多糖類免疫增強劑在魚類養殖中的應用研究進展

李蕾，蔣昕彧，朱雷，孔祥會

（河南師范大學水產學院，河南 新鄉 453007）

近年來，隨著高密度集約化養殖的大規模推廣應用，養殖水環境持續惡化，水產養殖動物抵御病原入侵的能力下降、疾病頻發，造成重大經濟損失[1]。目前應對病害常用的措施是藥物防控，而頻繁使用抗生素后，細菌基因突變產生耐藥基因，改變自身的代謝途徑，產生耐藥菌等問題，降低了水產品質量，影響人類健康[2]。藥物防控的諸多弊端使免疫防控逐漸成為水產養殖的重要議題。

免疫增強劑（Immunostimulants）是指具有促進或誘發宿主防御反應，增強生物機體抗病能力的一類物質[3]。水產養殖中，常用多糖、白細胞介素（Interleukin，IL）、維生素E、CpG 寡脫氧核苷酸等生物活性物質作免疫增強劑[4-6]。

多糖（Polysaccharide）是一類從細菌、真菌和動植物等生物中提取獲得，由10 個以上單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物。生產中，常將具有生物活性，能激活機體參與抵御病原微生物入侵，增強免疫應答能力的多糖稱作免疫增強劑。它能增加抗體效價，增強白細胞和巨噬細胞的吞噬能力，提高淋巴細胞轉化率，發揮抵御病原入侵和增強機體免疫應答的功能[4,5]。目前，多糖類免疫增強劑的研究受到廣泛關注，廣泛應用在魚類養殖中。根據來源，免疫增強劑可分為植物來源、微生物來源和動物來源3 類（表1）[6]。

表1 各種多糖免疫增強劑對魚類免疫功能的影響Tab.1 Effects of various polysaccharide immunoenhancers on immune function of Fish

1 植物來源的多糖

天然植物多糖屬于植物體內一類重要的生物大分子，包含多種活性成分，可作為天然免疫調節劑。在飼料中添加植物多糖可以促進魚類生長，調節免疫力，預防病原微生物感染[7]，與抗生素相比，具有無耐藥性和無殘留等優點[8]。

1.1 黃芪多糖

黃芪多糖（Astragalus polysaccharide，APS）是從黃芪中分離純化得到的多糖。它的單糖為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖[9]。APS 具有調節腸道菌群、提高動物抗氧化能力、調控炎癥反應、維持細胞穩態、增強免疫功能等作用[9,10]。草魚（Ctenopharyngodon idella）飼料中添加APS 可以提高超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性進，提高抗氧化能力；可以調節腸道微生物的多樣性，激活免疫相關基因表達，保護魚體免受病原菌感染。SOD 和CAT 是細胞抗氧化系統中的兩個中心酶，多糖能顯著提高二者的活性，具有明顯的抗氧化效果，保護魚體免受氧化損傷。多糖進入腸道后，被腸道微生物利用，產生代謝產物，改變腸道菌群結構，減少病原體的增殖[12]。鯽（Carassius auratus）飼料中添加不同濃度的APS 可調節先天免疫能力，提高鯽抗嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）感染的能力和成活率，促進生長，但超過100 mg/kg 并不能進一步提高魚體生長發育和先天免疫力[13]。劉金海等[14]發現，半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）攝食不同劑量的APS 后，血液中白細胞吞噬活性、溶菌酶（LZ）活性、過氧化物酶活性、酸/堿性磷酸酶活性和抗體含量顯著增強和增加，較佳添加劑量為600 mg/kg。大菱鲆（Scophthalmus maximus）攝食含150 mg/kg APS 的飼料，可顯著提高魚體生長性能和抗氧化活性，還可以調控Toll 樣受體（TLRs）如TLR5α、5β、8、21 以及MyD88 和NF-κB p65 的基因表達。這些基因在TLRs/NF-κB 信號通路中起著至關重要的信號轉導作用。APS 可激活TLRs/NF-κB 信號通路中關鍵細胞因子來調節免疫應答[15]。Zhang 等[16]采用薄膜分散超聲法制備了黃芪多糖脂質體（Astragalus polysaccharide liposome，APSL），發現APS 和APSL 在體內外均能提高大黃魚（Larimichthys crocea）非特異性免疫酶活性和抗氧化能力，增強頭腎巨噬細胞的M1 巨噬細胞的典型特征——NO 生成和吞噬活性，顯著上調促炎細胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α）、IFN-γ 和iNOS 的表達水平。巨噬細胞是一種重要的免疫細胞，添加多糖后巨噬細胞經歷經典或替代激活，分化為M1 或M2 巨噬細胞。M1 巨噬細胞以誘導呼吸爆發、產生促炎細胞因子和合成誘導型一氧化氮合酶（iNOS），來參與消除病原體和引發炎癥。APSL 的效果明顯優于APS，可作為APS 的潛在藥物載體。孫林浩等[17]研究發現，APS 可以抑制大黃魚頭腎巨噬細胞經丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）誘導后的呼吸爆發活性，增強經脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激的巨噬細胞的吞噬活性，提高巨噬細胞TNF-α、IL-1β 和IL-6 基因的表達量，調節巨噬細胞免疫能力。Yu 等[18]研究發現，添加0.10%的APS 是促進尖吻鱸（Lates calcarifer）生長性能和抗哈維氏弧菌能力的最適水平，但0.20%實驗組的生長性能顯著下降，過量添加APS 對魚體不利。上述研究得出，APS 的適宜劑量范圍為0.005%～0.200%。

1.2 枸杞多糖

從枸杞中提取的水溶性枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP）一般由6 種單糖（半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和木糖）和18種氨基酸組成。它們的結構是β-葡聚糖，（1→6）-β-半乳糖基殘基的骨架與生物功能相關[19]。LBP可通過增強T 細胞介導的免疫反應和體液免疫反應，提高機體免疫力[20]。LBP 能提高鯧鲹（Trachinotus ovatus）抗氧化能力和固有免疫能力，適宜添加量為0.10%[21]。在飼料中添加LBP，通過激活巨噬細胞，促進脾組織中IL-1β 基因的表達，提升了尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的生長速率，增強了補體C3 活性。補體是血液中一組具有酶活性的蛋白質系列，通過調節吞噬、呼吸爆發、趨化和細胞裂解等在免疫中發揮關鍵作用[22]。在飼料中添加0.5～2.0 g/kg LBP 可以顯著提高雜交石斑魚肝臟抗氧化酶活性以及免疫相關基因表達，調控肝臟的炎癥反應，抑制細胞凋亡，改善雜交石斑魚的生長性能和飼料利用率[23]。Mo 等[24]在草魚和尼羅羅非魚飼料中添加2.0 g/kg 和20 g/kg 的LBP，發現2.0 g/kg 顯著提高了抗蛋白酶活性、血清總免疫球蛋白和血清殺菌活性、生長性能和成活率，是合適選擇。根據以上研究得出，LBP 的適宜添加劑量范圍為0.05%～2.00%。

1.3 玉屏風多糖

玉屏風多糖（Yu-Ping-Feng polysaccharides，YPF-P）是由黃芪、白術和防風三味中草藥按2∶2∶1 重量比組成的復合中草藥多糖。尹福泉等[25]研究發現，YPF-P 可以通過改善草魚腸道黏膜的形態來提高草魚腸道的吸收功能，還可通過提高頭腎IL-2 和IFN-γ 基因的表達增強魚體免疫力，其最適添加量為1.6 g/kg。楊虹等[26]用YPF-P 復合益生菌飼喂烏鱧（Channa argus），提高了烏鱧的腸絨毛高度、降低了隱窩深度以及增加肌層厚度，保證腸道形態結構的完整性，還顯著提高了溶菌酶（LZM）和SOD 的活性。YPF-P 可以提高草魚生長性能，促進免疫器官發育，通過提高肝胰臟中SOD 和CAT 活力來提高魚體抗氧化能力，較適添加劑量為1.6 g/kg，而添加量達到2.0 g/kg 時，與對照組相比，肝胰臟中SOD、CAT 活力下降，抗氧化能力減弱，即添加量超過一定的范圍就會對機體產生不良影響[27]。根據以上研究得出，YPF-P 的適宜添加劑量范圍為0.08%～0.20%。

1.4 海藻多糖

海藻多糖（Seaweed polysaccharide）具有廣泛的生物活性，包括促進魚體生長、調節免疫、抑制炎癥細胞和提高抗氧化能力等[28]。從大團扇藻（Padina gymnospora）中提取多糖飼喂鯉，不同劑量均能顯著提高鯉血清溶菌酶、髓過氧化物酶活性，上調鯉IL-1β 和C 型溶菌酶等免疫相關基因的表達，保護魚體免受嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華氏菌的感染[29]。鯽飼料中分別添加4%的4 種海藻（滸苔Enteromorpha prolifera、條斑紫菜Porphyra yezoensis、銅藻Sargassum horneri 和壇紫菜Porphyra haitanensis）多糖，均可刺激機體免疫器官發育，滸苔組可顯著提高堿性磷酸酶和血清中球蛋白總含量，提高抵抗病毒能力，滸苔組和銅藻組可顯著提高抗嗜水氣單胞菌感染能力[30]。Zhou 等[31]研究發現，40 g/kg 的滸苔多糖可促進鯽的生長，提高腸道消化酶活性和血清中SOD 和LYZ 等酶的活性，增強對嗜水氣單胞菌的抵能力。從刺松藻（Codium fragile）中提取硫酸化多糖飼喂石斑魚，0.1%的多糖可增強石斑魚的免疫水平，抵御遲緩愛德華氏菌的感染[32]。3 g/kg 的條斑紫菜多糖可以顯著提高草魚生長性能和補體C3/C4 活性，減少細菌或病毒感染[33]。Marian等[34]從石莼（Ulva ohnoi）中提取硫酸化多糖，腹腔注射塞內加爾鰨（Solea senegalensis），能通過替代和經典的補體途徑來激活、調節補體，顯著上調趨化因子、蛋白酶體和抗原呈遞相關的基因表達，誘導急性期蛋白、抗菌肽和補體系統相關基因的表達，以維持機體的動態平衡，防止感染病原后宿主細胞的損傷。以上研究表明，海藻多糖能有效提高魚體生長性能和免疫能力，改善水生動物的健康狀況，在水產養殖中具有較大的應用前景，適宜添加劑量范圍為0.01%～8.00%。

1.5 其他植物多糖

還有一些其他植物多糖廣泛應用在水產養殖中。無花果（Ficus carica）、板藍根（Radix isatidis）和五味子（Schisandra chinensis）多糖均可以顯著提高鯽溶菌酶活性，激活補體系統，增強機體對嗜水氣單胞菌的抵抗力[35]。大鱗鲃（Luciobarbus capito）飼料中添加不同劑量的地黃多糖（Radix rehmanniae Preparata polysaccharides），可以顯著上調腸道、腎臟和脾中促炎細胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α 和IFN-γ的表達，下調抑炎細胞因子IL-10 和TGF-β 的表達，提高魚體對嗜水氣單胞菌的抵抗能力，其中以0.2%效果最好。促炎細胞因子表達水平是炎癥反應是否發生的指標，上調即參與炎癥反應，抗炎細胞因子是免疫系統中具有多效性作用的調節性細胞因子，不僅抑制過度的細胞因子釋放，還控制炎癥過程[36]。當歸多糖能提高鯧鲹和點帶石斑魚（Epinephelus malabaricus）肝臟中超氧化物歧化酶的活性和抗氧化能力，激活補體系統，提高魚體免疫力[37,38]。

2 微生物來源的多糖

微生物多糖是細菌、真菌或藍藻等微生物代謝產生的一類代謝中間產物。微生物多糖具有植物多糖不具備的優良性質，如生產周期短，不受地理環境、氣候和其他自然條件等因素影響。微生物多糖主要有葡聚糖、脂多糖和真菌多糖等，具有抗菌、抗氧化和調節免疫能力等功能[39]。

2.1 葡聚糖

葡聚糖（Glucans）是一種高分子葡萄糖聚合物。其中，β-葡聚糖是目前最受關注的葡聚糖。β-葡聚糖是由D-吡喃葡糖殘基組成的β-連接的多糖，可從蘑菇、酵母、燕麥、大麥、海藻、藻類、真菌和細菌細胞壁中提取[40]。然而，β-葡聚糖的結構多樣，來自微生物的β-葡聚糖主要由β（1,3）連接的葡萄糖和幾個β（1,6）連接的分支構成，而來自植物的β-葡聚糖主要由β（1,3）和β（1,4）組成，沒有分支。來自酵母的β-（1,3/1,6）-葡聚糖常被用作免疫增強劑。β-葡聚糖通過與其特定受體Dectin-1 結合來激活免疫細胞，Dectin-1 是一種表達在巨噬細胞表面的c 型凝集素受體，β-葡聚糖/Dectin-1 復合體通過與TLR2 及其信號通路聯合而激活巨噬細胞，通過分泌TNF-α 而引起促炎反應[41]。酵母細胞壁中提取的β（1,3/1,6）-葡聚糖可以通過提高細鱗肥脂鯉（Piaractus mesopotamicus）白細胞的呼吸活性和溶菌酶水平來應對嗜水氣單胞菌的感染[42]。Wei 等[39]將酵母菌β（1,3/1,6）-葡聚糖作為哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）滅活疫苗佐劑免疫石斑魚后，魚體脾臟IgM、MHC-Iα、TNF-α、IL-1β 和IL-16 的表達水平明顯升高，血液中的抗體效價、溶菌酶和超氧化物歧化酶活性提高，相對免疫保護率達（68.0±5.7）%。IgM是一種通用抗體，是硬骨魚特異性體液免疫反應的唯一組成部分，MHC-Iα 負責呈遞結合的外源多肽，并與參與細胞免疫的T 細胞受體特異性相互作用。IL-1β、IL-16和TNF-α 在啟動促炎細胞因子級聯、巨噬細胞招募和激活以及刺激適應性免疫反應中起重要作用。Lee 等[43]將β-葡聚糖和土霉素混合飼喂石斑魚，發現混合使用比單獨使用一種物質可更好地抵抗細菌感染。葡聚糖的適宜添加劑量范圍為0.05%～0.80%。

2.2 脂多糖

脂多糖（LPS）是一種典型的病原體相關分子模式（PAMP），位于革蘭氏陰性菌外膜的外層，由三種不同的結構組成：類脂A、核心寡糖和O-抗原。脂A 部分是一種基于氨基葡萄糖的磷脂，具有內毒素的性質，通過識別哺乳動物的模式識別受體（PRRs）來激活先天性免疫反應[44]。小劑量的LPS 可能通過激活補體替代途徑、巨噬細胞的吞噬活性以及B 和T 淋巴細胞的增殖等方式提高魚體先天免疫水平[45]。給巴丁魚（Pangasianodon hypophthalmus）注射3 mg/kg 的LPS，提高了補體活性和抗體效價，增強了先天免疫應答及對遲緩愛德華氏菌的抵抗力[46]。在巴塔野鯪（Labeo bata）飼料中添加100 mg/kg 的LPS，不僅可以提高血液學參數（總紅細胞計數、總白細胞計數、總血清蛋白、白蛋白和球蛋白）、固有免疫參數（呼吸爆發、血清溶菌酶、髓過氧化物酶和血清殺菌活性）和免疫基因表達（C3、β-2 微球蛋白、溶菌酶、轉鐵蛋白、IFN-1、IFN-γ），還能提高遲緩愛德華氏菌感染后的存活率[47]。脂多糖的適宜添加劑量范圍為0.005%～0.015%。

2.3 真菌多糖

真菌多糖廣泛存在于真菌的細胞壁中，是由10個以上的單糖以糖苷鍵連接而成的高分子聚合物，具有復雜的生物學活性和功能，其中最主要的是免疫調節活性。目前研究比較多的真菌多糖主要包括香菇多糖（Lentinan，LNT）、靈芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharides，GLP）和雙孢蘑菇多糖（Agaricus bisporus polysaccharides，ABP）等。480 mg/kg 的香菇多糖飼喂歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）可促進魚體生長，降低血清轉氨酶活性和肝臟丙二醛含量，改善肝臟健康狀況[48]。飼料中添加靈芝多糖，可促進羅非魚（Oreochromis sp.）的生長，顯著增強抗氧化酶活性，提高魚體免疫力[49]。Liu 等[50]用靈芝多糖孵育四氯化碳處理過的鯉肝細胞，可以抑制肝細胞脂質過氧化、提高抗氧化酶活性、抑制細胞凋亡和調節炎癥反應，減輕肝細胞炎癥反應的損傷。在草魚飼料中添加1 mg/kg 的雙孢蘑菇多糖后，抗嗜水氣單胞菌能力、抗氧化能力和適應性免疫應答能力更強，炎癥相關基因的表達水平受到顯著調控[51]。真菌多糖的適宜添加劑量范圍為0.000 1%～0.480 0%。

3 動物來源的多糖

動物多糖常存在于動物的組織和器官中，可改善水產動物機體的生長性能，提高免疫能力[52]。目前廣泛應用于水產中的動物多糖主要是甲殼素和殼聚糖。

3.1 甲殼素

甲殼素（Chitin）又稱為甲殼質、幾丁質，化學名稱是（1,4）-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖，是自然界中合成量僅次于纖維素的第二大可再生自然資源，是廣泛存在于甲殼類的多糖物質，具有無毒、可生物降解和生物相容性等優點[53]。將0.2%甲殼素添加到飼料中投喂），顯著增強了卡特拉鲃（Catla catla）頭腎細胞中超氧陰離子和NO 的產生，提高白細胞髓過氧化物酶含量和血清溶菌酶活性[54]。南亞黑鯪（Labeo rohita）飼料中添加1%甲殼素，飼喂2 周后抗氧化能力顯著提高，同時增強抵御單殖吸蟲感染的能力。甲殼素可以通過與其受體之間的相互作用，調節魚類的免疫功能，還可在腸道環境中降解為殼聚糖，調節微生物群，保護魚體[55]。1.0 g/kg 的N-乙酰-D-氨基葡萄糖負載甲殼素納米粒作為尼羅羅非魚飼料添加劑，提高了羅非魚的生長速率、總成活率，增強了中性粒細胞呼吸爆發和溶菌酶活性，增強了尼羅羅非魚的抗病能力[56]。甲殼素的適宜添加劑量范圍為0.025%～2.000%。

3.2 殼聚糖

殼聚糖（Chitosan，CS）是甲殼素脫乙酰化衍生物，化學結構是β-（1,4）-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖。殼聚糖在體內的免疫刺激作用可能歸因于其氨基部分，促進各種炎癥細胞的功能，如巨噬細胞和多形核白細胞，以及不同的細胞因子，來促進魚體生長、抵抗病毒感染和增強免疫應答[57]。草魚飼料中添加5 g/kg 的殼聚糖，可以顯著提高血清溶菌酶、SOD 活性、AKP 活性、補體C3 含量和血液白細胞吞噬活性，從而增強魚體的免疫能力[58]。100 μg殼聚糖作為傳染性脾腎壞死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）滅活疫苗的佐劑，可以誘導鱖（Siniperca chuatsi）脾和腎中免疫細胞因子的表達，抑制病毒的復制來提高抗病毒能力[59]。用0.05 g/kg 的殼聚糖和納米殼聚糖負載斜發沸石（Clinoptilolite）飼喂，提高了虹鱒（Oncorhynchus myk iss）生長性能、血清生化參數和消化酶活性，增強了免疫應答能力[60]。殼聚糖的適宜添加劑量范圍為0.005%～10%。

4 小結和展望

我國的多糖資源豐富，活性多糖具有無污染、無藥物殘留以及病原菌不易產生耐藥性等優點，能增強機體免疫功能而無毒副作用，符合綠色健康養殖模式。多糖不僅可以提高水產養殖動物抗病力、存活率和促進生長，與疫苗混合使用還能作為佐劑，增強疫苗的抗原效價和作用時效，應用前景十分廣闊。然而，多糖免疫增強劑在生產中的應用仍存在一些問題：（1）多糖的結構特征與生物活性之間密切相關。多糖分子結構復雜、多樣，與生物活性之間的相關性還有待研究[61]；（2）多糖的作用效果與給藥方式有關。注射法引起的免疫反應快，但持續時間短，容易使機體產生應激反應；口服法魚體受到的應激性刺激較小，但病魚不攝食時，口服法不能實施；（3）多糖的投喂劑量、頻次以及投喂時間直接影響多糖的應用效果。有些免疫增強劑在高劑量下，不僅不會增強免疫效果，反而還會抑制免疫反應，合適的多糖添加量才能促進魚類的免疫力。多糖的投喂時間和周期對魚體增強免疫效果非常關鍵，有的多糖在魚體發病前使用，而有的則是在魚體感染后使用。總之，多糖的理化性質、結構特征、使用方法、劑量和期限以及對魚類免疫的影響較為復雜多樣，如何科學合理地使用多糖仍需進一步深入研究。