許氏平鲉Myomaker通過調控成肌細胞融合促進肌肉肥大生長的調控機制?

于倩文, 黃可佳, 張全啟,2,3, 賀 艷,2??

(1. 中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室, 山東 青島 266003;2.中國海洋大學三亞海洋研究院 海南省熱帶水產種質重點實驗室, 海南 三亞 572000;3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室, 山東 青島 266237)

細胞融合對多細胞生物的生長發育至關重要。成肌細胞融合是肌纖維發育、肌肉生長和肌肉損傷再生過程中肌纖維形成的基本過程。在肌肉發生過程中,單核成肌細胞(Myoblast)退出細胞周期,表達肌肉特異性轉錄因子并開始分化。一旦單核成肌細胞分化成為單核肌細胞,則相互融合生成多核肌纖維[1]。

成肌細胞融合過程包括肌肉細胞間相互識別并黏附,相互識別的細胞之間細胞膜的接觸增加、黏附增強,從而使細胞膜上的蛋白質分子和脂質重新排布,細胞膜打開,細胞發生融合,細胞間實現物質交換,從而融合成一個多核肌細胞[2-5]。關于肌細胞融合的分子機制,在果蠅中的研究比較透徹。果蠅肌細胞融合調控依賴于細胞表面受體在肌細胞(FCM)和基礎細胞(Founder cell,FC)中受體對的排斥作用。受體對是由基礎細胞表達的膜受體Kin of IrreC (Kirre)、Roughest (Rst)[6-7]和有融合能力的肌細胞表達的反受體Sticks and stones (Sns)、Hibris (Hbs)[8-11]組成。在斑馬魚中,Nephrin 和Kirrel3分別作為果蠅Sns和Kirre的同源蛋白,對斑馬魚胚胎的肌細胞融合都發揮著重要作用[12-13]。其中,Nephrin也能促進小鼠肌細胞的融合,但Kirrel3蛋白在哺乳動物肌細胞融合中的作用還有待進一步研究[14]。在斑馬魚中,通過突變胚胎表型證明細胞表面受體對Jamb和Jamc(Jam2a和Jam3b)對斑馬魚多核肌纖維的形成也是必要的,但其具體作用機制以及其下游哪些信號分子發揮作用仍有待確定[15]。Myomaker作為直接參與成肌細胞融合的肌肉特異性跨膜蛋白已被證明是小鼠肌細胞融合所必需的,Myomaker在肌發生過程中表達短暫,抑制其表達能阻止多核肌纖維的形成[16]。Myomaker不僅在胚胎骨骼肌發育過程中發揮關鍵作用,對成年肌肉損傷修復也是必不可少的。當骨骼肌受損時,處于靜息狀態的肌衛星細胞會被立即激活,同時肌肉細胞myomaker表達量上調能促進融合并對損傷進行修復[16]。功能驗證表明Myomaker對雞的成肌細胞融合也是必不可少[17]。除了高等脊椎動物,myomaker在斑馬魚快肌中也有高表達[18]。對牙鲆仔魚不同發育階段的myomaker基因表達模式研究發現,該基因在變態發育及稚魚期調節肌肉生長過程中發揮關鍵作用[19]。此外,Myomaker介導的肌肉干細胞融合是小鼠骨骼肌肥大生長所必需的[20],但肌細胞融合對肌肉肥大生長的確切貢獻仍有待研究。

許氏平鲉(Sebastesschlegelii)屬鲉形目、鲉科、平鲉屬,是中國北方重要的海水經濟魚類,其肌肉生長模式同牙鲆(Paralichthysolivaceus)、鱈魚(Gadusrnorhua)和虹鱒魚(Oncorhynchasmykiss)等大體型魚類相似,同時依賴于肌纖維增生和肥大生長[21-22]。褐鱒魚(Salmotrutta)、孔雀魚(Poeciliareticulata)和斑馬魚(Daniorerio)等小體型魚類則主要依賴于肌纖維肥大生長[23-25],均呈現為一種非限定性生長模式[26]。而鳥類和哺乳類其肌肉生長表現為限定性生長[27-29]。作為大型經濟型魚類,其肌肉的良好生長發育關系到其本身健康和經濟價值[30]。目前,對于高等脊椎動物尤其是哺乳類的肌肉的生長發育的研究相對來說較多,但是與魚類相關的研究甚少,主要集中在一些模式生物,如斑馬魚、青鳉。為了探究大型硬骨魚肌肉肥大生長模式,本研究鑒定了許氏平鲉myomaker基因(Ssmyomaker),對其在許氏平鲉胚胎發育過程中表達模式及肌肉肥大生長方面的功能進行研究。為進一步加深對硬骨魚類,尤其是許氏平鲉肌肉肥大生長過程相關機制的研究奠定了基礎,為從分子方面促進許氏平鲉快速生長、提高養殖效益提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗中所用到的許氏平鲉來自山東省青島市貝寶海洋科技有限公司及山東省威海市榮成市中孚水產養殖有限責任公司。

對不同發育時期的許氏平鲉胚胎取樣:1細胞期胚胎、32細胞期胚胎、囊胚、原腸胚、體節期胚胎、孵化期胚胎、仔魚7個時期。將所有樣品分兩部分:一部分用液氮迅速冷凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱中,用于總RNA的提取;另一部分加入4%多聚甲醛(PFA)中固定24 h以上,再經甲醇梯度脫水后保存于4 ℃冰箱,之后用于整體原位雜交實驗。

過表達實驗所用樣品:取樣兩次,第一次為連續投喂處理30 d,第二次為處理30 d后停止投喂并繼續培養90 d。每次隨機選取30尾,取樣前測量體長。經麻醉斷椎處理后取背鰭位置骨骼肌,剪碎,一部分經液氮迅速冷凍后保存于-80℃冰箱,用于總RNA的提取;另一部分固定于4% PFA,經甲醇梯度脫水后長期保存于4 ℃冰箱,用于組織切片統計觀察。

實驗所用到的HEK293T細胞及C2C12成肌細胞均來自中國海洋大學細胞工程技術實驗室。

1.2 方法

1.2.1 許氏平鲉myomaker基因克隆和生物信息學分析 按說明書用Trizol(供應商:Takara)提取許氏平鲉肌肉組織及胚胎體節期RNA,再用反轉試劑盒All-in-One 5×RT MasterMix(abm)合成cDNA。根據表1設計的引物進行PCR擴增[31]。擴增產物經Gel Extraction Kit試劑盒(康為世紀)回收后,連接轉化送測,用Megalign軟件比對測序結果,進一步確定序列準確性。

通過檢索NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和Ensembl(http://www.ensembl.org)數據庫,收集到7種硬骨魚的Myomaker氨基酸序列(蔭平鲉(Sebastesumbrosus) XP_037633866.1、牙鲆(Paralichthysolivaceus) XP_019964612.1、紅旗東方鲀(Takifugurubripes)XP_003974732.1、羅非魚(Oreochromisniloticus)XP_003444559.1、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)XP_008334664.1、虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss) XP_036791554.1、斑馬魚(Daniorerio)XP_017211542.1)和3種哺乳類動物Myomaker氨基酸序列(人(Homosapiens)NP_001073952.1、小鼠(Musmusculus)NP_001153074.1、雞(Gallusgallus)NP_001305386.1)。通過本地tblastx與本實驗室已有的許氏平鲉轉錄組數據庫比對后,PCR擴增獲得許氏平鲉myomaker的編碼序列。根據基因組和轉錄組數據并利用Gene Structure Display Server 2.0網站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對許氏平鲉與其他硬骨魚和哺乳動物myomaker基因結構進行對比分析。通過MUSCLE完成核苷酸序列多重比對,再使用MEGA 7.0軟件根據Neighbor-Join算法進行聚類分析[32]。并且將自展值(Bootstrap)設為500次,以對進化樹的可靠性進行檢測,從而構建出許氏平鲉myomaker基因的進化樹。

1.2.2 RNA-seq建庫表達分析 根據許氏平鲉轉錄組數據(https://db.cngb.org/search/sample/?Q=CNP0000222, 發布于2021年1月5日)分析myomaker在2.5齡成魚各組織中和各時期胚胎中的表達模式。將RNA序列在許氏平鲉基因組進行定位,使用clufflinks-cuffmerge-cuffdiff 計算出基因的TPM值。用TBtools軟件將myomaker基因表達量結果可視化。

1.2.3 胚胎整體原位雜交 用不同發育時期胚胎進行原位雜交。PCR擴增獲得探針模板,測序正確后使用探針標記試劑盒DIG RNA Labeling Mix合成myomaker原位探針,測定探針濃度后凝膠電泳檢測探針質量(條帶清晰單一),參照標準步驟進行整體原位雜交[33]。用NBT/BCIP Stock Solution對胚胎進行顯色后置于甘油中,并在立體顯微鏡下拍照觀察。

1.2.4 過表達載體構建及投喂 根據表1設計的帶酶切位點的引物擴增myomaker的編碼序列,將其連接至pMD-19T載體,驗證序列正確性后,用XhoⅠ和HindⅢ酶對擴增片段和pEGFP-N1載體(供應商:Invitrogen)進行雙酶切,連接轉化后,測序驗證獲得pEGFP-N1-myomaker重組質粒。

將許氏平鲉產出的仔魚平分為兩組,分別放入2 m×2 m×1 m的魚池中,每個魚池500條。由于產出第一個月的仔魚太小,故主要以小球藻、鹵蟲、輪蟲作為餌料。產出30 d后,于兩組中分別開始投喂混有空載質粒和過表達質粒的飼料,飼料投喂量隨魚體生長逐漸加量,質粒投喂最大量為0.5 mg/d,用Lipo6000轉染試劑(Beyotime)將質粒混入飼料中,連續投喂30 d后從2組中挑選健康無病的個體各30條進行肌肉組織取樣和體長測量。

1.2.5 實時熒光定量PCR 按說明書用Trizol(Takara)法提取過表達肌肉組織RNA,再用反轉試劑盒All-in-One 5×RT MasterMix合成cDNA。

根據表1設計的定量引物,用EIF5A1作為內參基因[34],使用2×SYBR Green PCR Master Mix試劑(Takara)和Lightcycler 480 PCR儀(Roche)進行實時熒光定量PCR擴增。采用2-ΔΔCt的方法進行數據分析,通過GraphPad Prism 7.04軟件應用T-test方法進行顯著性差異計算,p<0.05具有顯著性差異。

1.2.6 組織切片制備及HE染色 將所取部分肌肉組織樣品置于4%多聚甲醛(PFA),4 ℃固定24 h,經30%、50%、75%、85%和95%甲醇梯度脫水后放于100%甲醇長期保存,每個梯度至少2 h。脫水后經石蠟包埋制備組織切片,厚度為4～5 μm。經HE染色(hematoxylin-eosin staining)后,用尼康AZ100熒光顯微成像系統對染色結果拍照觀察并統計比較肌纖維橫截面積。

1.2.7 質粒構建、細胞培養、轉染及雙熒光素酶報告基因實驗 利用JASPAR(https://jaspar.genereg.net/)網站進行轉錄因子MyoD1在許氏平鲉myomaker基因啟動子結合位點預測,選取得分高于95%的結合位點進行調控作用驗證。用IDT PrimerQuest(http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)網站進行引物設計。根據表1設計的帶酶切位點的引物分別擴增許氏平鲉MyoD1編碼序列和myomaker基因啟動子序列,將其連接至pMD-19T載體(TaKaRa),驗證序列正確性后,用XhoⅠ和HindⅢ酶對擴增片段和pcDNA3.1載體、pGL3-basic載體(Invitrogen)進行雙酶切,連接轉化后,測序驗證獲得pcDNA-MyoD1和pGL3-myomaker重組質粒。

HEK293T細胞及C2C12成肌細胞用含有10%胎牛血清和1%三抗的DMEM培養基(Biological Industries)培養在37 ℃、5% CO2的加濕培養箱中。然后用Lipo3000 Reagent(Thermo Fisher)進行轉染。轉染48 h后,HEK293T細胞進行雙熒光素酶報告基因實驗[35],C2C12成肌細胞進行觀察拍照。

2 結果

2.1 許氏平鲉myomaker基因結構、共線性及系統進化分析

多重序列比對結果顯示,許氏平鲉Myomaker氨基酸序列與其他硬骨魚一致度較高,其中與蔭平鲉、羅非魚、紅旗東方鲀、半滑舌鰨、斑馬魚、牙鲆的序列一致性高于80%;而與人、小鼠和雞相比,序列一致性均低于70%(見圖1)。該基因具有7個跨膜結構域(Transmembrane domain,TMD),含胞外N端和胞內C端。序列中第215～221位氨基酸包括1個亮氨酸L、3個半胱氨酸C和1個絲氨酸S。通過基因結構對比分析發現,Ssmyomaker有6個外顯子,5個內含子,同斑馬魚、紅旗東方鲀、蔭平鲉等硬骨魚myomaker基因結構相似,而人、鼠和雞的myomaker基因均包含5個外顯子和4個內含子(見圖2)。系統進化分析結果表明,硬骨魚的myomaker基因聚為一支,其他基因聚為另一支,并且Ssmyomaker基因與蔭平鲉myomaker基因親緣關系最近,同牙鲆myomaker和紅旗東方鲀myomaker在進化上親緣關系也較近(見圖3)。

(紅色三角代表許氏平鲉myomaker基因結構。Red triangle marks the myomaker gene structure of S. schlegelii.)圖2 不同物種myomaker基因結構圖Fig.2 Gene structures of myomaker in different species

(進化樹是通過核苷酸序列多重比對后用Neighbor-Join算法構建的。樹枝上數值代表500次重復后的bootstrap值。紅色圓圈標記許氏平鲉myomaker基因。The phylogenetic tree was constructed from a multiple alignment of the nucleotide sequences using the neighbour-joining method. The numbers at the tree nodes represent percentage of bootstrap values after 500 replicates. Red circle marks the myomaker gene of S. schlegelii.)圖3 四足類和硬骨魚myomaker基因系統進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of myomaker in tetrapods and teleosts

共線性分析發現,在硬骨魚中,myomaker基因上、下游基因較為保守,但也存在部分基因的缺失、移位與突變。在哺乳動物和硬骨魚中沒有明顯的線性關系,但在該基因兩側也有一定的同源基因(見圖4)。這說明該基因在硬骨魚和哺乳動物中有一定的差異,其發揮功能的作用機制可能不同。

(不同顏色的五邊形代表不同的基因,五邊形的方向對應于染色體上基因的轉錄方向。橙色三角標注為許氏平鲉myomaker基因在染色體上共線性。Different colored pentagons represent different genes, and the direction of pentagons corresponds to the transcriptional direction of genes in the chromosome or scaffold. Orange triangle marks the syntenic analysis of myomaker gene of S. schlegelii on the chromosome.)圖4 染色體上不同物種myomaker基因共線性分析Fig.4 Syntenic analysis of myomaker gene of different species on the chromosome or scaffold

2.2 許氏平鲉myomaker基因不同組織表達模式分析

根據轉錄組數據,分析了Ssmyomaker基因分別在2.5齡雌、雄個體不同組織表達模式,發現myomaker基因在成魚個體中總體表達量較低,在雌魚肌肉中表達量相對較高,而在雄魚中主要在腸組織有較高表達,在腦、肌肉和精巢組織中有微量表達(見圖5)。

圖5 許氏平鲉myomaker基因在雌雄個體不同組織中的表達模式Fig.5 Expression patterns of black rockfish myomaker gene in different tissues from male and female individuals

2.3 許氏平鲉myomaker基因各時期胚胎發育表達模式分析

根據轉錄組數據分析發現,Ssmyomaker基因在1細胞期、32細胞期、囊胚期以及原腸胚各時期表達量均較低,而從體節期開始表達量增加,仔魚期表達量達到峰值(見圖6A)。通過探究Ssmyomaker基因在各時期胚胎發育表達模式發現,在許氏平鲉胚胎發育的早期沒有明顯信號出現,在原腸胚有零星信號出現(見圖6B,c和c’),體節期胚胎在體節位置有明顯信號出現(見圖6B,d和d’),在將孵期胚胎和仔魚信號集中在頭部(見圖6B,e和e’)和軀干前部(見圖6B,f和f’)。這一結果同轉錄組數據分析較為一致。

(藍色位置為雜交信號。A．myomaker基因在許氏平鲉各時期胚胎及0.5齡和2.5齡成魚肌肉組織表達量。B. myomaker基因在許氏平鲉各時期胚胎發育表達模式: a—f為正義探針;a’—f’為反義探針;a和a’為多細胞期胚胎;b和b’為囊胚期胚胎;c和c’為原腸胚胚胎;d和d’為體節期胚胎;e和e’為將孵期胚胎;f和f’為仔魚。標尺均為100 μm。The blue position is the hybridization signal. A．The expression of Ssmyomaker gene at different embryonic developmental stages and the muscle tissue of 0.5 and 2.5-year-old adult fish. B. The expression pattern of Ssmyomaker gene in different embryonic developmental stages.:a—f: Sense probes; a’ —f’: Antisense probes; a,a’: Multi-cell stage embryo; b,b’: Blastula stage embryo; c,c’: Gastrula stage embryo; d,d’: Somite stage embryo; e,e’: Pre-hatching stage embryo; f,f’: Larval fish. Scale bars=100 μm.)圖6 許氏平鲉myomaker基因在不同發育時期胚胎表達模式Fig.6 Expression pattern of Ssmyomaker gene in different embryonic development stages

2.4 許氏平鲉myomaker基因體內促肌肉融合生長功能研究

通過投喂過表達質粒的方式進行體內誘導myomaker基因過表達,連續投喂30 d體長測量比較發現,處理組體長顯著小于對照組(見圖7A),實時熒光定量檢測結果顯示誘導處理使myomaker基因表達量顯著升高(見圖7B)。對所取肌肉組織進行石蠟切片及HE染色發現,與對照組相比,處理組肌纖維排列更為緊密,單根肌纖維直徑更大(見圖8A)。取相同位置完整肌節進行統計并比較肌纖維橫截面積及數量發現,與對照組相比,處理組<500 μm2的肌纖維數量所占比例較小,>1 000 μm2的肌纖維數量所占比例較大(見圖8B),且處理組<500 μm2的肌纖維數量略少于對照組,500～1 000 μm2的肌纖維數量顯著少于對照組,>1 000 μm2的肌纖維數量顯著多于對照組(p<0.05)(見圖8C)。連續投喂30 d后繼續培養90 d經肌肉組織切片及HE染色發現,處理組仍保持更為緊密的肌肉生長狀態(見圖9A)。用上述同樣的方法進行肌纖維橫截面積統計比較發現,處理組1 000～5 000 μm2的肌纖維比例小于對照組,而>5 000 μm2的肌纖維數量占比大于對照組(見圖9B)。

(A．許氏平鲉體內過表達myomaker基因30 d體長統計。數據代表個體體長(n=30),表示p<0.000 1;表示p<0.01。B. 實時熒光定量檢測myomaker基因表達量變化。數據代表平均值±標準差(n=4),表示p<0.01。A．Statistical results of body length of Ssmyomaker induction by overexpression in vivo 30 days. The data represent individual body length (n=30), indicates p <0.000 1, indicates p< 0.01; B. Ssmyomaker gene expression changes detected by qRT-PCR. The data represent the mean±SD(n=4),indicates p<0.01.)圖7 許氏平鲉體內過表達myomaker基因30 d后體長統計結果和表達量變化Fig.7 Statistical results of body length and expression changes after overexpression of black rockfish myomaker gene for 30 days in vivo

(A. 肌肉組織切片HE染色結果,綠色實線標注為統計范圍,標尺均為200 μm;B.不同面積范圍肌纖維數量比例;C. 不同面積范圍肌纖維數量統計分析,數據代表平均值±標準差(n=6), 表示p<0.05,ns表示p>0.05。A. Results of HE staining of muscle tissue sections, the green solid line marks the statistical range, scale bars=200 μm; B. Proportion of muscle fibres in different area ranges; C. Statistical analysis of the number of myofibers in different area ranges. The data represent the mean±SD(n=6),indicates p<0.05, ns indicates p>0.05.)圖8 許氏平鲉體內過表達myomaker基因30 d后肌肉組織觀察及肌纖維橫截面積統計Fig.8 Histological observation of muscle tissue and statistical results of cross sectional area of muscle fibers after overexpression of Ssmyomaker gene in vivo for 30 days

(A．肌肉組織切片HE染色結果,每個肌節分2個4×視野,重復部分不計,所有切片圖共用的標尺均為200 μm;B.不同面積范圍肌纖維數量比例。A. Results of HE staining of muscle tissue sections, each sarcomere is divided into two 4× visual fields, repetition is not counted, the scale bar shared by all slices is 200 μm; B. Proportion of muscle fibres in different area ranges.)圖9 許氏平鲉體內過表達myomaker基因30 d后繼續培養90 d肌肉組織觀察及肌纖維橫截面積統計Fig.9 Histological observation of muscle tissue and statistical results of cross sectional area of muscle fibers after overexpression of Ssmyomaker gene in vivo for 30 days and then cultured for 90 days

2.5 許氏平鲉myomaker基因促C2C12成肌細胞融合生長功能研究

通過體外細胞轉染實驗探究了許氏平鲉myomaker基因對C2C12成肌細胞融合生長的影響,轉染48 h后觀察發現,myomaker基因過表達質粒組出現細胞靠近黏附,有融合的趨勢,也有雙核細胞出現(見圖10)。

(A.紅色箭頭標注發生融合的細胞; B.染核后merge結果。Empty為空白組, pEGFP-N1為空載組,pEGFP-N1-myomaker為過表達組。所有圖共用標尺為50 μm。A.Red arrow indicates the fused cells; B. The merge results after nuclear staining. Empty was the blank group, pEGFP-N1 was the empty plasmid group, and pEGFP-N1-myomaker was the overexpression group. The scale bar shared by all images is 50 μm.)圖10 許氏平鲉myomaker基因過表達可促進C2C12細胞融合Fig.10 Overexpression of myomaker gene of black rockfish can promote the fusion of C2C12 cells

2.6 MyoD1基因對許氏平鲉myomaker基因的調控作用

根據JASPAR(https://jaspar.genereg.net/)網站預測轉錄因子MyoD1在Ssmyomaker啟動子上存在潛在結合位點(Relative profile score threshold>95%)(見圖11A)。并通過雙熒光報告基因實驗驗證發現,在許氏平鲉中,MyoD1對myomaker基因沒有顯著調控作用(見圖11B)。

(A. 轉錄因子MyoD1在Ssmyomaker啟動子上潛在結合位點; B. 雙熒光素酶報告基因實驗結果。柱右側的數據代表平均值±標準差。表示p<0.01,ns表示p>0.05。A. Potential binding sites of the transcription factor MyoD1 on the Ssmyomaker; B. The results of the dual luciferase reporter gene experiment. The data on the right side of each bar represents the mean±standard deviation. indicates p<0.01, ns indicates p>0.05.)圖11 MyoD1對許氏平鲉myomaker基因的調控作用Fig.11 Regulation effect of MyoD1 on myomaker gene of black rockfish

3 討論

在本研究中,通過氨基酸序列比對和系統進化分析發現Ssmyomaker基因同所分析的硬骨魚myomaker序列一致性較高,而同人、小鼠和雞三者的myomaker相比,一致性較低。有研究者通過設計兩種定位的Myomaker抗體,發現myomaker不僅定位于細胞膜上,也存在于高爾基體和囊泡中,這揭示了myomaker在細胞中的精確定位及其潛在的細胞間轉運功能[36]。在許氏平鲉myomaker的第215—221位氨基酸中有3個氨基酸與小鼠不同,3個保守棕櫚酰化半胱氨酸中有1個與小鼠存在差異。這說明該基因在許氏平鲉中的功能與在小鼠中參與調控高爾基體轉運的功能可能存在一定的分化。通過許氏平鲉與斑馬魚、紅旗東方鲀、蔭平鲉等硬骨魚以及哺乳動物基因結構分析、系統進化分析和基因共線性對比分析可以得出myomaker基因在硬骨魚和哺乳動物中功能相似,但可能還存在一定的差異。

有研究報道骨骼肌發育最早可能起源于胚胎發育時期的體節期[37-39]。有研究表明在斑馬魚胚胎中,myomaker在快肌細胞中短暫表達。在體節形成早期沒有明顯信號,在受精后20 h胚胎中出現明顯信號,在發育后期,myomaker在大部分體節中都有表達。隨著體節形成,myomaker信號逐漸向尾部遷移[18]。與斑馬魚相似,通過轉錄組數據分析及胚胎原位雜交,發現Ssmyomaker基因在胚胎發育時期表達量較高,尤其在體節期胚胎中有高表達,雜交信號集中出現在體節位置。但在將孵期胚胎和仔魚中,雜交信號集中在頭部和軀干前部,這與斑馬魚不同。這種差異可能與斑馬魚的有限生長以及許氏平鲉的無限生長模式有關。在成魚中,Ssmyomaker基因總體表達量較低,在雌魚中主要在肌肉中表達量相對較高,而在雄魚中主要在腸組織中有較高表達,在雄魚腦、肌肉和精巢組織中有微量表達。這說明myomaker基因在許氏平鲉成魚雌、雄個體中調控肌肉生長的模式可能不同,可能與成魚雌、雄個體的生長二態性有關。這對研究myomaker基因在硬骨魚骨骼肌肥大生長過程中的分子機制提供了新的見解。

肌肉肥大生長需要myomaker介導的肌肉干細胞融合[20]。在成肌細胞融合的三個關鍵步驟中,myomaker基因主要在融合起始和半融合中間體的形成發揮重要作用[40]。轉錄組數據及胚胎原位雜交結果顯示,myomaker主要在胚胎期有較高表達,在小魚及成魚中表達量較低,并且在呈現無限生長的許氏平鲉(S.schlegelii)中基因編輯手段受限。有研究者通過投喂過表達質粒的方式獲得了影響石斑魚性腺發育[41]及性逆轉的發現[42]。在本研究中,同樣通過投喂的方式在許氏平鲉體內誘導myomaker基因過表達后發現,myomaker表達量有顯著升高。肌肉組織切片及HE染色發現肌纖維排列更緊密;肌纖維橫截面積統計顯示處理組<500 μm2及500～1 000 μm2的肌纖維數量少于對照組,>1 000 μm2的肌纖維數量占比更大,數量更多,表明在許氏平鲉體內誘導myomaker基因過表達使肌纖維融合增粗,有效促進肌肉肥大生長。而處理組與對照組肌纖維總數沒有顯著差異,說明還存在肌纖維增生生長,與大體型魚類肌肉生長方式相符[21]。處理組總體體長顯著小于對照組可能說明myomaker過表達后主要對肌肉肥大生長有明顯促進作用,使肌纖維橫截面積增大,對體長增加的促進作用不顯著。此外,還通過體外細胞轉染實驗探究了許氏平鲉myomaker基因對C2C12成肌細胞融合生長有一定的促進作用。進一步說明調控許氏平鲉肌肉的肥大生長是通過促進成肌細胞融合來實現的。

成肌細胞融合在骨骼肌形成和損傷再生過程中發揮著重要作用,是一個受嚴格調控的復雜動態過程[43]。有學者研究表明,許多調控因子參與調控細胞融合過程,如 MRFs 家族(主要包括Myf5、MyoD、MyoG和Myf4)[44],該家族基因可以同 E-box 作用元件結合,以調控許多成肌相關基因的轉錄,其中MyoD被認為是肌肉形成的決定因子。在本研究中,探究了轉錄因子MyoD1對Ssmyomaker基因有潛在結合位點,但并沒有顯著調控作用。而在小鼠[45]和雞[17]中,MyoD可以直接與myomaker啟動子結合,調控其轉錄。