豬NARS2基因變異與硒都黑豬胴體和肉質性狀的關聯分析

喬同同 張宇 李梓芃 喬木 秦振洋 彭先文 吳俊靜

摘要：在硒都黑豬群體中發現豬NARS2基因第9內含子中存在g.101284 C>T突變位點，采用PCR產物直接測序法進行基因分型后，與23個胴體和肉質類性狀表型進行關聯分析。結果表明，NASR2基因g.101284 C>T位點極顯著影響豬胴體皮厚（P<0.01），且顯著影響豬肉眼肌面積、滴水損失48 h和肌內脂肪含量性狀（P<0.05）。CC基因型個體皮厚極顯著低于TT基因型個體（P<0.01）；CC基因型個體滴水損失48 h和肌內脂肪含量顯著高于其他基因型個體，而TT基因型個體胴體眼肌面積顯著小于其他基因型個體（P<0.05）。而這4個性狀中，除皮厚與眼肌面積性狀不存在顯著相關外，其他各性狀之間存在一定程度的相關性。其中，滴水損失48 h與肌內脂肪含量性狀相關性最高（r2=0.882，P<0.01）。因此，該標記在育種應用中應當結合育種目標合理利用，針對不同主選性狀，選留或淘汰不同基因型個體。

關鍵詞：硒都黑豬；胴體性狀；肉質性狀；NARS2基因；關聯分析

中圖分類號：S828；S813? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）12-0195-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.034 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Association analysis of NARS2 gene variation and carcass and meat quality traits

in selenium black pig

QIAO Tong-tong， ZHANG Yu， LI Zi-peng， QIAO Mu， QIN Zhen-yang， PENG Xian-wen， WU Jun-jing

（Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan? 430064，China）

Abstract： A g.101284 C>T mutation site was found in intron 9 of the NARS2 gene in the selenium black pig population. After genotyping using PCR product direct sequencing， association analysis was conducted with 23 phenotypes of carcass and meat quality traits.The results showed that the g.101284 C>T locus of the NASR2 gene significantly affected the skin thickness of pig carcasses （P<0.01）， and significantly affected the eye muscle area， drip loss for 48 hours， and intramuscular fat content traits of pork （P<0.05）. The skin thickness of individuals with CC genotype was significantly lower than that of individuals with TT genotype （P<0.01）；the 48 hours drip loss and intramuscular fat content of individuals with CC genotype were significantly higher than those with other genotypes， while the carcass eye muscle area of individuals with TT genotype was significantly smaller than that of individuals with other genotypes （P<0.05）. Among these four personality traits， there was a certain degree of correlation between other traits except for skin thickness and eye muscle area traits， which were not significantly correlated. Among them， the 48 hours drip loss had the highest correlation with intramuscular fat content traits （r2=0.882， P<0.01）. Therefore， this marker should be reasonably utilized in breeding applications in conjunction with breeding objectives， and individuals of different genotypes should be selected or eliminated for different main selected traits.

Key words： selenium black pig； carcass traits； meat quality traits； NARS2 gene； association analysis

中國是全球豬肉生產大國，無論是養殖規模還是消費量都居于世界前列。胴體和肉質是豬育種行業中的重要經濟特征，胴體質量及豬肉品質的高低直接影響著養殖場的生產和經濟效益。胴體和肉質的大多數性狀屬于中高等遺傳力［1-3］，如肌內脂肪含量性狀遺傳力可達0.49～0.86［4］。目前，人們對影響肉質特征的關鍵基因了解仍然不足。因此，尋找控制豬肉質量的關鍵分子遺傳標記，并將其應用于分子標記輔助育種，對于提高豬的肉質特征、增加經濟效益具有重要意義。

線粒體轉運核糖核酸合成酶2（NARS2）是一種酰基tRNA合成酶，其在細胞的蛋白質合成過程中起著重要作用。在人類相關研究報道中發現，NARS2基因變異在聯合氧化磷酸化缺陷24（OXPD24）中引起神經退行性和肌病綜合征［5，6］，與非綜合征性常染色體隱性耳聾94（DFNB94）［7］、利氏綜合征［8］等疾病相關。而有關該基因在動物中的研究報道較少。

硒都黑豬是以恩施黑豬、梅山豬、湖北白豬等為基礎，歷經12年培育而成的黑豬新品種。課題組前期利用基因組重測序技術對比分析了硒都黑豬肌內脂肪含量極端差異個體的基因組群體分化信號，發現NARS2基因在高、低肌內脂肪組中存在顯著分化位點。因此，本研究擴增了豬NARS2基因序列，利用該序列進行遺傳變異位點的篩選鑒定及與胴體和肉質性狀進行關聯分析，以期獲得與豬肉質性狀相關的新分子育種標記。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

275頭健康硒都黑豬飼養于湖北華健硒園農牧科技有限公司硒都黑豬育種基地，在體重達100 kg左右時，進行屠宰測定，采集背最長肌（背肌）組織黃豆大小樣本，置于2 mL凍存管，液氮保存。同時收集并記錄屠宰日齡、屠宰日期、屠宰體重、系譜等基本信息。隨機選取少量個體，采集腰肌、比目魚肌、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背脂、腹脂、結腸、回腸、盲腸等組織黃豆大小樣本，置于2 mL凍存管，液氮保存。

1.2 胴體和肉質性狀檢測

屠宰率、胴體長、平均背膘厚、皮厚、肋骨對數、眼肌面積、腿臀比例、皮率、肥肉率、瘦肉率、骨率等胴體性狀按照國家行業標準NY/T 825—2004《瘦肉型豬胴體性狀測定技術規范》規定方法測定。肉色評分1、肉色評分24、肌肉色值L1、肌肉色值L24、大理石紋評分、pH1、滴水損失48 h、系水力、肌內脂肪、水分、嫩度等肉質性狀表型按照國家行業標準NY/T 821—2019《豬肉品質測定技術規程》規定方法測定。

1.3 基因組DNA和RNA提取

基因組DNA的提取采用北京百泰克生物技術有限公司生產的基因組DNA提取試劑盒（按該試劑盒說明書進行操作）提取；組織總RNA利用Invitrogen TRIzol和氯仿提取。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸質量，并用Nanodrop 2000型分光光度計檢測核酸濃度。

1.4 豬NARS2基因熒光定量檢測

取1 μg的RNA樣本，利用Thermo ScientificTM RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis試劑盒反轉錄cDNA。采用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix試劑盒，使用QuantStudio 6熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司）進行qPCR檢測。以β-actin基因為內參，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，每組試驗做3個平行，每個試驗重復3次。實時熒光定量PCR引物信息見表1。采用20 μL反應體系，反應程序為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，循環40次；熔解曲線：95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min，96 ℃ 1 s。

1.5 豬NARS2基因多態性檢測

以40頭硒都黑豬的DNA樣本混合池為模板，進行豬NARS2基因第9內含子片段序列PCR擴增，上游引物：5′-TGTGCATTTATGTGTATTTCGGGG-3′，下游引物：5′-GGTCAAATGACGATGCTGCT-3′。PCR反應體系（50 μL）：100 ng模板DNA、10×Buffer （含Mg2+） 4 μL、上下游引物各0.5 μmol/L、2.5 μmol/L dNTPs、1 U Taq DNA聚合酶。PCR運行程序：95 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，65～55 ℃退火40 s（每個循環降低0.5 ℃），72 ℃延伸60 s，共20個循環；94 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共15個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用Gel Extraction Kit試劑盒進行純化。純化產物直接送到北京奧科公司進行DNA測序，對比篩選基因變異位點。

1.6 基因分型

利用上述引物分別擴增硒都黑豬DNA，PCR產物經Sanger測序分析后進行基因分型。

1.7 統計分析

采用SPSS 26.0統計軟件中一般線性模型GLM進行基因型與性狀表型值的關聯分析。一般線性模型GLM的表達式如下：

Yijklm=μ+Gi+Aj+Xk+Sl+eijklm （1）

式中，Yijklm表示性狀表型值；μ表示群體均值；Gi表示基因型效應；Aj表示年季效應；Xk表示性別效應；Sl表示父本效應；eijklm表示隨機誤差，結果以最小二乘均值±標準誤表示。

利用SPSS 26.0統計軟件中的相關分析模型計算表型性狀的皮爾遜相關系數。P<0.05判定為顯著差異，P<0.01判定為極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 豬NARS2基因組織表達譜

利用qPCR方法檢測了豬NARS2基因組織表達譜情況，發現該基因在肌肉、脂肪、各內臟器官等組織中廣泛表達，在肝臟組織中表達量最高，其次是背肌、腰肌、比目魚肌等肌肉組織，在盲腸組織中表達量最低（圖1）。

2.2 豬NARS2基因多態性檢測結果

通過對40個硒都黑豬DNA混合樣本池進行NARS2基因片段擴增測序，發現豬NARS2基因第9內含子中存在1個單堿基突變位點，即位于該基因序列第101 359 bp處的C>T堿基突變（g.101284 C>T），如圖2所示。

2.3 豬NARS2基因變異與胴體和肉質性狀的關聯分析

將275頭硒都黑豬NARS2基因g.101284 C>T基因型與其胴體和肉質等23個表型性狀進行關聯分析，結果如表2所示。NASR2基因g.101284 C>T位點極顯著影響豬胴體皮厚，CC基因型個體皮厚極顯著低于TT基因型個體（P<0.01）。同時，該位點還顯著影響豬肉眼肌面積、滴水損失48 h和肌內脂肪含量性狀，CC基因型個體48 h滴水損失和肌內脂肪含量顯著高于其他基因型個體，而TT基因型個體胴體眼肌面積顯著小于其他基因型個體（P<0.05）。

2.4 顯著相關性狀表型值相關性分析

由于豬NARS2基因g.101284 C>T突變顯著影響多個胴體和肉質性狀，因此將該位點顯著影響的皮厚、眼肌面積、滴水損失48 h、肌內脂肪含量4個性狀的表型值相關性進行進一步分析，結果如表3所示。滴水損失48 h和肌內脂肪含量分別與皮厚存在顯著負相關（P<0.05）；滴水損失48 h和肌內脂肪含量分別與眼肌面積存在極顯著負相關（P<0.01）；滴水損失48 h與肌內脂肪含量存在極顯著正相關（P<0.01）。

3 小結與討論

氨基酰化反應主要由氨基酰化tRNA合成酶家族酶催化［9］，參與生物蛋白質合成。NARS2最先在酵母中被發現［10］，屬于II類氨基酰基-tRNA合成酶，是一種由細胞核編碼，但是可以到達線粒體發揮功能的線粒體型天冬酰胺酰tRNA合成酶［11］。研究發現NARS2基因突變可導致tRNA天冬氨酸水平降低，線粒體復合物I、III和IV的活性受損，并對成纖維細胞的耗氧率產生負面影響［12］。在人類研究中，發現該基因突變與嬰兒癲癇發作、生長發育遲緩、智力發育遲緩、肌張力低下和聽力障礙、腎臟疾病或肝臟異常等病例相關［6，12-14］。在動物中，有關NARS2基因的研究較少，本研究探討了豬NARS2基因對性狀表型的影響。發現豬NARS2基因在豬的各內臟器官、肌肉、脂肪組織中廣泛表達，與其廣泛參與蛋白質合成過程有關。在硒都黑豬群體中，豬NARS2基因外顯子區域并未找到關鍵突變位點，這也可能是因為外顯子突變對蛋白質表達影響較大，會導致個體發育不正常，因而在群體選育中逐漸被自然淘汰。

內含子序列占哺乳動物基因組的24%，雖然其不編碼蛋白質，但與編碼序列一起轉錄，共剪接形成成熟mRNA后，內含子才與mRNA脫離［15］。內含子作為pre-mRNA被剪接后的產物，具有復雜多樣的生物學功能。例如，內含子參與可變剪接的調控，可變剪接增加了蛋白質的多樣性［16，17］；可通過提高轉錄速率、介導增強效應、介導mRNA降解、提高mRNA翻譯速率等途徑促進基因表達［15］。有研究證實內含子變異會導致表型性狀發生變化，例如，人類研究報道發現內含子變異與苯丙酮尿癥、癌癥等疾病密切相關［18-20］；湖羊STAT5a基因第10內含子變異影響泌乳性狀［21］；松遼黑豬KPNA7基因內含子變異影響繁殖性狀［22］。

本研究在豬NASR2基因第9內含子中鑒定到1個單堿基突變位點g.101284 C>T，其顯著影響皮厚、豬肉眼肌面積、滴水損失48 h和肌內脂肪含量4個胴體和肉質性狀。而這4個性狀中，除皮厚與眼肌面積性狀不存在顯著相關外，其他各性狀之間存在一定程度的相關性，有的是正相關，而有的是負相關。其中滴水損失48 h與肌內脂肪含量性狀相關性最高（r2=0.882，P<0.01）。g.101284 C>T位點對不同性狀影響趨勢存在一定差異。例如，CC基因型個體皮厚極顯著低于TT基因型個體（P<0.01）；CC基因型個體滴水損失48 h和肌內脂肪含量顯著高于其他基因型個體，而TT基因型個體胴體眼肌面積顯著小于其他基因型個體（P<0.05）。因此，該標記在育種應用中應結合該育種群體的既定育種目標及主選性狀合理利用。例如，若要選擇眼肌面積大且肌內脂肪含量高的群體，應予以保留攜帶CC基因型個體；若要選擇滴水損失48 h小的群體，應淘汰攜帶CC基因型的個體。

綜上，本研究鑒定了豬NASR2基因第9內含子中一個顯著影響豬胴體和肉質性狀的新育種標記，今后將對其具體作用機制開展更深入的研究。

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