化瘀止血膠囊的薄層鑒別及急性毒性實驗研究

謝嘉馳 羅黎霞 羅純清 楊寧

基金項目：

2020年湘潭市醫學科研項目（2020xtyx-47）。

作者簡介：

謝嘉馳（1990—），女，漢族，碩士，主管中藥師，研究方向為中藥成分分析及質量檢測。E-mail：784970867@qq.com

通信作者：

楊寧（1980—），男，漢族，本科，主管中藥師，研究方向為中藥鑒定分析。E-mail：505483231@qq.com

【摘? 要】

目的：建立化瘀止血膠囊的薄層鑒別方法，并探討其口服用藥安全性。方法：采用薄層鑒別方法對處方中三七、延胡索進行定性鑒別，采用ICR小鼠經口灌服最大給藥量，進行急性毒性實驗。結果：薄層鑒別分離度效果好，專屬性強；在最大給藥量10.0 g生藥/kg情況下，小鼠無明顯的自主活動異常、未見相關毒性反應以及死亡現象。與空白對照組相比，在給藥當天、給藥前、給藥后第7天、第14天小鼠體重無明顯差異。結論：薄層鑒別操作簡單、方便可行，可作為該制劑質量控制方法之一，且此劑量下口服用藥安全可靠。

【關鍵詞】

化瘀止血膠囊；薄層色譜法；急性毒性實驗；用藥安全

【中圖分類號】R285.5??? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）22-0015-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.22.zgmzmjyyzz202322005

TLC Identification and Acute Toxicity Assay of Huayu Zhixue Capsules

XIE Jiachi? LUO Lixia? LUO Chunqing? YANG Ning*

Department of Pharmacy， Xiangtan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xiangtan 411100，China

Abstract：

Objective To establish a thin layer identification method for Huayu Zhixue Capsule and to explore its safety in oral administration. Methods The thin layer identification method was used to qualitatively identify Panax notoginseng and Corydalis yanhusata in the prescription. The maximum dosage of ICR mice was used for acute toxicity test. Results The thin layer identification was effective and specific. Under the maximum dose of 10.0 g crude drug/kg， no obvious abnormal autonomic activity， related toxic reactions and death were observed in mice. Compared with blank control group， there was no significant difference in body weight on the day of administration， before administration， 7d and 14d after administration. Conclusion Thin layer identification is simple， convenient and feasible， and can be used as one of the quality control methods of this preparation.

Keywords：

Huayu Zhixue Capsules; Thin Layer Chromatography; Acute Toxicity Test; Drug Safety

化瘀止血膠囊處方來源于我院醫生的長期臨床實踐總結，并以協定處方的形式在院內使用多年。由三七、白及、蒲黃炭、延胡索四味藥組成，具有化瘀止血、消腫定痛功效，臨床上治療胃出血疾病效果顯著。為解決湯劑給臨床用藥帶來的不便，我院按照相關技術原則將其開發成院內制劑——化瘀止血膠囊。本課題組前期已對大鼠胃出血模型進行了臨床實驗研究，結果顯示化瘀止血膠囊具有良好的療效。

此外，查閱國內文獻，發現三七制劑可能引發胃腸道刺激［1］、出血、過敏反應［2］，其中以皮膚損害最為常見［3］；延胡索制劑可致嚴重藥物性肝損傷［4-6］，這些制劑的不良反應是影響臨床安全用藥的重要因素。因此，為控制該制劑產品質量，保證臨床療效和安全用藥，本課題對三七、延胡索進行了薄層色譜鑒別，并參照《藥物單次給藥毒性研究技術指導原則》的相關規定［7］，采用大鼠急性毒性試驗探討其安全性［8-9］，為該制劑的質量控制及臨床用藥安全提供理論依據。

1? 儀器與材料

1.1? 儀器? PL2001-L型電子天平（上海甄明科學儀器有限公司）；SKG-01型電熱恒溫鼓風干燥箱（湖北省黃石市恒豐醫療器械有限公司）；DS-0405超聲波清洗機（深圳品凰科技有限公司）；CX23LEDRFSIC顯微鏡［奧林巴斯（中國）有限公司］，CP214型電子天平（美國Ohaus公司）；ZF-2型三用紫外儀（上海市安亭電子儀器廠）。

1.2? 材料? 三七對照藥材（批號：120941-201108）、延胡索對照藥材（批號：120928-201311）由中國食品藥品檢定研究院提供。化瘀止血膠囊（湘潭市中醫醫院制劑室，批號：20131201）；羧甲基纖維素鈉（上海山浦化工有限公司，批號：20141201）；甲醇（天津科賽歐，批號：200304）；甲苯（國藥集團，批號：20180111）；乙酸乙酯（批號：20181129）、二氯甲烷（批號：20201212），均購自于廣東光華科技有限公司；正丁醇（批號：20220305）、乙醚（批號：20220319）、丙酮（批號：20190105），均購自于天津富宇精細化工有限公司，以上試劑均為分析純。

1.3? 動物? SPF級雌雄各半的費城癌癥研究所（簡稱：ICR）小鼠各20只，小鼠重量：18.0～20.0 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，試驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2013-0004。動物實驗室溫度：20～26℃，動物實驗室濕度：40%～70%，換氣次數：≥15次/h，動物試驗流程及相關操作遵守《實驗動物管理條例》。

2? 方法與結果

2.1? 三七的薄層鑒別? 取內容物5 g，加40mL甲醇，超聲30min，過濾，濾液蒸干，加水20mL使殘渣溶解，每次用20mL水飽和的正丁醇萃取，萃取3次，將正丁醇液合并，用20mL氨試液洗滌，再用20mL飽和的水正丁醇洗滌，洗滌2次，將正丁醇液蒸干，殘渣加1mL甲醇溶解，即為供試品溶液。另取缺三七陰性樣品，同法制成缺三七陰性樣品溶液。再取三七對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。照2015版《中國藥典》（四部通則0502）試驗，分別吸取4μL的供試品、陰性樣品、對照藥材溶液，點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）的下層溶液為展開劑，10℃以下放置2 h，展開，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性無干擾。如圖1所示。

2.2? 延胡索的薄層鑒別? 取內容物10g，研細，加50mL甲醇，超聲30min，過濾，濾液蒸干，加10mL水使殘渣溶解，加濃氨試液調至堿性，用10mL乙醚振搖萃取，萃取3次，將乙醚液合并，蒸干，加1mL甲醇使殘渣溶解，即為供試品溶液。另取缺延胡索陰性樣品，同法制成缺延胡索的陰性樣品溶液。再取延胡索對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。照2015版《中國藥典》（四部通則0502）試驗，分別吸取上5μL的供試品、陰性樣品、對照藥材溶液，點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮（9∶2）為展開劑，展開，晾干，再置于碘缸中約3min取出，將板上吸附的碘揮盡后，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且陰性無干擾。如圖2所示。

2.3? 小鼠急性毒性試驗［10-18］

2.3.1? 最大給藥量實驗? 將雌雄各20只SPF級ICR的小鼠按性別、體重隨機方法分為兩組，即為空白對照組和化瘀止血膠囊組。實驗前禁食12 h以上，按40mL/kg劑量經口灌胃分別給予空白對照品組和化瘀止血膠囊組，給藥當日給藥2次，間隔6 h，化瘀止血膠囊組累積劑量為10.0 g生藥/kg，具體試驗劑量及分組情況見表1。給藥當天，尤其在給藥后0～4 h內密切觀察并記錄各組小鼠一般活動狀況、中毒表現和特點、毒性反應出現及恢復時間以及死亡情況等。然后每天觀察1次，連續觀察14 d。分別于給藥前及給藥后第7天、第14天，使用電子天平對小鼠體重進行稱量。所有小鼠在試驗結束后腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉處死，并予以大體解剖，肉眼觀察各臟器的位置、大小、色澤、粘連等情況，并檢查臟器表面和切面的質地、積液及腫瘤等異常改變。在試驗過程中若有非計劃死亡的動物（包括瀕死動物），均應進行大體解剖。

2.3.2? 統計學分析? 采用SPSS 16.0軟件，體重采用均數加減標準差（x±s）兩組間比較滿足正態性和方差齊性時采用t檢驗，否則采用Mann—Whitney Test，以P＜0.05表示差異具有統計學意義；P＜0.01表示差異其有顯著性意義。

2.3.3? 結果

2.3.3.1? 一般活動狀況及死亡情況? 在灌胃給藥后0～4 h內和連續14 d觀察期間，空白對照組和化瘀止血膠囊組小鼠自主活動如常，未見明顯異常和死亡現象。

2.3.3.2? 體重變化情況? 分別于給藥前、給藥后第7天和第14天稱重，結果與空白對照組比較，化瘀止血膠囊組小鼠體重變化無顯著性差異，且體重在正常增長范圍內，說明ICR小鼠經口灌服化瘀止血膠囊，給藥當日給藥2次，累積劑量10.0生藥/kg，對小鼠體重增長無明顯影響。具體見表2、表3、表4。

2.3.3.3? 大體解剖檢查結果? 肉眼觀察各臟器表面和切面均未見明顯異常情況。

3? 討論

化瘀止血膠囊方中三七化瘀止血、活血止痛，為君藥；白及收斂止血、消腫生肌，止血同時促進恢復，延胡索活血、行氣、止痛，兩者配合三七化瘀止血，行氣止痛，為臣藥；蒲黃止血、化瘀，調血而兼止，為佐藥。諸藥合并，化瘀止血、消腫定痛。根據湖南省藥品監督管理局《湖南省醫療機構應用傳統工藝配制中藥制劑備案管理實施細則》的規定，薄層鑒別應首選處方中君臣藥。故采用TLC法鑒別化瘀止血膠囊中三七、白及、延胡索藥味，建立其TLC色譜方法學研究。

在三七的薄層鑒別試驗中，參考《中國藥典》2015版一部，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）為展開劑，結果發現該展開劑中三氯甲烷毒性大。后經查閱文獻，選用二氯甲烷代替三氯甲烷為展開劑進行試驗，結果顯示斑點清晰，專屬性強，且展開劑毒性降低，故納入質量標準。在延胡索的薄層鑒別試驗中，選用延胡索對照藥材作為對照，結果顯示，與對照品色譜相應的位置上，主斑點明顯，故納入質量標準。處方中白及薄層分離效果差，且陰性干擾嚴重，故未列入質量控制標準。因此，將三七、延胡索列入質量標準。經試驗，該方法操作簡便、準確度高、重復性好、專屬性強。

本課題組在前期已對化瘀止血膠囊的止血治療作用進行了研究，顯示對胃出血其具有較好的治療作用。在肯定其療效的前提下，對該制劑的安全性進行評價。結果在本試驗條件下，ICR小鼠經口灌胃給予化瘀止血膠囊（0.125 g生藥/mL），最大劑量40mL/kg，每天給藥2次（累積劑量為10.0 ｇ生藥/kg），對其一般活動狀況和體重量增長無明顯影響，未見明顯急性毒性反應。根據《中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則》［10］，計算出小鼠最大給藥量相當于70 kg成人臨床擬用量的130倍，提示化瘀止血膠囊口服用藥安全性較高，可為臨床應用安全性提供依據。

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（收稿日期：2023-03-03? 編輯：陶希睿）