酸性染料比色法測(cè)定對(duì)葉百部中總生物堿含量

吳港圓 覃海琴 胡東南 張淼 謝鳳鳳 王孝勛

摘要：采用酸性染料比色法測(cè)定不同發(fā)育時(shí)期的對(duì)葉百部（Stemona tuberosa Lour.）中總生物堿含量，采用酸性染料比色法，以對(duì)葉百部堿為對(duì)照品，溴麝香草酚藍(lán)為酸性染料，甲醇、三氯甲烷提取，4%鹽酸溶解，在413 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定。結(jié)果表明，對(duì)葉百部堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.003 7X+0.089 （R2=0.995 9），在32～800 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；平均加樣回收率為101.23%，平均加樣回收率的RSD為2.63%。1年生對(duì)葉百部總生物堿含量為1.87～4.55 mg/g；2年生對(duì)葉百部總生物堿含量為4.52～9.63 mg/g。酸性染料比色法具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：對(duì)葉百部（Stemona tuberosa Lour.）；總生物堿；酸性染料比色法；不同發(fā)育時(shí)期

中圖分類號(hào)：R917? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2023）12-0154-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.028 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Determination of total alkaloid in Stemona tuberosa Lour. by acid dye colorimetric method

WU Gang-yuan1a，QIN Hai-qin1a，HU Dong-nan2，ZHANG Miao1b，XIE Feng-feng1b，WANG Xiao-xun1a

（1a.College of Pharmacy， 1b.Key Laboratory of Zhuang Yao Medicine in Guangxi，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning? 530200， China；2. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning? 530023， China）

Abstract： The total alkaloid content in Stemona tuberosa Lour. at different developmental stages was determined using the acid dye colorimetric method. The acid dye colorimetric method was used， with Stemona tuberosa Lour. alkali as the reference material and bromothymol blue as the acid dye. Methanol and chloroform were extracted， and dissolved in 4% hydrochloric acid. The determination was carried out at a wavelength of 413 nm. The results showed that the standard curve of Stemona tuberosa Lour. alkali was Y=0.003 7X+0.089 （R2=0.995 9）. The linear relationship was good? from 32 to 800 μg/mL；the average sample recovery rate was 101.23%， and the RSD of the average sample recovery rate was 2.63%. The total alkaloid content of annual Stemona tuberosa Lour. was 1.87～4.55 mg/g；the total alkaloid content of the biennial Stemona tuberosa Lour. was 4.52～9.63 mg/g. The acid dye colorimetric method had the advantages of simple operation， good repeatability， and high stability.

Key words： Stemona tuberosa Lour.； total alkaloid； acid dye colorimetric method； different developmental stages

中藥百部為百部科百部屬植物直立百部（Stemona sessilifolia Miq.）、蔓生百部（Stemona japonica （Bl.） Miq.） 或?qū)θ~百部（Stemona tuberosa Lour.）的干燥塊根，甘、苦，微溫，歸肺經(jīng)，具有潤(rùn)肺下氣止咳、殺蟲滅虱的功效［1］，對(duì)葉百部是目前市場(chǎng)上百部類藥材的主要來源［2］。對(duì)葉百部包含生物堿類和其他非生物堿類化學(xué)成分。生物堿類是百部屬植物的主要化學(xué)成分及活性成分［3］，是百部止咳和殺蟲的主要活性物質(zhì)［4，5］。百部藥材中的生物堿成分在類別和含量上有差異，直立百部和蔓生百部的化學(xué)成分基本相同，而對(duì)葉百部與直立百部、蔓生百部的化學(xué)成分差異顯著［6-8］。中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)以2020年《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）為準(zhǔn)則，保證中藥安全、有效、穩(wěn)定及可控。《中國(guó)藥典》中以生物堿為主要活性成分的多味中藥材均以生物堿成分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，如苦參的含量測(cè)定以苦參堿和氧化苦參堿為評(píng)價(jià)指標(biāo)，麻黃的含量測(cè)定以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿為評(píng)價(jià)指標(biāo)，防己的含量測(cè)定以粉防己堿和防己諾林堿為評(píng)價(jià)指標(biāo)。但《中國(guó)藥典》中尚未收載百部藥材的含量測(cè)定方法，百部項(xiàng)下僅有性狀、鑒別、浸出物、生物堿的理化鑒別方法等項(xiàng)目，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中既沒有TLC定性鑒別，也沒有含量測(cè)定，不能有效評(píng)價(jià)、控制百部藥材和相關(guān)制劑的質(zhì)量。本研究建立對(duì)葉百部中總生物堿含量的酸性染料比色測(cè)定方法，為百部（對(duì)葉百部）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的完善提供技術(shù)參考。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料

對(duì)葉百部樣品為2019年10月下旬至2020年1月上旬在廣西防城港市、梧州市、賀州市、桂林市、河池市、崇左市、百色市等地區(qū)采集的野生植株，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)滕建北教授鑒定為對(duì)葉百部。采用幼苗遷地栽培的方式種植于廣西中醫(yī)藥大學(xué)仙葫藥圃，并根據(jù)時(shí)節(jié)與實(shí)際需求進(jìn)行澆水、除草、松土、引藤上架及施肥等田間管理。1年生的樣品于2021年春季采挖，按照《中國(guó)藥典》的方法進(jìn)行凈制、蒸煮、切片、烘干、打粉，過50目篩備用。2年生的樣品于2022年采挖，處理方式同1年生的樣品。

1.2 試劑和儀器

對(duì)葉百部堿（含量≥98%）購自成都普思生物科技股份有限公司；甲醇、三氯甲烷等試劑均為分析純。UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)購自島津儀器（蘇州）有限公司；低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海愛朗儀器有限公司；SQP型電子天平購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；BSA224S型電子天平購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)購自上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)葉百部總生物堿的理化鑒定

參照《中國(guó)藥典》百部項(xiàng)下的理化鑒定方法，取對(duì)葉百部粉末3 g，加70%乙醇50 mL，超聲波提取40 min，濾過，濾液蒸去乙醇，殘?jiān)影彼{(diào)節(jié)pH至10～11，加入三氯甲烷4 mL，振搖提取3次，分取三氯甲烷層，低溫旋蒸，蒸干，殘?jiān)?%鹽酸溶液5 mL，溶解，濾過。濾液分為2份：一份滴加碘化鉍鉀試液；另一份滴加硅鎢酸試液。1年生的11個(gè)樣品及2年生的10個(gè)樣品均表現(xiàn)為碘化鉍鉀顯色反應(yīng)有橙紅色沉淀生成，硅鎢酸顯色反應(yīng)有乳白色沉淀生成。

2.2 溶液制備

精密稱取對(duì)葉百部堿10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，即得0.2 mg/mL對(duì)葉百部堿對(duì)照品溶液。稱取溴甲酚綠粉末0.1 g，加2.8 mL 0.05 mol/L氫氧化鈉溶液，再加去離子水稀釋至200 mL，超聲波提取15 min，即得溴甲酚綠溶液。稱取溴麝香草酚藍(lán)粉末0.1 g，加3.2 mL 0.05 mol/L氫氧化鈉溶液，再加去離子水稀釋至 200 mL，超聲波提取15 min，即得溴麝香草酚藍(lán)溶液。精密稱取對(duì)葉百部粉末（過50目篩）1.000 0 g，加40 mL甲醇，超聲波提取20 min。放置室溫，濾過，得到醇提液。揮干甲醇，用4%鹽酸溶解，抽濾。濾液用氨水調(diào)節(jié)pH至9～10，沉淀和濾液均轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，20 mL三氯甲烷萃取，分取三氯甲烷層，低溫旋蒸，蒸干三氯甲烷。甲醇溶解，定容：1年生的樣品定容至25 mL；2年生的樣品定容至50 mL，即得供試品溶液。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)和酸性染料的種類及用量選擇

取1 mL供試品溶液2份，分別置于60 mL分液漏斗中，一份中加入7 mL pH 5.4乙酸-乙酸鈉緩沖液、3 mL溴甲酚綠溶液，4 mL三氯甲烷萃取，振搖? 5 min，靜置30 min，分取三氯甲烷層，重復(fù)萃取3次，定容至10 mL，全波長(zhǎng)掃描；另一份加入7 mL pH 5.4乙酸-乙酸鈉緩沖液、3 mL溴麝香草酚藍(lán)溶液，4 mL三氯甲烷萃取，振搖5 min，靜置30 min，分取三氯甲烷層，重復(fù)萃取3次，定容至10 mL，全波長(zhǎng)掃描。同法取1 mL對(duì)照品溶液2份，分別加溴甲酚綠溶液、溴麝香草酚藍(lán)溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。同法取1 mL三氯甲烷制備空白對(duì)照。由圖1可知，供試品溶液、對(duì)照品溶液在采用溴甲酚綠溶液、溴麝香草酚藍(lán)溶液作為酸性染料時(shí)，均在413 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）最大，且A溴麝香草酚藍(lán)>A溴甲酚綠，故確定測(cè)定波長(zhǎng)為413 nm，酸性染料為溴麝香草酚藍(lán)，溴麝香草酚藍(lán)酸性染料用量分別為3、4、5、6 mL。考察溴麝香草酚藍(lán)酸性染料用量對(duì)紫外吸收的影響，結(jié)果表明，A5 mL>A6 mL>A4 mL>A3 mL，故確定酸性染料溴麝香草酚藍(lán)的用量為5 mL。

2.4 緩沖液類型、pH及用量的選擇

以5 mL溴麝香草酚藍(lán)為酸性染料，分別考察了鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液和乙酸-乙酸鈉緩沖液對(duì)供試品溶液及對(duì)照品溶液的紫外吸收影響，結(jié)果表明，A乙酸-乙酸鈉緩沖液>A鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液，故確定緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液。以乙酸-乙酸鈉為緩沖液，5 mL溴麝香草酚藍(lán)為酸性染料，乙酸-乙酸鈉緩沖液pH分別為4.2、4.6、5.0、5.4。考察乙酸-乙酸鈉緩沖液pH對(duì)紫外吸收的影響，結(jié)果表明ApH 5.0＞ApH 5.4＞ApH 4.2＞ApH 4.6，故確定乙酸-乙酸鈉緩沖液pH為5.0。考察緩沖液用量分別為5、6、7、8、9 mL時(shí)對(duì)紫外吸收的影響，結(jié)果表明，A8 mL>A7 mL>A6 mL>A9 mL>A5 mL，故確定乙酸-乙酸鈉緩沖液的用量為8 mL。

2.5 試劑加入順序的選擇

以8 mL pH 5.0乙酸-乙酸鈉為緩沖液，5 mL溴麝香草酚藍(lán)為酸性染料，試劑加入順序分別為供試品-緩沖液-酸性染料-三氯甲烷、供試品-酸性染料-緩沖液-三氯甲烷、緩沖液-供試品-酸性染料-三氯甲烷、緩沖液-酸性染料-供試品-三氯甲烷、酸性染料-緩沖液-供試品-三氯甲烷和酸性染料-供試品-緩沖液-三氯甲烷。考察試劑加入順序?qū)ψ贤馕盏挠绊懀Y(jié)果表明，A緩沖液-酸性染料-供試品-三氯甲烷>A酸性染料-緩沖液-供試品-三氯甲烷> A酸性染料-供試品-緩沖液-三氯甲烷>A緩沖液-供試品-酸性染料-三氯甲烷> A供試品-酸性染料-緩沖液-三氯甲烷>A供試品-緩沖液-酸性染料-三氯甲烷，故確定試劑加入順序?yàn)榫彌_液-酸性染料-供試品-三氯甲烷。

2.6 三氯甲烷萃取次數(shù)的選擇

分別考察三氯甲烷（每次4 mL）萃取1、2、3、4次后是否還有紫外吸收，結(jié)果表明萃取1次及2次后的溶液紫外吸收明顯且A1次>A2次，萃取3次及4次后的溶液基本無紫外吸收且二者紫外吸收無明顯差別，故確定三氯甲烷萃取次數(shù)為4次，定容至15 mL。

2.7 測(cè)定方法的確定

取60 mL分液漏斗，依次加入8 mL pH 5.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液、5 mL溴麝香草酚藍(lán)酸性染料、? ?1 mL待測(cè)溶液和4 mL三氯甲烷，振搖5 min，靜置30 min，分取三氯甲烷層，三氯甲烷萃取4次，定容至15 mL，混勻。413 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。取1 mL三氯甲烷進(jìn)行同法操作，制備空白對(duì)照。

2.8 線性關(guān)系的考察

分別配制32、80、160、320、400、800 μg/mL的對(duì)葉百部堿對(duì)照品溶液，按照“2.7”方法在413 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)葉百部堿對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為Y=0.003 7X+0.089（R2=0.995 9），在線性范圍為32～800 μg/mL時(shí)對(duì)葉百部堿對(duì)照品溶液濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.9 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率的考察

精密量取1mL對(duì)葉百部堿對(duì)照品溶液，按照“2.7”方法重復(fù)測(cè)定6次，吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.21% ，表明儀器的精密度良好。分別精密稱取6份對(duì)葉百部粉末樣品，每份1.000 0g，按照“2.2”方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.7”方法操作，同時(shí)制備相應(yīng)空白，測(cè)定吸光度，樣品中總生物堿的平均含量為2.29 mg/g，RSD為1.94%，表明該方法的重復(fù)性良好。精密稱取1份對(duì)葉百部粉末樣品1.000 0 g，按照“2.2”方法制備供試品溶液，按照“2.7”方法每隔1 h測(cè)定其吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，吸光度的RSD為2.31%，表明溶液在5 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取6份已知含量的對(duì)葉百部樣品溶液25 mL，加入對(duì)葉百部堿對(duì)照品溶液，配成50 mL加標(biāo)溶液。按照“2.7”方法操作，同時(shí)制備相應(yīng)空白溶液，測(cè)定吸光度，平均加樣回收率為101.23%，平均加樣回收率的RSD為2.63%，表明該方法的回收率良好。

3 對(duì)葉百部樣品總生物堿含量的測(cè)定

分別取1年生和2年生的對(duì)葉百部11批和10批樣品粉末，各平行制備3份，每份1.000 0 g，精密量取。按照“2.2”方法制備供試品溶液，按照“2.7”方法操作，在413 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度，測(cè)定不同發(fā)育時(shí)期對(duì)葉百部樣品的吸光度，取平均值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總生物堿含量，如表1所示。1年生對(duì)葉百部總生物堿含量為1.87～4.55 mg/g；2年生對(duì)葉百部總生物堿含量為4.52～9.63 mg/g。

4 小結(jié)與討論

百部藥材及其浸膏總生物堿含量常見的測(cè)定方法有酸性染料比色法［9-11］、響應(yīng)面分析法［12］等，其中酸性染料比色法在其他中藥材總生物堿含量測(cè)定上也有應(yīng)用，具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)［13-15］。對(duì)葉百部中生物堿成分豐富，主要包括對(duì)葉百部堿、新對(duì)葉百部堿、金剛大堿、百部新堿等［16］，廣西對(duì)葉百部的主要生物堿成分為百部新堿，其次為對(duì)葉百部堿和金剛大堿，新對(duì)葉百部堿較少見［17］。對(duì)葉百部生物堿成分有差異，選擇單一成分作為含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)存在一定誤差，生物堿作為對(duì)葉百部的主要活性成分，以總生物堿成分作為含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)具有一定的合理性及可行性。

采用酸性染料比色法測(cè)定不同發(fā)育時(shí)期對(duì)葉百部的總生物堿含量，考察已報(bào)導(dǎo)的酸性染料比色法后，優(yōu)化了測(cè)定條件。本研究對(duì)常用酸性染料溴麝香草酚藍(lán)和溴甲酚綠進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)葉百部待測(cè)樣品及其對(duì)照品經(jīng)酸性染料溴麝香草酚藍(lán)染色后得到的有色溶液在413 nm處吸光度最大，故選擇溴麝香草酚藍(lán)為酸性染料，413 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。為了避免酸性染料因未完全溶解而影響試驗(yàn)結(jié)果，需對(duì)酸性染料進(jìn)行15 min的超聲波處理。此外，酸性染料比色法的影響因素還有緩沖液的種類、緩沖液的pH及用量、酸性染料用量、試劑加入順序以及三氯甲烷萃取次數(shù)等。三氯甲烷萃取第3次時(shí)已基本無紫外吸收，但定容時(shí)為了避免測(cè)定結(jié)果因萃取不完全而導(dǎo)致誤差，應(yīng)多萃取1次并以此次進(jìn)行定容，故選擇三氯甲烷萃取4次，定容至15 mL。方法考察及測(cè)定時(shí)空白對(duì)照溶液的制備需按照待測(cè)液進(jìn)行同法操作。本研究進(jìn)行了精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率的考察，結(jié)果表明，酸性染料比色法精密度較好，系統(tǒng)誤差在允許范圍之內(nèi)，測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確度較高，可靠性較強(qiáng)。

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