黃連總生物堿通過調(diào)控CaMKII減輕局灶性腦缺血（MCAO）大鼠神經(jīng)功能損傷的研究

李向陽 張曉敏 梁廣霞 王琳 付衛(wèi)旭 牛憲立

基金項目：

珠海市衛(wèi)生健康局珠海市醫(yī)學(xué)科研基金項目（ZH3310200016PJL）；2021年貴州省衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)基金項目（gzwkj2021-011號）；貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究基金項目（QZYY-2022-006號）；遵義醫(yī)科大學(xué)博士科研啟動基金項目（F-ZH-011）。

作者簡介：

李向陽（1986—），男，漢族，本科，主治醫(yī)師，研究方向為心血管及腫瘤醫(yī)學(xué)。E-mail：416254544@qq.com

通信作者：

牛憲立（1975—），男，漢族，博士，高級實驗師，研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：nxl2016gd@163.com

【摘? 要】

目的：研究黃連總生物堿調(diào)節(jié)鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKII）對局灶性腦缺血（MCAO）大鼠神經(jīng)功能損傷后的影響。方法：隨機將50只雄性SD大鼠分為假手術(shù)組、對照組、黃連總生物堿（高濃度、中濃度和低濃度）治療組，采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血（MCAO）模型，假手術(shù)組不給予線栓處理，術(shù)后對大鼠進行神經(jīng)功能評分。各治療組給予黃連總生物堿灌胃治療，按照人與大鼠等效劑量關(guān)系折算，假手術(shù)組用等量生理鹽水灌胃；用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠腦組織中CaMKII的含量；采用BCA法和WST-1法分別測超氧化物歧化酶（SOD） 的活力和丙二醛（MDA）的含量；制備腦組織病理切片，HE染色觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：與假手組相比，模型組評分和腦梗死體積明顯升高，各個實驗組經(jīng)過黃連治療后神經(jīng)功能評分和腦梗死體積都有明顯降低（P＜0.05）。模型組與假手術(shù)組的CaMKII的含量相比明顯升高（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織損傷程度加重，外周血氧化因子SOD活性降低，MDA含量升高；黃連治療后，低、中、高劑量組SOD水平升高，MDA水平降低。HE染色觀察腦組織病變程度，給藥組大鼠的病變程度較模型組有明顯改善。結(jié)論：黃連總生物堿通過調(diào)節(jié)腦缺血大鼠模型中CaMKII活性的影響，對海馬細胞的神經(jīng)損傷有一定的恢復(fù)和治療作用。

【關(guān)鍵詞】

黃連總生物堿；腦缺血再灌注；鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II

【中圖分類號】R285.5??? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）22-0010-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.22.zgmzmjyyzz202322004

Study on Total Alkaloids of Coptis Coptidis Attenuates Neurological Injury in Focal

Cerebral Ischemia （MCAO） Rats by Regulating CaMKII

LI Xiangyang1? ZHANG Xiaomin1? LIANG Guangxia1? WANG Lin1? FU Weixu1? NIU Xianli2*

1.Department of? Oncology，F(xiàn)ifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Zhuhai 519100，China;

2.Department of? Biochemistry， Zhuhai Campus of Zunyi Medical University， Zhuhai 519041，China

Abstract：

Objective To investigate the effect of total alkaloid-regulated calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ （CaMKII） from Coptis coptidis on neurological injury after focal cerebral ischemia （MCAO） in rats. Methods Fifty male SD rats were randomly divided into sham operation group， control group， and total alkaloids of Coptis coptidis （high concentration， medium concentration， and low concentration） treatment group. Focal cerebral ischemia （MCAO） model was established by suture method. The rats in sham operation group were not given suture treatment. The total alkaloids of Coptis coptidis were given to each treatment group by gavage according to the equivalent dose relationship between human and rats. The sham operation group was given the same amount of normal saline. The content of CaMKII in rat brain was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The activity of superoxide dismutase （SOD） and the content of malondialdehyde （MDA） were measured by BCA method and WST-1 method， respectively. The pathological sections of brain tissue were prepared and the morphological changes were observed by HE staining. Results Compared with the sham hand group， the score and infarct volume of the model group were significantly increased， and the neurological function score and infarct volume of each experimental group were significantly decreased after coptis coptidis treatment （P＜0.05）. The content of CaMKII in the model group was significantly higher than that in the sham group （P＜0.01）. Compared with the sham operation group， the degree of brain tissue injury was aggravated， the activity of SOD in peripheral blood was decreased， and the content of MDA was increased in the model group. After treatment with Coptis coptidis， SOD level increased and MDA level decreased in low， medium and high dose groups. The degree of brain tissue lesions was observed， and the degree of lesions in the drug group was significantly improved compared with that in the model group. Conclusion Total alkaloids of Coptis coptidis have a certain recovery and therapeutic effect on the nerve injury of hippocampal cells by regulating the content and phosphorylation of CaMKII in the rat model of cerebral ischemia.

Keywords：

Coptis Chinensis；Cerebral Ischemia-reperfusion；Calcium/Calmodulin Dependent Protein Kinase II

腦血管疾病是因為腦部血液循環(huán)故障引起的，造成對腦組織損傷的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其嚴重危害了人們健康，臨床上主要表現(xiàn)為急性腦血管病，急性腦血管病可分為出血性、缺血性兩種，其中缺血性腦血管病約占所有腦血管病的70%～80%［1］。Ca2+/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaM KinaseⅡ）在腦中含量十分豐富且對中樞正常神經(jīng)元活動至關(guān)重要。短暫腦缺血即可誘發(fā)缺血敏感組織該酶活性顯著抑制， 再灌注后其活性逐漸恢復(fù)［2］。大量研究［3］表明， Ca2+/CaM Ⅱ活性抑制與缺血性遲發(fā)性神經(jīng)元死亡（DND） 關(guān)系密切。黃連（Coptis chinensis Franch）為傳統(tǒng)中藥，黃連素是黃連的主要成分，具有廣泛的藥理作用［4-5］。有研究［6-7］表明，在個體和細胞水平上都可以保護和修復(fù)損傷的神經(jīng)組織和細胞。黃連可以顯著改善大鼠腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)功能，減小腦梗死灶體積，具有抗腦缺血/再灌注損傷的作用［8-10］。因此，本研究通過建立大鼠MCAO模型，檢測黃連對大鼠腦缺血再灌注模型中CaMKII含量的影響，探討黃連保護缺血性腦損傷的作用機制，為黃連在腦缺血疾病上的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 實驗動物? SPF級健康成年SD雄性大鼠，6月齡，體重約220 g，由珠海市百試通生物科技公司提供（許可證號：SCXK［粵］2020-0051）。

1.2? 腦缺血模型的制備? 大鼠麻醉前禁食8 h，自由飲水，腹腔注射10%的水合氯醛0.35 mL/100 g進行麻醉后，依據(jù)參考文獻［15］，對大鼠頸部總動脈進行結(jié)扎，構(gòu)建腦缺血模型。

1.3? 實驗組動物神經(jīng)功能評分? 依照Longa 5等制定的評分標準，對模型大鼠進行神經(jīng)功能評分，從而根據(jù)實驗需要選擇符合要求的模型大鼠。依照Longa的5分法評分標準： 0分無明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀；1～4分為有效模型，1分為提尾時不能完全伸展前爪，2分行走時向左右側(cè)旋轉(zhuǎn)，3分為行走時向左右側(cè)傾倒，4分不能自由行走。積分越高說明動物行為障礙越嚴重。評分標準見表1。

1.4? 實驗分組與處理? 將50只的SD大鼠隨機分成5組，每組10只。黃連總生物堿（低濃度2.5 g/L、中濃度5.0 g/L和高濃度10.0 g/L）治療組、模型組、假手術(shù)組，治療組用黃連總生物堿灌胃，對照組和假手術(shù)組用等量生理鹽水灌胃。按照人與大鼠等效劑量關(guān)系折算，每只大鼠1 d灌胃兩次，每次2 mL，連續(xù)灌胃7 d。在最后1次給藥12 h之后，對大鼠進行頸椎脫臼法處死，取腦并標記保存。

1.5? TTC染色? 在-20 ℃冰箱中取出鼠腦組織，切成2 mm厚度，依次放入十二孔板中，注入2%TTC染液，避光37 ℃恒溫孵育20 min，抽出染色液，4%的多聚甲醛固定24 h，通過Imdge-Pro Plus軟件測量，正常大腦染成鮮紅色，缺血組織出現(xiàn)蒼白色。梗死體積（%）=梗死體積/對側(cè)大腦半球體積×100%。

1.6? 酶聯(lián)免疫? 吸附測定法（ELISA）檢測 CaMKII的含量組織樣品在PBS中勻漿后取上清液，CaMKII的含量采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測。根據(jù)CaMKII檢測試劑盒的操作步驟，封閉后在37 ℃孵箱中孵化1 h。往每孔里加入90 μL的酶作用底物，沖洗、孵育、顯色。酶標儀波長為450 nm測量各孔的吸光度（OD值）。各步驟均嚴格按照試劑盒要求進行。

1.7? 測定SOD活力及MDA含量? 按上述方法制備組織勻漿，嚴格按照SOD檢測試劑盒和MDA檢測試劑盒說明書的操作步驟，酶標儀450 nm讀數(shù)，得到各孔OD值。

1.8? 肝組織病理學(xué)觀察? 將取得的大鼠腦組織用4%多聚甲醛固定12 h、常規(guī)脫水、石蠟浸蠟包埋、定形后制作石蠟切片。按照HE染色試劑盒說明書進行蘇木精-伊紅染色，固定封片后置于光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察神經(jīng)元病理學(xué)變化情況及拍照采圖。

1.9? 統(tǒng)計學(xué)方法? 各指標采用均值加減標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；組內(nèi)兩兩比較采用兩個獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件處理。

2? 結(jié)果

2.1? 各組大鼠神經(jīng)功能損傷評分和腦梗死體積比較? 對SD大鼠MCAO模型構(gòu)建完成后，以Longa的5分法進行神經(jīng)功能評分，與假手組相比，模型組評分和腦梗死體積明顯升高，各個實驗組經(jīng)過黃連治療后神經(jīng)功能評分和腦梗死體積都有明顯的降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。詳見表2。

2.2? 大鼠腦組織勻漿上清液CaMKII的含量測定? 對酶標儀檢測的結(jié)果進行分析，如下表3、圖1所示，其中表3是標準溶液倍比稀釋液的吸光度值及濃度值，圖1是標準溶液倍比稀釋液的曲線圖，X代表濃度值，Y代表吸光度值，該圖的曲線方程為方程：y=（A-D）/［1+（x/C）^B］+D，其中A=5.48892，B=-1.33598，C=6.85143，D=0.08579，r2=0.99982。測出待測樣品的吸光度值，即可通過標準曲線或者標準曲線方程和待測樣品的吸光度值，計算出待測樣品的濃度。

對照組的CaMKII的含量（3.547±0.021）ng/mL與假手術(shù)組（0.526±0.034）ng/mL相比顯著升高（P＜0.01）；治療組中Ca2+/CaMKII的活性［高濃度（0.720±0.044）ng/mL、中濃度（0.863±0.045）ng/mL、低濃度（1.543±0.170）ng/mL］與對照組（3.547±0.021）ng/mL相比明顯降低（P＜0.05），而且黃連總生物堿降低CaMKII的含量具有劑量依賴性，其劑量越高，降低效果越明顯，與假手術(shù)組的值越接近。

2.3? 各組大鼠腦組織勻漿上清液SOD、MDA的含量水平比較? 模型組與與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織損傷程度加重，外周血氧化因子SOD活性降低，MDA含量升高；黃連治療后，低、中、高劑量組氧化因子SOD水平升高，MDA水平降低。

2.4? 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果? 假手術(shù)組腦神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，無明顯異常病變。模型組大鼠腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，細胞間隙增大，有明顯水腫，胞體腫脹變形，胞質(zhì)中空泡增多，神經(jīng)元細胞排列紊亂，核仁變淺或溶解缺失，呈現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變。不同劑量的黃連治療組處理后，各組神經(jīng)元的病變均有明顯的改善，且隨著劑量的增大，改善效果越明顯，神經(jīng)元細胞較為規(guī)則，排列較為有序，水腫減輕。如圖2所示。

3? 討論

腦部血液循環(huán)障礙引起的腦血管性疾病，從而造成腦組織損傷的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其嚴重危害了人們的健康［16］。腦缺氧缺血所引起的損傷除發(fā)生在缺血期外， 更可能發(fā)生在缺血組織再灌注時。后者是由于氧的重新供應(yīng)， 導(dǎo)致氧自由基的產(chǎn)生而引起的［17］。缺氧缺血性腦損傷時， 由于氧自由基的大量產(chǎn)生等導(dǎo)致細胞膜Ca2+ 通道開放，使神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+濃度異常升高，進一步干擾了線粒體氧化磷酸化過程，且大量激活鈣依賴性酶類使細胞膜結(jié)構(gòu)破壞，同時又產(chǎn)生大量氧自由基，加重細胞損害，從而引起海馬細胞的損傷與凋亡。另外被激活的血小板其Ca2+亦增加，可形成微血栓。過量的自由基攻擊位于細胞膜中的多不飽和脂肪酸從而引起脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，并進一步形成MDA等脂質(zhì)過氧化物。測定MDA含量能夠反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映缺血對細胞造成的損傷［18-19］。

鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ），是Ser/Thr蛋白激酶CaMKS家族中多功能的酶成員，在神經(jīng)組織廣泛分布，參與調(diào)節(jié)突觸的轉(zhuǎn)送過程，形成長時程增強 （LTP），是介導(dǎo)記憶和學(xué)習(xí)的關(guān)鍵物質(zhì)。其次，CaMKⅡ還持有調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄等功能。在腦缺血損傷的病理過程中，CaMKⅡ起著格外重要的作用［20-21］。在短暫性腦缺血時，由于鈣離子超載，導(dǎo)致CaMKⅡ含量和磷酸化水平異常升高，致使神經(jīng)組織受到損傷［22-23］。有研究［24-26］表明黃連總生物堿在個體和細胞水平均可保護和修復(fù)損傷的神經(jīng)組織和細胞。從結(jié)果可以看出模型組的CaMKII的含量與假手術(shù)組相比顯著升高（P＜0.01）；治療組中Ca2+/CaMKII的含量與模型組相比明顯降低（P＜0.05），且具有一定劑量依賴性。黃連總生物堿可以通過降低局灶性腦缺血大鼠模型中CaMKII含量的作用， CaMKII含量異常升高導(dǎo)致的一系列神經(jīng)損傷的效果，其機制可能與增加血清SOD活性及降低MDA含量有關(guān)。

綜上所述，黃連總生物堿通過調(diào)控CaMKII可減輕局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能的損傷和對腦梗死體積有明顯地改善作用，減少了神經(jīng)細胞的凋亡，其機制可能與腦缺血過程促進了CaMKII的表達，黃連總生物堿可能調(diào)控了CaMKII的表達從而減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

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（收稿日期：2023-03-02? 編輯：陶希睿）