苯磺酸氨氯地平片體外溶出度一致性評(píng)價(jià)及體內(nèi)生物等效性研究

池王胄 胡旭華

（上海天慈國(guó)際藥業(yè)有限公司 上海 201315）

苯磺酸氨氯地平片屬于外周動(dòng)脈血管擴(kuò)張劑，適用于高血壓患者（單獨(dú)用藥或與其他抗高血壓藥物合用）和慢性穩(wěn)定性心絞痛及變異型心絞痛患者（單獨(dú)用藥或與其他抗心絞痛藥物合用），機(jī)理是作用在血管平滑肌來降低外周血管阻力和血壓[1-2]。根據(jù)2016年《國(guó)務(wù)院辦公廳關(guān)于開展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)的意見》、2015年《國(guó)務(wù)院關(guān)于改革藥品醫(yī)療器械審評(píng)審批制度的意見》的文件規(guī)定，為有利于提升藥品質(zhì)量，促進(jìn)仿制藥與原研藥的相互替代，對(duì)已上市品種苯磺酸氨氯地平片進(jìn)行質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)。現(xiàn)行生產(chǎn)的苯磺酸氨氯地平片采用濕法制粒壓片工藝制備，操作繁瑣，且活性成分苯磺酸氨氯地平對(duì)濕熱敏感[3]，采用粉末直壓工藝減少原料藥因濕度而降解，同時(shí)也簡(jiǎn)化了工藝流程，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。本研究以Pfizer Labs生產(chǎn)的苯磺酸氨氯地平片（Norvasc）為參比制劑，進(jìn)行體內(nèi)外的質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)，其中體外評(píng)價(jià)指標(biāo)是溶出曲線相似性f2或累積溶出度，體內(nèi)評(píng)價(jià)指標(biāo)通過生物等效性（BE）[4]評(píng)價(jià)，以此為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

苯磺酸氨氯地平片受試制劑（規(guī)格5 mg，批號(hào)170815511、170818511、170821511，辰欣藥業(yè)股份有限公司）；苯磺酸氨氯地平片參比制劑（規(guī)格5 mg，批號(hào)R93379，Pfizer Labs）。

1260 VWD高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；API 4000串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司）；RC8MD溶出儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；MS105DU電子天平（美國(guó)梅特勒托利多公司）；MIKRO22R冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）。

1.2 體外溶出度方法的建立

1.2.1 方法的選擇

苯磺酸氨氯地平片溶出度方法在中國(guó)藥典[5]、美國(guó)藥典[6]、日本橙皮書[7]均有收載，都采用了槳法，故本品溶出曲線測(cè)定選用槳法操作。

1.2.2 溶出介質(zhì)體積的選擇

參照日本生物等效性溶出方法，選用900 mL作為介質(zhì)體積進(jìn)行溶出曲線測(cè)定。

1.2.3 轉(zhuǎn)速的選擇

已收錄的溶出度標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)速為75 r/min[8]，本研究采用50 r/min[9]，相較于75 r/min條件更為苛刻。

1.2.4 取樣時(shí)間的選擇

如果您有遺尿的寶寶，首先應(yīng)調(diào)整的是自己的心態(tài)。有些媽媽會(huì)過度保護(hù)寶寶，即使就醫(yī)，也是偷偷告訴醫(yī)生“我家孩子尿床”；也有些媽媽總是當(dāng)著外人的面責(zé)罵自家孩子尿床。

根據(jù)指導(dǎo)原則，按照表1設(shè)定的取樣時(shí)間進(jìn)行取樣、測(cè)定。

表1 各溶出介質(zhì)取樣時(shí)間

1.3 體內(nèi)生物等效性研究

1.3.1 臨床研究方法

本體內(nèi)生物等效性研究是委托上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院進(jìn)行，試驗(yàn)過程嚴(yán)格按照GCP及相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。研究采取單中心、開放、隨機(jī)、單次口服給藥、兩制劑、兩周期交叉、空腹/餐后條件下的生物等效性試驗(yàn)。受試者在每周期給藥前0 h至給藥后72 h間共15個(gè)時(shí)間點(diǎn)采血，每次采集靜脈血3 mL，置于有相應(yīng)標(biāo)記的肝素化試管中，分離血漿，用于測(cè)定氨氯地平片的血藥濃度以評(píng)估其生物等效性。

1.3.2 血樣測(cè)定方法

1）液質(zhì)聯(lián)用色譜條件 采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，Acquity UPLC?HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）色譜柱；流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈溶液；柱溫40 ℃；流速0.6 mL/min；選用電噴霧離子源，在正離子模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的質(zhì)譜掃描方式。

2）血樣處理 取血漿加入適量?jī)?nèi)標(biāo)工作液、標(biāo)準(zhǔn)添加工作液/含40%乙腈水溶液，混旋10 s，加甲基叔丁基醚1 mL振蕩后，于1 500 r/min、4 ℃離心10 min，吸取全部上清液吹干，加入50%甲醇的水溶液，振蕩后進(jìn)樣分析。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析均采用SAS 9.4 軟件，采用非房室模型藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù), 其中Cmax、AUC0～72h為主要參數(shù)、Tmax、t1/2、λz為次要參數(shù)。本試驗(yàn)為等效性試驗(yàn)，將藥動(dòng)學(xué)主要評(píng)價(jià)參數(shù)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析(ANOVA)，計(jì)算幾何均值比(GMR)、90% CI。

2 結(jié)果

2.1 體外溶出曲線測(cè)定方法的方法學(xué)驗(yàn)證

結(jié)果顯示，空白溶劑、空白輔料、苯磺酸不干擾氨氯地平含量測(cè)定；系統(tǒng)適用性溶液中，雜質(zhì)D與主峰分離度均＞4.5，說明系統(tǒng)適用性良好（圖1）。

圖1 體外溶出測(cè)試典型色譜圖

2.1.2 濾膜吸附

結(jié)果顯示，使用孔徑為0.45 μm的水系微孔濾膜時(shí)，棄去濾液2～4 mL時(shí)回收率在98.0%～102.0%，可直接取濾液測(cè)定。

2.1.3 線性和范圍

線性驗(yàn)證范圍至少為供試品溶液濃度的10%、20%、50%、80%、100%、120%，即每1 mL約含氨氯地平0.5～6 μg。回歸分析結(jié)果表明，氨氯地平在各溶出介質(zhì)中濃度在10%～120%范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程分別為：pH 1.2介質(zhì)中Y=12.65X－0.035 7（r=0.999）；pH 4.5介質(zhì)中Y=13.046X－0.203 2（r=0.999）；pH 6.8介質(zhì)中Y=12.649X+0.322 7（r=0.999）；水介質(zhì)中Y=12.756X－0.400 1（r=0.999）。

2.1.4 供試品溶液穩(wěn)定性

結(jié)果顯示，苯磺酸氨氯地平片在不同介質(zhì)中室溫放置4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

結(jié)果顯示，苯磺酸氨氯地平片在不同介質(zhì)中回收率良好，平均回收率（n=9）在98.9%～100.1%范圍內(nèi)，RSD＜2.0%。

2.2 體外溶出曲線的相似性

對(duì)3批受試制劑與一批參比制劑采用非模型依賴法中的相似因子（f2）法進(jìn)行了加速穩(wěn)定性溶出曲線相似性的比較，通常，當(dāng)兩條溶出曲線f2數(shù)值不小于50或15 min累積溶出度大于85%時(shí)，可認(rèn)為溶出曲線相似。結(jié)果顯示，苯磺酸氨氯地平片在pH 4.5、pH 6.8和水介質(zhì)中溶出相似因子f2分別為60、80、54；在pH 1.2介質(zhì)中15 min累積溶出度均大于85%，表明其在四種介質(zhì)中的溶出行為均相似（圖2）。

圖2 苯磺酸氨氯地平片在不同介質(zhì)中的體外溶出曲線（n=12）

2.3 體內(nèi)生物等效性研究

2.3.1 血樣方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

最低定量下限質(zhì)控、低、中、高濃度質(zhì)控樣品的批間準(zhǔn)確度偏差在?7.474%～3.099%之間；低、中、高濃度質(zhì)控樣品提取回收率均為76.30%、精密度范圍為4.037%～4.533% CV（變異系數(shù)）、準(zhǔn)確度偏差范圍為3.442%～5.406%。

2.3.2 生物等效性結(jié)果

空腹、餐后試驗(yàn)受試制劑與參比制劑Cmax的GMR分別為100.72%、97.21%；受試制劑與參比制劑AUC0～72h的GMR為100.38%、100.24%；90% CI均在92%～104%內(nèi)；均在NMPA《以藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為終點(diǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)的化學(xué)藥物仿制藥人體生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》以及本次試驗(yàn)方案規(guī)定的生物等效范圍之內(nèi)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，兩個(gè)給藥序列之間、兩周期之間，兩制劑之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2，P＞0.05）。

表2 空腹/餐后主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)幾何均值比值評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論

本品原工藝為濕法制粒法，改變后生產(chǎn)工藝為粉末直壓法，該工藝是結(jié)合改變后的處方及對(duì)參比制劑進(jìn)行分析及試驗(yàn)后確定。采用高效液相法經(jīng)過系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，苯磺酸氨氯地平片受試制劑與參比制劑在各溶出介質(zhì)中的溶出曲線相似性均較好，表明體外溶出基本一致；在臨床60個(gè)受試者參加的生物等效性研究結(jié)果也表明受試制劑與參比制劑沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明受試制劑產(chǎn)品質(zhì)量與參比制劑具有一致性，且粉末直壓法工藝簡(jiǎn)單，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。

致謝：非常感謝上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院在苯磺酸氨氯地平片體內(nèi)生物等效性研究臨床試驗(yàn)中所做的工作。