多指標綜合評分法優化直緣烏頭中草烏甲素滲漉提取工藝

湯泮泮 葉興蓉 陸雪萍 李龍 謝佳穎 馮莉萍 陳旭 任萍 陸禮和

基金項目：

作者簡介：

湯泮泮（1988—），男，漢族，碩士，主管藥師，研究方向為中藥及天然產物研究與開發。E-mail：690055283@qq.com

通信作者：

陸禮和（1987—），男，漢族，碩士，高級工程師，研究方向為天然產物及中藥開發研究。E-mail： 657484647@qq.com

【摘? 要】

目的：多指標綜合評分法優化直緣烏頭中草烏甲素滲漉提取工藝。 方法：在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數、浸泡時間、乙醇用量、滲漉流速為影響因素，草烏甲素轉移率和干膏率為綜合評價指標，正交試驗優化提取工藝。采用HPLC測定草烏甲素含量，檢測波長260nm，流動相為0.2%三乙胺水溶液［用磷酸調節pH值（3.1±0.1）］-乙腈（60∶40）。結果：最佳條件為藥材粉碎過10目篩，加3倍藥材量70%乙醇浸泡時間16 h，7倍藥材量70%乙醇，滲漉流速2 mL/min，草烏甲素轉移率＞95%。結論：該方法簡便穩定、重復性好，為草烏甲素的進一步分離純化與利用提供實驗依據。

【關鍵詞】

草烏甲素；綜合評分；滲漉提??；正交試驗

【中圖分類號】R284.2??? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）22-0025-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.22.zgmzmjyyzz202322007

Multi-index Integrated Evaluation MethodOptimization of Percolation and Extraction

Process of Bulleyacinitine A from Aconitum bulleyanumm

TANG Panpan? YE Xingrong? LU Xueping? LI Long? XIE Jiayin? FENG Liping? CHEN Xu? REN Ping? LU Lihe*

Yunnan Institute of Materia Medica，Yunnan Provincial Key Laboratory for TCM and

Ethnic Drug of New Drug Creation， Kunming 651000，China

Abstract：

Objective Multi-index Integrated Evaluation MethodOptimization of Percolation and Extraction Process of Bulleyacinitine A from Aconitum bulleyanumm. Methods Based on the analysis of the single factor experiment results， orthogonal test were used to determine the effects of ethanol dosage，ethanol concentration，soaking time and percolation speed on the extraction process of Aconitum bulleyanumm.by taking the dry extract yield and transfer rate of Bulleyacinitine A are taken as theindices for the comprehensive evaluation.HPLC was employed to determine contents of Bulleyacinitine A with detection wavelengths of 260 nm and mobile phases of was 0.2% triethylamine aqueous solution ［pH（3.1±0.1） adjusted with phosphoric acid］ -acetonitrile （60∶40）. Results The optimum percolation process was to add 10 times amount of Aconitum bulleyanumm （sieve No.1） and the 70% of ethanol，and soak for 16 hours.The percolation speed was 2 mL/min per minute. Transferring rate of Bulleyacinitine A was more than 95%. Conclusion This optimized percolation process is simple and stable with good repeatability，it can provide a theoretical basis for Separation and purification of Bulleyacinitine A．

Keywords：

Bulleyacinitine A;Composite Score; Percolation Process; Orthogonal Test

草烏甲素是從天然植物中提取分離純化得到的生物堿，具有較好的抗炎、鎮痛及免疫調節作用，臨床用于治療風濕及類風濕性關節炎、肩周炎等［1］，與非甾體消炎鎮痛藥和阿片類鎮痛藥相比，草烏甲素的安全性較好［2-3］。從2005版、2010版、2015版、2020版《中國藥典》二部均收載了草烏甲素原料及其制劑 ［4-7］，隨著草烏甲素制劑在臨床上的廣泛應用，草烏甲素市場需求較旺盛，作為草烏甲素提取用原料藥材需求量也不斷增加。

目前草烏甲素只能從烏頭屬植物中分離得到，如滇西烏頭（Aconitum bulleyanumm Diels）、粗莖烏頭（Aconitum crassicaule W.T.Wang）［8］、長緣烏頭（Aconitumm georgei Comber）［9］和直緣烏頭（Aconitum transsectum Diels）［10］等，其中直緣烏頭主要為工業生產草烏甲素的原料［11］。沈勇等［12-14］采用甲醇滲漉，張紅彬［15］采用堿浸泡和石油醚回流提取，付彬彬［16］采用閃式提取草烏甲素，提取過程中堿性溶劑、有毒有害試劑回收利用較難把控，限制了工業化生產。本研究采用HPLC法建立了乙醇滲漉液中草烏甲素含量測定方法［17-18］，以草烏甲素轉移率和干膏率作為指標進行綜合評分，在單因素試驗基礎上通過正交試驗［19］優化直緣烏頭中草烏甲素滲漉提取工藝，為后續草烏甲素純化研究提供技術支撐。

1? 儀器與材料

1.1? 儀器? DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；DHG-9145A電熱鼓風干燥箱（上海一恒有限公司）；ME204/02型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；SK-8200HP型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2? 材料? 草烏甲素對照品（批號：100530-202103，含量以99.2%計）購于中國食品藥品檢定研究院；乙醇為食品級，三乙胺、磷酸、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，純凈水由Milli-Q純水系統制備，其余試劑為分析純。

直緣烏頭藥材（購于云南玉龍縣），經云南省藥物研究所正高級工程師蘇鈦鑒定為毛茛科直緣烏頭Aconitum transsectum Diels的干燥根，草烏甲素含量為0.18%（根據文獻［11］自測），批號：2020414。

2? 方法與結果

2.1? 溶液的制備

2.1.1? 供試品溶液制備? 取試驗工藝中的滲漉液1mL，加相應70%乙醇，并定容至10mL量瓶中，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.2? 對照品溶液制備? 精密稱取草烏甲素對照品10mg，置于50mL量瓶中，80%乙醇溶解定容至刻度，搖勻，分別精密吸取4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL、8.0mL于10mL量瓶中，80%乙醇稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，即得（每1mL分別含0.08mg、0.10mg、0.12mg、0.14mg、0.16mg草烏甲素）。

2.2? 指標成分的測定

2.2.1? 色譜條件? Ecosil C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；0.2%三乙胺水溶液［用磷酸調節pH值（3.1±0.1）］-乙腈（60∶40）為流動相，檢測波長260nm；柱溫30℃；流速1.0mL/min；進樣量10μL。

2.2.2? 線性關系考察? 吸取“2.1.2”項下對照品溶液，以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y=13751X+19.1（R2=0.9995），在0.08～0.16mg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.3? 精密度考察? 精密吸取“2.1.2”項下草烏甲素對照品溶液，按照“2.2.1”項下的色譜條件連續進樣6次，計算其峰面積的RSD值為2.1%，表明該儀器精密度良好。

2.2.4? 穩定性考察? 取“2.1.1”項下供試品溶液分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、16 h、24 h按“2.2.1”項下的色譜條件進行測定，計算其峰面積RSD值為2.5%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.5? 重復性考察? 精密量取“2.1.1”項下供試品溶液6份，按“2.2.1”項下的色譜條件進行測定，計算其含量RSD值為2.2%，表明該方法重復性良好。

2.2.6? 加樣回收率試驗? 精密量取已知含量同一批滲漉液，平行取樣6次，每份1mL，精密加入等量草烏甲素對照品溶液，按照“2.1.1”項下制備供試品溶液，按“2.2.1”項下的色譜條件進行測定，計算草烏甲素的平均加樣回收率為99.45%，RSD為2.7%。

2.3? 干膏的測定? 精密量取25mL滲漉液至干燥恒重的蒸發皿，80℃水浴蒸干。常壓105℃干燥至恒重，置干燥器冷卻30 min，迅速稱定重量，計算干膏重量。

2.4? 評價指標? 草烏甲素轉移率越高，提取效果越好，可作為考察提取效果的主要指標，權重系數為 0.6，同時，干膏得率越小，說明雜質少，干膏得率可作為次要指標，權重系數為 0.4，因此以干膏得率和草烏甲素轉移率為評價指標，對滲漉工藝進行綜合評分［11-12］。

干膏得率＝滲漉液總體積×干膏重量/（取樣體積×原藥材重量）

草烏甲素轉移率＝干膏草烏甲素含量×干膏重量/（原藥材草烏甲素含量×原藥材重量）

滲漉綜合評分＝干膏得率/最大干膏得率×40＋草烏甲素轉移率/最大草烏甲素轉移率×60

2.5? 單因素試驗

2.5.1? 粉碎度考察? 取藥材適量，粉碎，分別過4mm、10mm、24mm、50mm目篩各20 g，3倍量80%乙醇濕潤浸泡，裝柱，加入5倍量80%乙醇，滲漉流速1mL/min，浸泡時間16 h，搖勻，直接取滲漉液0.45μm微孔濾膜過濾，結果發現，粉碎度10目篩時草烏甲素含有量最高及耗時較短，故選擇其進行后續試驗。

2.5.2? 乙醇體積分數? 取藥材粉碎過10目篩20 g，3倍量一定乙醇濃度濕潤浸泡，浸泡時間16 h，裝柱，加入5倍量相應乙醇濃度進行滲漉，滲漉流速1mL/min，考察50%、65%、80%、95%乙醇濃度對提取效果的影響。結果見表1，乙醇體積分數對綜合評分影響較大，隨著乙醇體積分數的增加，綜合評分先升高再降低， 80%乙醇時綜合評分最高。結合經濟成本，選乙醇體積分數為70%、80%、90%乙醇作為正交試驗的3個水平。

2.5.3? 浸泡時間? 取藥材粉碎過10目篩20 g，3倍量80%乙醇濕潤浸泡，裝柱，加入5倍量相應乙醇濃度進行滲漉，滲漉流速1mL/min，考察浸泡時間4 h、8 h、16 h、24 h對提取效果的影響。結果見表2，浸泡時間對綜合評分影響較大，隨著浸泡時間的增加，綜合評分趨勢放緩，浸泡時間16 h時綜合評分最高。結合經濟成本，故固定浸泡時間為8 h、16 h、24 h作為正交試驗的3個水平。

2.5.4? 乙醇用量? 取藥材粉碎過10目篩20 g， 3倍量80%乙醇濕潤浸泡，浸泡時間16 h，裝柱，滲漉流速1mL/min，考察乙醇用量5倍、7倍、9倍、12倍、17倍對提取效果的影響。結果見表3，乙醇用量對綜合評分影響較大，隨著乙醇用量的增加，綜合評分趨勢放緩，乙醇用量15倍時綜合評分最高。結合經濟成本，故固定乙醇用量為10倍、15倍、20倍作為正交試驗的3個水平。

2.5.5? 滲漉流速? 取藥材粉碎過10目篩20 g，3倍量80%乙醇濕潤浸泡，浸泡時間16 h，加入12倍80%乙醇進行滲漉，考察滲漉流速0.5mL/min、1mL/min、2mL/min、3mL/min對提取效果的影響。結果見表3，滲漉流速對綜合評分影響較大，隨著滲漉流速的增加，綜合評分趨勢放緩，滲漉流速1mL/min時綜合評分最高。結合經濟成本，故滲漉流速為1mL/min、2mL/min、3mL/min作為正交試驗的3個水平。

2.6? 正交試驗? 在單因素試驗基礎上，取藥材粉碎過10目篩20 g，以乙醇體積分數（A）、乙醇用量（B）、滲漉流速 （C）、浸泡時間 （D） 為影響因素， 進行4因素3水平L9（34） 正交試驗。因素水平見表1，結果見表2，方差分析見表5。

即各因素最優水平分別為A1、B2、C2、D2。方差分析（表7）結果顯示，因素A的F值為26.168，大于F0.05（2，2）＝19.00，說明A（乙醇體積分數）對試驗指標有顯著性影響（P＜0.05），結合直觀分析顯示的A1水平較好，因此A因素選取A1水平，即滲漉提取的乙醇體積分數為70%。而B（乙醇用量）的F值為0.510、C（滲漉流速）F值為0.353均小于F0.05（2，2）＝19.00，表明B和C因素對試驗指標無顯著性影響（P＞0.05）。正交試驗結果中綜合評分顯示，滲漉工藝為A1B2C2D2的評分最高，A因素為A1水平，與方差分析結果一致；B、C、D因素為 B2、C2、D2均取各水平的中間值，從滲漉效率和節約溶劑角度考慮也較為合理。綜上，通過正交試驗初步選擇滲漉工藝條件為A1B1C2D2，即70%乙醇（3倍藥材量）浸泡時間16 h，再加70%乙醇滲漉（7倍藥材量），滲漉流速2mL/min。

2.7? 滲漉工藝驗證試驗? 取藥材粉碎過10目篩20 g，平行3份，加入70%乙醇（3倍藥材量）浸泡時間16 h，再加70%乙醇滲漉（7倍藥材量），滲漉流速2mL/min，計算草烏甲素轉移率和干膏得率，結果見表8。結果顯示，草烏甲素平均轉移率為97.94%，RSD為0.66%；干膏平均得率為45.73%，RSD為 0.72%；平均綜合評分值為97.94%；結果表明，3次試驗結果和正交試驗綜合評分96%～97%之間，RSD值為0.66%，表明該提取工藝參數 A1B1C2D2穩定、科學、可行。

3? 討論

草烏甲素在臨床上廣泛應用，市場需求較旺盛，提升草烏甲素的提取效率，是一項重要的研究工作。預實驗曾對滲漉法和回流法提取進行比較，結果發現滲漉法的草烏甲素轉移率高，故選擇滲漉法。本文先對滲漉提取中粉碎度、浸泡時間、乙醇體積分數、乙醇用量、流速進行單因素試驗，再對乙醇體積分數、乙醇用量、滲漉流速、浸泡時間進行正交試驗。在粉碎粒度考察時，發現過細時，未能達到滲漉提取效果，耗時較長，轉移率較低，故直緣烏頭在滲漉提取過程中不宜粉碎過細，避免滲漉過程中發生堵塞柱筒現象，影響滲漉效果。最終，采用最佳滲漉工藝為最粗粉加70%乙醇（3倍藥材量）浸泡時間16 h，再加70%乙醇滲漉（7倍藥材量），滲漉流速2mL/min進行提取，耗時短，綜合評分較高。該方法簡便穩定、重復性好，為草烏甲素的進一步分離純化與利用提供實驗依據。

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（收稿日期：2023-03-01? 編輯：陶希睿）