PMP溶液,置于70 ℃水浴中,反應1 h,反應結束后室溫下冷卻,加入100 μL 0.3 mol·L-1的稀鹽酸中和,加入500 μL氯仿萃取三次,萃取后保留水層,離心過膜,用于高效液相色譜分析。

2.2.2 總糖、蛋白質含量測定 總糖含量以甘露糖為標準品,采用苯酚-硫酸法測定。蛋白質含量以標準牛血清蛋白(BSA)為標準品,采用考馬斯亮藍法測定。

2.2.3 分子量測定 平均分子量采用高效凝膠滲透色譜與十八角度激光散射儀HPGPC-MALLS聯用法測定。樣品濃度:5 mg/mL;色譜柱:Shodex Ohpak SB-804 HQ (8.0 μm×300 mm) 和Shodex Ohpak SB-802.5 HQ (8.0 μm×300 mm)色譜柱串聯;流動相:0.1 mol·L-1NaNO3溶液;流速:0.6 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣體積:100 μL;檢測器:示差檢測器(RI)及多角度激光散射檢測器(MALLS);信號采集:45 min;樣品處理:分別取每位點處背甲、肌肉質柄所得多糖粗品2 mg,各加400 μL 0.1 mol·L-1的NaNO3溶液,12 000 r·min-1轉速下離心10 min,過0.22 μm膜。采用Astra5.3.4.20軟件處理數據。

2.3 N-糖鏈的釋放

分別取鵝頸藤壺幼體和成體組織20 mg于勻漿管內,加適量雙蒸水充分勻漿后加入10倍體積的丙酮,渦旋,超聲30 min,重復3次,棄上清,沉淀置于通風櫥內吹干。每份加200 μL Pronase酶溶液,于50 ℃水浴酶解12 h,100 ℃水浴滅活,12 000 r·min-1離心10 min。向上清加4倍體積無水乙醇,-20 ℃靜置過夜,12 000 r·min-1離心10 min,棄上清。沉淀復溶于45 μL蒸餾水中加5 μL 10×多糖變性緩沖液(含0.5% SDS,40 mmol·L-1DTT),混勻后于100 ℃煮沸變性,再加10 μL 10% NP-40和10 μL 10×GlycoBuffer2反應緩沖液,補水至100 μL,加1.3 μL PNGase F酶,37 ℃ 130 r·min-1搖床反應過夜。反應后100 ℃煮沸10 min使酶變性失活,冷卻后加3倍體積的冰乙醇,-20 ℃條件下靜置2 h,離心取上清液,離心濃縮至干。

2.4 N-糖鏈的標記

首先制備含4%的醋酸鈉(w/v)和2%的硼酸(w/v)甲醇溶液,新鮮配制標記試劑,即將0.32 mol·L-1的2-AA和1.0 mol·L-1的NaBH3CN溶于1.0 mL上述甲醇-醋酸鈉-硼酸溶液。標記反應時,樣品溶于20 μL雙蒸水中,然后快速地將 20 μL的2-AA標記試劑加至樣品中,混合物在65 ℃下避光水浴反應2 h。高速離心取上清,待PGC-ESI-MS/MS分析。

2.5 N-糖鏈的液質分析

在Agilent 1290超高效液相色譜儀上實現對N-糖鏈的分析,色譜柱:Hypercarb(150 mm×2.1 mm,3 μm);柱溫:35 ℃;流動相:10 mmol·L-1碳酸氫銨水溶液和含10 mmol·L-1碳酸氫銨的乙腈溶液;流速:0.12 mL/ min;樣品進樣量:5 μL;自動進樣器溫度:4 ℃。

2.6 N-糖鏈的信息化數據處理

使用Xcalibur 2.0.7軟件采集PGC-ESI-MS/MS數據,然后用DeconTools軟件對液質數據進行去卷基化。根據離子豐度歸一化,利用GlycResoft軟件對 DeconTools處理的數據進行匹配,并進行相對定量分析。最后通過 GlycoWorkBench軟件進行數據的匹配和篩選。

3 實驗結果

3.1 鵝頸藤壺多糖提取

鵝頸藤壺隸屬圍胸目茗荷科,背甲堅硬,用氯仿/甲醇(4∶1,v/v)溶液中浸泡24 h脫脂,除去鵝頸藤壺中的脂質和色素等雜質成分,經過堿水解/蛋白酶解、乙醇沉淀方法提取得到兩種多糖粗品,背甲組織中多糖粗品ZW6-1和肌肉質柄組織中多糖粗品ZW6-2,產率分別為0.87%、4.84%。

3.2 鵝頸藤壺多糖理化性質分析

為了研究兩種多糖粗品ZW6-1、ZW6-2的基本理化性質,本實驗分別測定了2種多糖的總糖含量、蛋白質含量、相對分子質量和單糖組成,結果如表1所示。單糖組成主要含有甘露糖、半乳糖、半乳糖胺、巖藻糖和葡萄糖,在肌肉質柄組織中富含甘露糖和葡萄糖,少部分樣品中含有氨基葡萄糖和巖藻糖,相比之下背甲組織中糖含量較低。背甲及肌肉質柄的總糖含量分別為4.70%、11.99%;蛋白質含量分別為36.21%、60.14%。高甘露糖組分的單糖組成及蛋白質含量結果表明,鵝頸藤壺多糖中可能是一種糖蛋白且含有較豐富的N-糖鏈表達,因此進一步分析不同生長時期N-糖鏈表達譜的差異性并比較,為探尋鵝頸藤壺附著機理提供糖組分依據。

表1 兩種鵝頸藤壺多糖理化性質分析結果Table 1 Physical and chemical properties of two kinds of Gooseneck barnacle glycoproteins

通過高效液相色譜法獲得多糖分子量色譜圖,檢測分析多糖樣品的分子量,并同時對樣品的純度進行評價,檢測結果如圖2(a)和圖2(b),所得背甲多糖和肌肉質柄多糖樣品在相應圖譜上均上顯示為單一峰,純度較高,兩者分子量分別為為19.81和18.40 kDa。

圖2 兩種鵝頸藤壺多糖的HPGPC-MALLS色譜圖Fig.2 HPGPC-MALLS chromatogram of two kinds of Gooseneck barnacle glycoproteins

3.3 鵝頸藤壺成體、幼體N-糖鏈液質分析

從鵝頸藤壺背甲和肌肉質柄中得到的兩種多糖,通過基本理化性質分析,肌肉質柄中蛋白質含量高達60.14%,單糖組成以甘露糖為主,因此采用液質分析方法對鵝頸藤壺成體與幼體肌肉質柄中的N-糖鏈表達譜進行分析,鵝頸藤壺成體中高表達的N-糖鏈如表2 所示,在成體中共鑒定得到26種N-糖鏈,其中13種N-糖鏈穩定高表達。高甘露糖型N-糖鏈占總糖鏈的20%以上,而其中F1H3N2含量最高,約占總糖鏈的39.06%。幼體中高表達的N-糖鏈,如表3 所示,共在幼體鑒定得到26種N-糖鏈,其中 14 種N-糖鏈穩定高表達表達,高甘露糖型N-糖鏈占總糖鏈的50%以上,而其中F1H3N2含量最高,約占總糖鏈的21.65%。如表4所示,在成體與幼體高表達的N-糖鏈中有9種是二者共同擁有的,但含量有所不同。

表2 A-GB中高表達的N-糖鏈Table 2 Highly expressed N-glycans in A-GB

表3 L-GB中高表達的N-糖鏈Table 3 Highly expressed N-glycans in L-GB

表4 A-GB與L-GB中共有N-糖鏈Table 4 N-glucans common to A-GB and L-GB

3.4 不同生長時期鵝頸藤壺N-糖鏈差異性表達分析

通過PGC-ESI-MS/MS方法獲得鵝頸藤壺成體、幼體中N-糖鏈表達譜,鵝頸藤壺成體主要N-糖鏈分析離子流圖如圖3所示,相對豐度較高的糖型組成為F1H3N2(39.06%)、F1H3N3(24.44%)、H3N3(9.35%)、H3N2(8.29%)、H5N2(6.74%)。鵝頸藤壺幼體主要N-糖鏈分析離子流圖如圖3所示,相對豐度較高的糖型組成為 F1H3N2(21.65%)、H6N2(15.93%)、H5N2(14.75%)、F1H3N3(11.64%)、H7N2(7.13%)。

圖3 不同生長時期鵝頸藤壺中主要N-糖鏈提取離子流圖Fig.3 Extraction of Ion current diagram of N-glycans extraction from Barnacles at different growth stages

如圖4根據N-糖鏈的結構類型、天線數量和不同修飾差異分析,高豐度的高甘露糖型N-糖鏈是鵝頸藤壺的顯著特征,不同生長時期鵝頸藤壺N-糖鏈均主要以高甘露糖型為主,特別在幼體中高甘露糖型N-糖鏈含量顯著高于成體,相比之下藤壺成體雜合型、復雜型、雙天線型和巖藻糖基化型N-糖鏈含量均高于幼體。

4 結果與討論

本文以南海海域鵝頸藤壺為原料,經過脫脂、堿水解/蛋白酶解、乙醇沉淀方法提取得到多糖,基本理化性質分析發現肌肉質柄中含有豐富的甘露糖和葡萄糖,已有研究證明單糖組成對藤壺幼蟲附著沉降能力有顯著影響,甘露糖對其沉降的影響最大,其次是巖藻糖,木糖的影響力最弱[17],這與本文鵝頸藤壺單糖組成以甘露糖為主的結果相吻合,并且蛋白質含量測定結果顯示肌肉質柄中的蛋白質含量高達60.14%,推測鵝頸藤壺多糖是一種糖蛋白有較豐富的N-糖鏈表達,因此,基于PGC-ESI-MS/MS的方法進一步對不同生長時期鵝頸藤壺肌肉質柄中的N-糖鏈進行分析,結果顯示在藤壺成體和幼體中N-糖鏈的種類大致相同,但豐度各不相同,整體來說藤壺成體與幼體中均發現26條N-糖鏈,含量最高的均為F1H3N2,高豐度的高甘露糖型是鵝頸藤壺的顯著特征,分別占總糖鏈的20.81%和52.17%。結合鵝頸藤壺單糖組成及N-糖鏈分析的結果顯示高甘露糖型N-糖鏈可能與藤壺的沉降粘附過程有著密切的關聯。

SIPC蛋白中有三條亞基,當單獨分析每個亞基時,發現它們對誘導腺介幼體沉降與完整的 SIPC 一樣有效[18],每個亞基都含有凝集素結合位點,凝集素能夠識別附著誘導蛋白復合物(SIPC)上的糖鏈,SIPC的活性糖鏈是活性所必需的[23],用過氧化物酶綴合的凝集素特異性屏蔽 SIPC 糖鏈結構中的Man,發現 SIPC 誘導幼蟲附著的活性喪失[16],因此我們認為Man可能是藤壺幼蟲沉降過程中 SIPC 蛋白發送附著信號的識別位點。Helen E[24]等人通過液相色譜和熒光檢測對SIPC的N-聚糖譜進行表征,發現高甘露糖型聚糖是天然 SIPC 中最普遍的聚糖,形成了由低聚甘露糖系列M2-9組成的甘露糖階梯。SIPC的N-聚糖譜表征發現以下幾種主要N-糖鏈:F1H3N2、H3N2、H3N2,這幾種N-糖鏈在鵝頸藤壺成體與幼體中均有高豐度表達,對SIPC的N-聚糖譜進行表征時還發現有一種N-糖鏈:H3N3,該糖鏈在鵝頸藤壺成體中高度表達,在幼體的N-糖鏈中未見表達,推測該糖鏈在鵝頸藤壺沉降附著過程中發揮重要作用。

高甘露糖型N-糖鏈具有強烈的誘導藤壺幼體附著的活性。本文對不同生長時期鵝頸藤壺肌肉質柄中的N-糖鏈含量進行分析,發現高甘露糖型N-糖鏈是其優勢糖鏈,成體與幼體高甘露糖型含量有顯著性差異,幼體中高甘露糖型含量遠遠高于成體。處于浮游階段的鵝頸藤壺幼體,急于尋找合適的基質附著[24],在其發現合適的附著基質時,幼蟲感知外源信號,然后將外源信號轉換成體內信號發送給特定的部位,并開始附著,SIPC蛋白開始活躍,與SIPC蛋白活性密切相關的糖鏈表達增加。因此可以解釋幼體中高甘露糖型N-糖鏈遠遠高于成體的現象。相比之下,藤壺成體雜合型、復雜型、雙天線型和巖藻糖基化型均高于幼體,這可能與高甘露糖型是其他糖型加工的最初形式有關,表明在藤壺的生長發育過程中伴隨著N-糖鏈修飾的改變[25],藤壺成體沉降結束后,牢固黏附的藤壺在不斷蛻皮過程中逐漸成長,其組織中N-糖型也不斷豐富。本文從糖鏈的角度,為鵝頸藤壺附著機理提供糖組分的依據,不同生長時期鵝頸藤壺N-糖鏈均以高甘露糖型為主,鵝頸藤壺幼體中高甘露糖型N-糖鏈含量為成體中高甘露糖型N-糖鏈含量的2.5倍,推測N-糖鏈在鵝頸藤壺長發育過程中發揮著至關重要的作用,可能高甘露糖型N-糖鏈與其附著黏附能力密切相關。