分子改良提高甘露聚糖酶的耐熱性

王亞偉 薛強 熊海容

摘要：以來源于嗜熱放線菌（Thermobifida fusca）的甘露聚糖酶基因（KJ806638）為研究對象，利用易錯PCR方法對其進行改造，獲得了耐熱性進一步提高的甘露聚糖酶。篩選獲得的N16I突變株，其最適反應溫度從72.5 ℃提升到77.5 ℃。差示掃描熒光定量（DSF）檢測結果顯示，酶蛋白質的表觀解鏈溫度Tm從61.9 ℃提升到 63.2 ℃。

關鍵詞：甘露聚糖酶；易錯PCR；熱穩定性

中圖分類號：Q55? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）12-0151-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.027 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Improving the thermotolerance of mannanase through molecular improvement

WANG Ya-wei1，XUE Qiang2，XIONG Hai-rong2

（1.School of Life Science and Technology，Wuhan Polytechnic University，Wuhan? 430048，China；

2. College of Life Sciences， South-Central Minzu University， Wuhan? 430074，China）

Abstract：The mannanase gene （KJ806638） from Thermobifida fusca was used as the research object， and it was modified by the error-prone PCR method， and the heat resistance of mannanase was further improved. The optimum reaction temperature of N16I mutant was increased from 72.5 ℃ to 77.5 ℃. Differential scanning fluorometry （DSF） testing results showed that the apparent decomposition temperature Tm of the enzyme protein increased from 61.9 ℃ to 63.2 ℃.

Key words： mannanase； error-prone PCR； thermostabilty

甘露聚糖酶是一種半纖維素酶類［1］，現已被廣泛應用于飼料、造紙、洗滌劑、食品和石油開采及生物質能源等領域，尤其在功能性低聚糖制備和添加劑等方面應用前景十分廣闊。在飼料行業，甘露聚糖是飼料中主要抗營養因子之一，會增加食糜在畜禽消化道內的黏度，導致畜禽對飼料中營養物質的消化吸收受到影響，致使飼料的消化利用率降低［2］。在石油方面，甘露聚糖酶常被用作壓裂液的破膠劑，可以增強壓裂液的導流能力，減少破壞性物質的殘留，從而提高產油量［3］。在造紙過程中，甘露聚糖酶可用作處理紙漿的漂白劑，可以有效促進木質素的降解而保留纖維素［4］。

工業生產過程中，往往存在高溫等極端環境，高溫環境能加快酶促反應速度，提高液體物料的流動性能，防止有害微生物在過程中的生長繁殖等［5，6］。普通中溫甘露聚糖酶在高溫下會發生結構變化，從而大幅度地喪失活性。來源于嗜熱放線菌（Thermobifida fusca）的耐熱甘露聚糖酶［7］進行水解，能從根本上解決高溫環境使加入的酶很快失活的問題。

易錯PCR技術［8］是在正常PCR技術上演變而來的，它是一種使DNA在復制擴增過程中更容易出現錯誤配對的PCR技術，因此又稱為錯配PCR或傾向錯誤PCR。易錯PCR通常是利用低保真度的Taq DNA聚合酶和改變一些PCR反應體系等手段，來降低PCR過程中DNA復制的保真度，使錯配率升高，從而得到與原來不同的DNA序列或基因。將該酶基因序列通過易錯PCR突變后，通過表達和酶特性鑒定后篩選，獲得的更高耐熱性的甘露聚糖酶突變體4號，在飼料添加劑、保健食品、造紙、洗滌、釀造、紡織和醫藥等領域具有廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 菌株質粒和試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）、質粒pET-22b（+）均為實驗室保藏，質粒pAOhr-ManB來源于武漢擎科生物科技有限公司合成。限制性內切酶、Taq酶、Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA連接酶等工具酶購自TaKaRa公司；DNA純化試劑盒購自愛思進生物技術有限公司。IPTG、X-Gal、SDS及角豆膠購自Sigma公司，TEMED、過硫酸銨、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺為國藥試劑。

50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：取7.10 g磷酸氫二鈉溶解于800 mL去離子水中，用檸檬酸調節pH為4.0～7.5范圍內任一值后，定容至1 L。50 mmol/L Tris-HCl緩沖液：取6.06 g Tris溶解于800 mL去離子水中，用1 mol/L HCl調節pH至7.5～9.0，定容至1 L。50 mmol/L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液：取7.50 g甘氨酸溶解于800 mL去離子水中，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至9.0～11.0，定容至1 L。

1.2 易錯PCR突變和表達

將實驗室保藏的菌株Escherichia coli DH5α-pAOhr-ManB擴大化培養，使用試劑盒提取質粒pAOhr-ManB作為模板，擴增甘露聚糖酶的基因，以回收的片段為模板，進行易錯PCR。所用的引物序列見表1。

易錯PCR通過改變體系中錳離子濃度和4種脫氧核糖核苷酸的濃度比例，使甘露聚糖酶的堿基序列發生隨機突變，從而得到多個甘露聚糖酶ManB的突變基因序列。易錯PCR的操作體系見表2。基因擴增、大腸桿菌表達和蛋白質提純方法見參考文獻［9，10］。

1.3 酶學性質檢測

原酶及突變酶最適溫度測定［11］：采用3，5-二硝基水楊酸方法（簡稱DNS法）對原酶及突變酶的最適溫度進行測定，以0.5%角豆膠為底物，在pH 7.0反應條件下，分別測定不同溫度梯度（50～85 ℃）下的酶活力，酶活力最高點為最適反應溫度，以測得的最大酶活值為100%，計算不同溫度下的相對酶活力，每個反應設置3個平行。

差示掃描熒光定量（Differential scanning fluorometry， DSF）測定［12］：檢測不同重組酶蛋白的表觀解鏈溫度即Tm。DSF試驗只需要少量純化的蛋白質（10～25 μL），其最低蛋白質濃度為0.1～0.3 mg/mL，將蛋白質和熒光染料均勻混合加入96孔板中，再放入實時熒光定量PCR儀中，可以在較短時間內完成測量過程，這些特點使DSF方法可以快速測量蛋白質的熱穩定性。將20 μL純化后的不同酶蛋白質與5 μL的100×SYPRO Orange染料混合離心，設置實時熒光定量PCR系統中以0.1 ℃的增幅從30 ℃到99 ℃加熱樣品，并同時測得其熒光值，根據熒光值的變化來測定重組酶的Tm。

2 結果與分析

2.1 甘露聚糖酶突變株基因的獲得和表達

本實驗室保藏的甘露聚糖酶（PDB：1BQC）基因來源于Thermobifida fusca，在不改變氨基酸序列的情況下，對該酶基因序列進行序列重排與密碼子優化。為了便于對該基因進行分子操作，消除了基因序列中的限制性內切酶位點，合成了一個新基因ManB（KJ806638）。同時在甘露聚糖酶ManB基因的兩端分別設計添加酶切位點Nco I和Xho I，交由武漢擎科生物科技有限公司完成全基因合成，獲得重組載體pAOhr-ManB。以pAOhr-ManB質粒作為模板，設計引物，通過使用Taq酶和改變PCR體系中的Mn2+濃度和4種脫氧核糖核苷酸的濃度比例，使甘露聚糖酶的堿基序列發生隨機突變，從而得到多個甘露聚糖酶ManB的突變基因序列。本研究篩選獲得的突變酶氨基酸序列信息如下（突變位點為N16I）：

MATGLHVKNGRLYEAIGQEFIIRGVSHPHNWYPQHTQAFADIKSHGANTVRVVLSNGVRWSKNGPSDVANVISLCKQNRLICMLEVHDTTGYGEQSGASTLDQAVDYWIELKSVLQGEEDYVLINIGNEPYGNDSATVAAWATDTSAAIQRLRAAGFEHTLVVDAPNWGQDWTNTMRNNADQVYASDPTGNTVFSIHMYGVYSQASTITSYLEHFVNAGLPLIIGEFGHDHSDGNPDEDTIMAEAERLKLGYIGWSWSGNGGGVEYLDMVYNFDGDNLSPWGERIFYGPNGIASTAKEAVIFGLEHHHH

HH

采用限制性內切酶EcoR I和Not I完成甘露聚糖酶突變株N16I的基因和分泌型表達載體pET-22b（+）雙酶切，再使用T4連接酶將兩者連接，構建重組表達質粒。將該重組表達質粒轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，以PCR驗證法篩選出陽性克隆菌株，并測序驗證。驗證正確后發酵產酶，純化得到酶蛋白。目標甘露聚糖酶ManB的三維結構如圖1所示。

2.2 甘露聚糖酶的性質分析

2.2.1 甘露聚糖酶最適溫度的測定 由圖2可知，以0.5%角豆膠為底物，在pH 7.0和反應時間10 min的條件下，原甘露聚糖酶ManB的最適反應溫度在72.5 ℃左右，而同樣條件下突變體酶的最適反應溫度為77.5 ℃，顯示出突變酶的最適反應溫度明顯提高。

2.2.2 甘露聚糖酶的熱穩定性分析 由圖3可知，甘露聚糖酶ManB和其突變體均具有較好的耐熱性，在65 ℃處理30 min后仍無滅活現象。突變酶在70 ℃條件下處理后的殘余酶活力高于原酶，顯示出突變酶的耐熱性能明顯提高。

2.2.3 甘露聚糖酶Tm的測定 根據熒光值的變化來測定原酶和突變酶的Tm如圖4所示。由圖4可知，酶蛋白質的表觀解鏈溫度Tm從原酶的61.9 ℃提升到突變酶的 63.2 ℃。測定結果進一步證實了突變酶的耐熱性提高。

3 小結

本研究將Thermobifida fusca來源的β-甘露聚糖酶ManB在大腸桿菌BL21中進行了異源表達，并通過易錯PCR技術對該酶的基因序列進行了兩輪易錯PCR，得到突變體文庫。通過篩選獲得了一株性能較好的突變甘露聚糖酶N16I，并對其酶學性質進行了分析，其耐熱性得到了提升［13-15］。本研究為甘露聚糖酶的分子改造和生產提供了一定的依據和基礎。

參考文獻：

［1］ 張建新，宋宜樂，馮軍廠，等. 微生物β-甘露聚糖酶的研究進展［J］. 中國釀造， 2019， 38（4）： 7-10.

［2］ 殷運菊，閆昭明，陳清華，等. β-甘露聚糖酶的結構、特性及其在畜禽生產中的應用［J］. 動物營養學報，2021，33（5）：2535-2543.

［3］ 陳曉飛，李珊珊，刁文濤，等. 高產β-甘露聚糖酶菌株的分離鑒定及酶學性質研究［J］. 中國釀造， 2021， 40（9）： 92-97.

［4］ WANG Y W， SHI P J， LUO H Y， et al. Cloning， over-expression and characterization of an alkali-tolerant endo-β-1，4-mannanase from Penicillium freii F63［J］. Journal of bioscience and bioengineering， 2012，113（6）：710-714.

［5］ 莊瀅潭，劉芮存，陳雨露，等. 極端微生物及其應用研究進展［J］. 中國科學：生命科學， 2022， 52（2）： 204-222.

［6］ 翁彩紅，韓業君. 極端微生物與生物制造［J］. 科學，2019，71（4）：45-48.

［7］ HILGE M.， GLOOR S M， RYPNIEWSKI W， et al. High-resolution native and complex structures of thermostable β-mannanase from Thermomonospora fusca - substrate specificity in glycosyl hydrolase family 5［J］. Structure， 1998， 6： 1433-1444.

［8］ ZENG J， HE C， GUO J， et al. Improvement of the catalytic activity of thermoacidophilic pullulan hydrolase type III by error-prone PCR technology［J］. Applied biochemistry and microbiology， 2022， 58（3）： 277-285.

［9］ WANG X C， YOU S P， ZHANG J X， et al. Rational design of a thermophilic β-mannanase from Bacillus subtilis TJ-102 to improve its thermostability［J］. Enzyme and microbial technology， 2018， 118： 50-56.

［10］ WANG Y W， SHU T， FAN P， et al. Characterization of a recombinant alkaline thermostable β-mannanase and its application in eco-friendly ramie degumming［J］. Process biochemistry， 2017， 61： 73-79.

［11］ 付 巧，林啟蘭，薛 強，等. N端截短CBM41對枯草芽孢桿菌來源普魯蘭酶酶學性質的影響［J］. 生物技術通報，2022，38（6）：245-251.

［12］ WANG Y W， WANG J， ZHANG Z Q， et al. High-temperature behavior of hyperthermostable Thermotoga maritima xylanase XYN10B after designed and evolved mutations［J］. Applied microbiology and biotechnology， 2022， 106：2017-2027.

［13］ 羅長財，繆 靜，李國瑩，等. N-糖基化對一種新型重組耐高溫β-甘露聚糖酶（ReTMan26）穩定性的影響［J］. 微生物學通報， 2019， 46（1）： 11-19.

［14］ 張 蕊，朱 虹，周峻沛，等. β-甘露聚糖酶分子生物學研究進展［J］. 中國農業科技導報， 2018， 20（5）： 34-46.

［15］ 汪 斌， 張華山， 熊海容. 一株全基因合成的高溫嗜堿甘露聚糖酶的酶學性質分析［J］. 湖北農業科學，2017，56（12）： 2356-2358.