基于網絡藥理學和分子對接探討山楂葉治療2型糖尿病的作用機制*

賀美婷,高靜云,何明媚,潘海峰

1.承德醫學院,河北 承德 067000; 2.河北省中藥研究與開發重點實驗室,河北 承德 067000

糖尿病是一種以血糖水平升高為特征的慢性代謝疾病,主要包括1型糖尿病和2型糖尿病。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM),又稱非胰島素依賴型糖尿病,由胰島素分泌不足或胰島素抵抗導致血糖水平升高。T2DM是最常見的糖尿病,約占所有糖尿病病例的90%。血糖可以直接反映糖尿病的情況,長期高血糖狀態或血糖波動都會對機體造成一定程度的損壞,導致心腦血管、視網膜或腎臟等組織的功能減退或衰竭,進而引起一系列并發癥,甚至導致死亡[1]。2021年12月6日,國際糖尿病聯盟發布了第10版《全球糖尿病地圖》,相關數據顯示截至2021年,全球已有5.7億成年人罹患糖尿病,中國已確診及未確診人數均位居全球第一,60歲以下人群中糖尿病相關死亡比例占3.9%[2]。由此可見,我國人民面臨著糖尿病的嚴峻威脅,及早進行控糖防治已經成為重要的干預手段。

中藥在治療糖尿病及并發癥方面展現出良好優勢,《中國2型糖尿病防治指南(2020年版)》[3]對中醫藥防治糖尿病的作用也做出了肯定,因此開發中藥潛力是目前最重要的任務之一。山楂葉是薔薇科植物山里紅(CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.)或山楂(GrataeguspinnatifidaBge.)的干燥葉,味酸,性平,具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂的功效[4]。研究表明,山楂葉具有降血糖、調節糖脂代謝紊亂等作用[5],但其作用機制尚不明確。因此,本研究首先基于網絡藥理學和分子對接的方法預測山楂葉治療T2DM的作用靶點,挖掘潛在活性成分;其次,通過BioGPS和The Human Protein Atlas數據庫分析山楂葉抗T2DM的關鍵組織以及相關基因在關鍵組織的不同細胞中的分布情況,從而預測山楂葉通過“多成分-多組織-多通路-多靶點”途徑防治T2DM的作用機制,為臨床治療提供理論基礎和研究思路。

1 資料與方法

1.1 山楂葉活性成分篩選從中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http:www.tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、HERB(http://herb.ac.cn/)、SymMap(http://www.symmap.org/)、TCM-ID(https://bidd.group/TCMID/)等數據庫中檢索山楂葉的化學成分,并根據已發表文獻中總結的化學成分[6],共同構建山楂葉化學成分庫并分類。從PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取各化學成分的Canonical SMILES碼,將其導入SwissADME數據庫進而篩選活性成分。篩選標準為:胃腸道吸收“GI absorption=high”且類藥性“Druglikeness”中符合“Lipinski=yes”及至少另外一項規則為“yes”。

1.2 山楂葉潛在靶點預測將山楂葉活性成分的Canonical SMILES碼導入Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/),設置物種為“Homo sapiens”,篩選出“Probability≥0.1”的靶點。除去重復靶點后導入UniProt數據庫(https://beta.uniprot.org/)獲得已被驗證的人源UniProt ID,從而得到標準化后的山楂葉活性成分的潛在靶點。

1.3 T2DM相關靶點篩選以“type 2 diabetes mellitus”“T2DM”為關鍵詞,利用DrugBank(https://go.drugbank.com/)、TTD(https://db.idrblab.net/ttd/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、CTD(https://ctdbase.org/)和OMIM(https://omim.org/mimmatch/)數據庫檢索相關靶點。在GeneCards得到的數據中剔除Description為空白的靶點,并選擇Relevance score>22的靶點;在CTD中剔除“Direct Evidence”為空白的靶點,并選擇Inference Score≥2的靶點。最后,去除重復靶點,合并整理,導入UniProt數據庫進行標準化處理,得到T2DM疾病相關靶點。

1.4 蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡構建及關鍵靶點篩選利用Venny2.1.0獲取山楂葉潛在靶點和T2DM相關靶點的交集靶點,并繪制韋恩圖。將交集靶點上傳至STRING數據庫(https://cn.string-db.org/),設置物種為“Homo sapiens”且最低相互作用閾值為0.4,隱藏游離節點,得到PPI網絡,下載TSV文件并導入Cytoscape 3.9.1進行拓撲分析和可視化。然后,基于Centiscape 2.2插件分析“Betweenness(中介中心性)”“Closeness(接近中心性)”“Degree(度值)”值,篩選大于中位值的靶點作為山楂葉抗T2DM的關鍵靶點。

1.5 活性成分-交集靶點網絡構建及核心成分篩選將山楂葉活性成分和山楂葉-T2DM交集靶點導入Cytoscape3.9.1構建活性成分-交集靶點網絡圖。然后,基于CytoNCA插件分析活性成分-交集靶點網絡圖,得到“Betweenness”“Closeness”“Degree”值,篩選大于平均值的成分作為山楂葉抗T2DM的核心成分。

1.6 基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析將山楂葉-T2DM交集靶點上傳至DAVID 6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp),設置物種為“Homo sapiens”,進行GO功能分析和KEGG通路分析,以P<0.05為條件篩選結果并排序,取前30條KEGG結果和前10條GO結果繪制富集圖,并將其作為山楂葉治療T2DM的關鍵通路和功能。將關鍵靶點、核心成分和關鍵通路導入Cytoscape 3.9.1軟件,構建“關鍵靶點-核心成分-關鍵通路”網絡圖。

1.7 分子對接驗證在TCMSP數據庫下載山楂葉核心成分的3D結構,未被TCMSP收錄的化合物從PubChem數據庫中獲取SDF文件,并通過Open Babel3.1.1轉化成MOL2格式。使用AutoDockTools 1.5.7對化合物進行加全氫,分配電荷,設置扭轉鍵處理,從而構建小分子配體庫。從PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載山楂葉抗T2DM的關鍵靶點的3D結構,將其導入PyMol軟件,去除水分子、溶劑和原配體,在AutoDockTools 1.5.7設置為受體,構建受體蛋白庫。采用AutoDock 4.2.6將受體蛋白和小分子配體進行半柔性對接,采用PyMol進行可視化展示。

1.8 交集靶點的組織分布及細胞內表達情況將山楂葉和T2DM的交集靶點導入BioGPS數據庫(http://biogps.org/#goto=welcome),篩選出表達量大于中位值和2倍中位值的糖尿病相關組織,通過Cytoscape 3.9.1構建靶點-組織分布網絡。將篩選出的關鍵組織所對應的基因逐個輸入到The Human Protein Atlas數據庫(https://www.proteinatlas.org/)中,整理分析其在關鍵組織的不同類型細胞中的表達情況。

2 結果

2.1 山楂葉活性成分及潛在靶點通過文獻收集、數據庫整理及SwissADME篩選,得到山楂葉化學成分130個,其中牡荊素、熊果酸和谷甾醇的胃腸道吸收“GI absorption=low”,但這三種化合物是山楂葉的重要成分且具有糖苷酶抑制作用[7-9],因此,將其納入研究范圍。通過Swiss Target Prediction數據庫預測得到622個山楂葉化學成分的潛在靶點,除去數據庫無法預測到靶點的成分及靶點概率“Probability<0.1”的成分,最終確定了92個活性成分,包括有機酸25個、維生素4個、氨基酸及含氮化合物13個、萜類12個、苯丙素類11個、黃酮類15個、其他醛酮酯類化合物及糖苷12個。

2.2 T2DM相關靶點及山楂葉抗T2DM潛在靶點利用DrugBank、TTD、GeneCards、CTD和OMIM數據庫檢索并去除重復文獻整理得到T2DM相關靶點2 033個。利用Venny 2.1.0繪制山楂葉潛在靶點和T2DM相關靶點的韋恩圖,得到306個交集靶點,將其作為山楂葉治療T2DM的潛在靶點,見圖1。

2.3 PPI網絡及山楂葉抗T2DM關鍵靶點將山楂葉抗T2DM的潛在靶點上傳至STRING平臺,設置物種為“Homo sapiens”且最低相互作用閾值為0.4,去除游離靶點,得到PPI網絡圖。將該圖導入Cytoscape 3.9.1軟件,根據“Betweenness”“Closeness”“Degree”值進一步篩選得到16個靶點,將其作為山楂葉抗T2DM的關鍵靶點。最終的關鍵靶點網絡圖中共有16個節點和117條邊,平均相鄰節點14.625,節點大小代表度值(Degree)大小。山楂葉治療T2DM的關鍵靶點篩選流程見圖2,關鍵靶點信息見表1。

圖1 山楂葉潛在靶點與T2DM相關靶點韋恩圖

圖2 山楂葉治療T2DM的關鍵靶點篩選流程圖

表1 山楂葉治療T2DM的關鍵靶點信息

2.4 活性成分-交集靶點網絡及核心成分將山楂葉活性成分和山楂葉-T2DM交集靶點導入Cytoscape 3.9.1軟件,根據“Betweenness”“Closeness”“Degree”值篩選得到28個核心成分,根據度值排序,節點度值越高的成分成為山楂葉抗T2DM關鍵成分的可能性越大,見表2。其中,黃酮類成分占46.4%,三萜占21.4%,有機酸占14.2%,苯丙素類占10.7%,酮及糖苷占7.3%。利用Cytoscape 3.9.1繪制活性成分-交集靶點網絡圖,見圖3。

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析通過DAVID6.8數據庫進行GO和KEGG富集分析,以P<0.05為標準篩選條目。結果顯示,GO功能富集分析得到835條生物學過程(biological process,BP),110條細胞組成(cellular component,CC)和213條分子功能(melucular function,MF),根據P值進行升序排序,排名前10位的條目,見圖4。其中,BP過程主要涉及對藥物的反應、凋亡過程的負調控、MAP激酶活性的正向調節、肽基酪氨酸磷酸化及蛋白質自磷酸化等。CC條目主要包括質膜、膜筏、受體復合物及胞質溶膠等。MF條目主要包括相同的蛋白質結合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、血紅素結合及ATP結合等。KEGG富集分析共得到170條通路,根據P值升序排序的前30條KEGG通路中,血糖調節相關通路包括HIF-1信號通路、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發癥中的作用、PI3K-Akt信號通路、FoxO信號通路、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信號通路、胰島素抵抗、胰島素信號通路、Rap1信號通路、Prolactin信號通路,將其作為山楂葉抗T2DM的關鍵通路,見圖5。經PPI篩選出的16個關鍵靶點中,14個靶點富集到了上述關鍵通路上,對應于27個核心成分,最后利用Cytoscape3.9.1軟件繪制“關鍵靶點-核心成分-關鍵通路”網絡圖,見圖6。

表2 山楂葉治療T2DM的核心成分信息

圖3 活性成分-交集靶點網絡圖

圖4 功能富集分析圖

2.6 關鍵靶點與核心成分的分子對接結果將14個關鍵靶點作為受體蛋白,與對應的27個核心成分進行分子對接,結果如表3所示。一般結合能小于-1.2 kcal·mol-1或者小于-5 kJ·mol-1被認為具有良好的結合活性,本研究的對接結果均滿足該條件。其中,山柰酚與AKT1、EGFR,常春藤素與IL-6,山楂酸與MAPK3,β-脫水淫羊藿與mTOR,柚皮素與SRC、VEGFA,(5E,9E)-法尼基丙酮與STAT3均具有較強的結合能力。以常春藤素、柚皮素、山柰酚為例,采用PyMol軟件將其與受體蛋白的結合情況進行可視化展示,見圖7。

圖5 KEGG通路富集分析圖

圖6 “關鍵靶點-核心成分-關鍵通路”網絡圖

表3 活性成分與關鍵靶點的分子對接

續表3 活性成分與關鍵靶點的分子對接

注:A:常春藤素和IL-6;B:柚皮素和SRC;C:山柰酚和EGFR。圖7 部分分子對接結果可視化展示

2.7 交集靶點在組織器官及細胞內分布情況通過BioGPS數據庫分析交集基因在組織中的分布情況,見表4。由大于中位值結果可知,富集基因數量排名前6的組織分別是甲狀腺、垂體、肝臟、心臟、胰島和肺;由大于2倍中位值結果可知,富集基因數量排名前6的組織分別是肺、全血、肝臟、結腸、甲狀腺和心臟。將大于中位值和2倍中位值結果中富集基因數量均排名前6的組織作為關鍵組織,包括肝臟、甲狀腺、心臟和肺,說明基因在這些組織中具有高表達情況。通過Cytoscape 3.9.1將2倍中位值結果中的200個基因與11個組織構建交集基因-組織分布網絡,見圖8。通過The Human Protein Atlas數據庫分析上述200個基因在關鍵組織的不同細胞中的表達情況,結果顯示在甲狀腺中,基因主要分布于甲狀腺腺細胞;在肝臟和肺部中,基因主要分布于肝細胞和肺泡細胞;在心臟中,基因主要分布于平滑肌細胞、巨噬細胞和漿細胞;在胰腺中,基因主要分布于內皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞和導管細胞中,見圖9。

圖8 交集基因-組織分布網絡圖

圖9 交集基因在不同細胞中的表達情況

表4 交集基因的組織分布情況

3 討論

本研究挖掘了山楂葉治療T2DM的活性成分,度值排名在前的包括α-亞麻酸、白楊素、芹菜素、柚皮素等。α-亞麻酸是一種脂肪酸,可改善小鼠血糖水平、葡萄糖耐量和胰島素抵抗指數[10],高劑量α-亞麻酸還可以改善肝臟組織炎癥。Canetti等[11]發現α-亞麻酸可通過減少胰腺損傷,降低血糖和胰島素水平,進而改善鏈脲佐菌素誘導的小鼠糖尿病。山楂葉提取物的降血糖活性與總黃酮含量呈正相關,說明黃酮類成分是影響其活性的主要因素[12]。芹菜素又稱芹黃素,是山楂葉總黃酮中的重要化合物之一。研究表明,二肽基肽酶Ⅳ會阻斷腸促胰島素的促胰島素分泌作用,導致胰島受到影響無法降低血糖,而芹菜素對二肽基肽酶Ⅳ具有抑制作用,從而降低血糖[13]。芹菜素還是良好的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑,且抑制能力與廣泛使用的抑制劑阿卡波糖相當[14]。Wang等[15]合成了芹菜素和白楊素一氧化氮供體衍生物,經體外評估后發現,該合成物具有比常見抑制劑阿卡波糖和1-脫氧野尻霉素更高的α-葡萄糖苷酶抑制能力。芹菜素在糖尿病并發癥方面也有良好作用,劉俊法[16]發現芹菜素能夠呈劑量依賴性地有效降低鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠血糖水平,減輕肝細胞損傷,對肝功能有改善和保護作用。此外,柚皮素可以顯著降低胰島素抵抗指數水平,改善糖耐量受損,提高超氧化物歧化酶活性[17]。

KEGG富集分析結果顯示,山楂葉治療T2DM的血糖調節相關通路有PI3K-Akt信號通路、胰島素抵抗、胰島素信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路、VEGF信號通路等。文獻報道表明,上述通路與胰島素信號傳導和炎癥因子轉錄有密切關系,因此,山楂葉可能通過胰島素信號傳導和炎癥反應兩個方面調控血糖。山楂葉活性成分可能通過啟動胰島素調控下的PI3K-Akt信號通路來激活胰島素信號通路及其他生物過程,如調節肝臟和肌肉中的糖異生,增加胰腺的胰島素分泌等[18]。胰島素和細胞膜外胰島素受體(insulin receptor,IR)結合,吸引胰島素受體底物和IR結合,胰島素信號由此傳導到細胞內,最終激活PI3K-Akt信號通路,而被激活的AKT可磷酸化各種底物如糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、叉頭框蛋白O1(forkhead boxprotein O1,FoxO1)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)等[19]。抑制GSK-3β可保護糖尿病大鼠肝臟,降低血糖水平,且其對葡萄糖穩態的積極作用與二甲雙胍相當[20]。FoxO1的乙?；龠M糖異生相關基因表達,去乙?；龠M對胰島β細胞有重要作用的基因表達[21]。mTOR的兩種復合物mTORC1和mTORC2分別調控著胰島細胞的正常功能和肝臟糖脂代謝[22-23]。PI3K-Akt通路激活還可以促進缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible faftor-1,HIF-1)產生,誘導肝葡萄糖激酶表達[24],進而激活VEGF信號通路和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)等糖酵解途徑中的關鍵酶[25]。另一方面,山楂葉活性成分可能通過胰島素抵抗通路調控炎癥因子,進而改善血糖水平。在胰島素抵抗通路中,高血糖狀態會激活腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF),從而啟動核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)蛋白,NF-κB進一步啟動炎癥因子IL-6和TNF的轉錄。T2DM中炎癥因子會轉變為促炎因子,干擾外周組織胰島素信號傳導或誘導β細胞功能障礙,最終導致胰島素缺乏[26]。由此可知,炎癥因子對于調節胰島素和血糖水平具有重要作用。研究發現,在T2DM患者的血清中IL-6水平升高[27],因此IL-6與T2DM有密切關系。IL-6的兩種轉導方式即經典受體信號轉導和反式信號轉導都與血糖關系密切,前者控制著葡萄糖代謝和神經內分泌系統的調節,后者可通過結合受體來激活炎癥信號轉導途徑[28]。不僅如此,IL-6可通過部分抵消胰島素抵抗和巨噬細胞轉變,從而緩解炎癥[29]。短期抗TNF-α mAb治療可防止胰島β細胞破壞,恢復胰島素敏感性和正常血糖水平[30]。因此,山楂葉活性成分可能通過調控 IL-6 和TNF緩解炎癥從而降低血糖。另外,山楂葉不僅可以防治糖尿病及其并發癥[31-32],而且能夠誘導癌細胞凋亡[33],KEGG富集分析的前30條通路中關于癌癥的條目也較多,因此山楂葉抗T2DM具有巨大的治療潛能和開發價值。

肝臟通過糖異生和糖原合成來維持血糖平衡,肝細胞占肝臟體積的80%,負責大部分的代謝過程,因此肝細胞功能失調會產生一系列負面影響。組織分布結果顯示,肝臟在兩種中位值篩選中均排名前3,說明交集基因在肝臟中具有高表達情況。山楂葉核心成分(如α-亞麻酸、芹菜素等)對肝細胞有保護作用,且T2DM炎癥部位也聚集在肝臟,加之關鍵通路(如PI3K-Akt信號通路)及關鍵靶點(如IL-6、TNF、HIF-1α等)在肝臟治療中也展現了良好效果,因此,肝臟可能是山楂葉調控血糖的關鍵組織之一。

本文基于網絡藥理學和分子對接技術預測了山楂葉治療T2DM的活性成分、潛在靶點、關鍵通路及生物學功能,初步探討了山楂葉通過多成分、多靶點、多通路、多組織等途徑調節血糖的作用機制,但本研究結論仍有待通過藥理學實驗進一步驗證。