外周血NK 細(xì)胞與原發(fā)免疫性血小板減少癥相關(guān)性的Meta 分析

李曉靖，周永明，李 洋，朱文偉

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院血液科，上海 200437）

原發(fā)免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）是一種獲得性自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)主要為無癥狀血小板減少或輕度的皮膚和粘膜出血，嚴(yán)重者出現(xiàn)顱內(nèi)或內(nèi)臟出血等[1]。ITP的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，多由于免疫介導(dǎo)的血小板破壞增多或血小板生成不足，并涉及體液免疫和細(xì)胞免疫。自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞作為機(jī)體關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，主要介導(dǎo)固有免疫應(yīng)答，參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）等多個(gè)自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展，并且在ITP 的發(fā)病中發(fā)揮至關(guān)重要作用[2-4]。NK 細(xì)胞可以介導(dǎo)機(jī)體免疫細(xì)胞的吞噬功能及細(xì)胞毒性作用，參與調(diào)控多個(gè)免疫細(xì)胞，對(duì)B 細(xì)胞的增殖、分化具有抑制作用，減少自身抗體的產(chǎn)生，并且NK 細(xì)胞能夠促進(jìn)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的分化，恢復(fù)或者重建機(jī)體免疫耐受，進(jìn)而減少血小板的破壞[5，6]。NK 細(xì)胞通過調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞，致使血小板破壞，參與ITP 的發(fā)病。目前有較多的關(guān)于外周血NK 細(xì)胞與ITP 相關(guān)性的研究，但是兩者之間的相關(guān)性尚缺乏系統(tǒng)評(píng)價(jià)。因此，本研究通過Meta 分析的方法收集所有相關(guān)研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)性分析，旨在為今后的研究提供更可靠的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 檢索策略 本Meta 分析研究遵循PRISMA（Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analysis）規(guī)范進(jìn)行[7]。文獻(xiàn)檢索數(shù)據(jù)庫選擇PubMed、Springer Link、OVID、中國期刊全文數(shù)據(jù)庫（CNKI）、維普中文科技期刊全文數(shù)據(jù)庫（VIP）、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)服務(wù)系統(tǒng)（Sino Med）、萬方醫(yī)藥期刊數(shù)據(jù)庫（WAN FANG）等。中文檢索詞為：“免疫性血小板減少癥”“免疫性血小板減少性紫癜”“特發(fā)性血小板減少性紫癜”和“NK 細(xì)胞”“自然殺傷細(xì)胞”，各自以不同兩者配對(duì)使用；英文檢索詞為：“immune thrombocytopenia”“ITP”“thrombocytopenic purpura”“idiopathic thrombocytopenic purpura”“immune thrombocytopenic purpura”and “natural killer cell”“NK”，各自以不同兩者配對(duì)使用。檢索時(shí)間為建庫至2022 年11 月7 日，檢索語言不限制。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①研究設(shè)計(jì)類型為病例對(duì)照研究；②納入患者被確診為ITP 的患者，符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國指南（2020 年版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)，性別不限，年齡為18 歲以上；③涉及檢測外周血NK 細(xì)胞水平的研究，原文獻(xiàn)研究當(dāng)中的NK 細(xì)胞表達(dá)情況用均值和標(biāo)準(zhǔn)差的形式來表示；④原始文獻(xiàn)為公開發(fā)表文獻(xiàn)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①重復(fù)發(fā)表或針對(duì)同一研究對(duì)象的多個(gè)文獻(xiàn)，則納入其中質(zhì)量最好的或樣本量最大的；②納入研究的樣本量小于10 或者樣本量不詳?shù)奈墨I(xiàn)；③數(shù)據(jù)不完整，無法獲取原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的文獻(xiàn)；④動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究類文獻(xiàn)；⑤無法獲取原文的文獻(xiàn)；⑥會(huì)議論文、學(xué)位論文；⑦綜述文獻(xiàn)。

1.3 數(shù)據(jù)提取與整理 由2 名研究者獨(dú)立對(duì)納入的文獻(xiàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)提取、整理和質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)果不同時(shí)經(jīng)商討決定，商討意見不能統(tǒng)一時(shí)，請(qǐng)?jiān)撗芯款I(lǐng)域較權(quán)威的專家進(jìn)行判定。文獻(xiàn)提取的內(nèi)容包括：作者、發(fā)表時(shí)間、樣本量、實(shí)驗(yàn)組NK 細(xì)胞水平、對(duì)照組NK細(xì)胞水平。

1.4 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià) 使用Cochrane 協(xié)作網(wǎng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具進(jìn)行文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)，2 位研究者獨(dú)立地對(duì)所納入文獻(xiàn)的隨機(jī)分配產(chǎn)生方法、分配方案隱藏、盲法、數(shù)據(jù)完整性、選擇性報(bào)告、其他偏倚分別進(jìn)行評(píng)價(jià)，以上內(nèi)容采用低風(fēng)險(xiǎn)（low risk）、高風(fēng)險(xiǎn)（high risk）、風(fēng)險(xiǎn)情況不詳（unclear risk）方法進(jìn)行判定；若在評(píng)判過程中兩位研究者的意見產(chǎn)生歧義，則由雙方協(xié)商討論或者由第3 位專家參與評(píng)判解決。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用統(tǒng)計(jì)軟件ReviewManager 5.3進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)于文獻(xiàn)中的連續(xù)性資料外周血NK 細(xì)胞水平統(tǒng)一采用均數(shù)差（mean difference，MD）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）為療效分析統(tǒng)計(jì)量，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析文獻(xiàn)異質(zhì)性，差異性水平以P=0.1 為閾值，P＜0.1 則存在異質(zhì)性，同時(shí)應(yīng)用I2值檢驗(yàn)異質(zhì)性大小，I2≥50%采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析；以I2＜50%采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析。通過Deek's 漏斗圖，評(píng)估潛在的發(fā)表偏倚，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果 本研究共檢索到808 篇關(guān)于ITP與NK 細(xì)胞關(guān)系的文獻(xiàn)，經(jīng)過查重后，排除重復(fù)文獻(xiàn)537 篇，然后閱讀標(biāo)題及摘要，排除非病例對(duì)照研究文章、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、綜述文獻(xiàn)與主題明顯不相符的文獻(xiàn)，剩余文獻(xiàn)閱讀全文，排除無法獲取原文的文獻(xiàn)、無完整數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)，最終納入7 篇，其中中文5 篇、英文2 篇。文獻(xiàn)檢索流程及結(jié)果見圖1。

圖1 文獻(xiàn)檢索流程及結(jié)果

2.2 納入文獻(xiàn)基本特征 研究共納入發(fā)表年份在2006-2018 年間的7 篇文獻(xiàn)，共納入514 例研究對(duì)象，其中樣本量最少18 例，最多64 例，7 項(xiàng)研究的對(duì)照組均選自體檢中心的健康人群，分別抽取晨起ITP患者和健康對(duì)照者的外周靜脈血于抗凝采血管中，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。納入文獻(xiàn)基本特征見表1。

表1 納入文獻(xiàn)基本特征

2.3 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果 本次所納入的文獻(xiàn)研究總體質(zhì)量較好，所有文獻(xiàn)均未提及隨機(jī)分組方法以及分配方案隱藏，判定為風(fēng)險(xiǎn)情況不確定，并且未說明盲法使用情況，亦判定為風(fēng)險(xiǎn)情況不確定，所有文獻(xiàn)結(jié)果資料均具有完整性，選擇性報(bào)告未發(fā)現(xiàn)偏倚情況，判定為低風(fēng)險(xiǎn)。未發(fā)現(xiàn)有其他偏倚情況，全部判定為低風(fēng)險(xiǎn)，見圖2、圖3。

圖2 納入文獻(xiàn)偏倚風(fēng)險(xiǎn)圖

圖3 納入文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)圖

2.4 Meta 分析結(jié)果 在此次ITP 組與對(duì)照組外周血NK 細(xì)胞表達(dá)水平比較分析中，共納入7 項(xiàng)研究，包含英文2 篇，中文5 篇，共有514 例研究對(duì)象，其中ITP 組302 例，對(duì)照組212 例。異質(zhì)性檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示各個(gè)研究之間存在異質(zhì)性（P＜0.000 01，I2=90%），故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析，結(jié)果顯示ITP 組外周血NK 細(xì)胞表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（MD=-5.58，95%CI：-8.00～-3.15，P＜0.000 01），提示外周血NK 細(xì)胞水平與ITP 之間有顯著的相關(guān)性，見圖4。在7 項(xiàng)研究中，ITP 的分型不同，因此進(jìn)一步根據(jù)新診斷ITP進(jìn)行亞組分析，異質(zhì)性檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示各研究之間存在異質(zhì)性（P＜0.000 01，I2=94%），故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析，結(jié)果顯示新診斷ITP 患者的外周血NK 細(xì)胞表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（MD=-4.89，95%CI：-9.39～-0.39，P=0.03），提示外周血NK 細(xì)胞水平與新診斷ITP 之間存在明顯相關(guān)性，見圖5。

圖4 外周血NK 細(xì)胞水平與ITP 關(guān)系的森林圖

圖5 外周血NK 細(xì)胞水平與新診斷ITP 關(guān)系的森林圖

2.5 偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 通過RevMan 5.3 對(duì)NK 細(xì)胞表達(dá)水平與ITP 相關(guān)性生成漏斗圖，納入的研究在上下部分各有一個(gè)散點(diǎn)，其余散點(diǎn)在中線兩側(cè)的分布對(duì)稱度較好，提示文獻(xiàn)尚不存在明顯的發(fā)表偏倚，見圖6。

圖6 外周血NK 細(xì)胞水平與ITP 關(guān)系的漏斗圖

3 討論

本研究共納入7 篇文獻(xiàn)研究NK 細(xì)胞在ITP 的表達(dá)情況，文獻(xiàn)以外周血NK 細(xì)胞表達(dá)水平為結(jié)局指標(biāo)。對(duì)納入的文獻(xiàn)進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)7 個(gè)研究之間存在明顯的異質(zhì)性（I2=90%），在新診斷ITP 亞群中具有異質(zhì)性（I2=94%），故均采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究結(jié)果顯示免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞NK 細(xì)胞在ITP 患者外周血中低于對(duì)照組，同時(shí)亞群結(jié)果表明新診斷ITP 亞群研究中患者的外周血NK 細(xì)胞表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步提示了NK 細(xì)胞在ITP 的發(fā)病中可能發(fā)揮著重要的作用，調(diào)控異常的NK 細(xì)胞可能成為ITP 新的潛在治療靶點(diǎn)。

較多研究發(fā)現(xiàn)，ITP 患者體內(nèi)NK 細(xì)胞表達(dá)水平較正常者存在著顯著差異。在新診斷的ITP 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中，NK 細(xì)胞比例顯著低于正常對(duì)照組，而且ITP 患者經(jīng)過潑尼松治療后，體內(nèi)NK 細(xì)胞水平明顯增加，同時(shí)炎性細(xì)胞因子TNF-α 及IL-6 表達(dá)減低，血小板計(jì)數(shù)顯著增加[15，16]。相關(guān)臨床研究表明，CD16+CD56+NK 細(xì)胞在ITP 患兒外周血中比例較健康者明顯減低，尤其為急性ITP 患兒，NK 細(xì)胞表達(dá)下降與ITP 患兒發(fā)病具有一定聯(lián)系；同時(shí)，ITP成人患者脾臟中NK 細(xì)胞在自然細(xì)胞毒性條件下功能減低[17-20]。NK 細(xì)胞為機(jī)體淋巴細(xì)胞，調(diào)控固有免疫反應(yīng)，多個(gè)細(xì)胞因子如IL-2、IL-12、IL-15 及IL-18 等可影響NK 細(xì)胞活性[21]。NK 及其分泌的細(xì)胞因子通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及其細(xì)胞毒性作用調(diào)控免疫應(yīng)答，參與SLE、RA、潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）、多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）等多個(gè)自身免疫性疾病的發(fā)病[22-25]。作為機(jī)體關(guān)鍵的免疫調(diào)控細(xì)胞，NK 細(xì)胞通過調(diào)控多個(gè)免疫細(xì)胞，如能夠抑制B 細(xì)胞的活化，減少自身抗體，并且能夠促進(jìn)Treg 細(xì)胞的分化，抑制炎性因子的分泌，進(jìn)而減少血小板的破壞[5，6]。NK 細(xì)胞失調(diào)在ITP 的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。

ITP 是一類常見的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)具有一定的異質(zhì)性。并且ITP 的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，主要是由于機(jī)體免疫耐受機(jī)能喪失，激發(fā)異常的免疫反應(yīng)，抗血小板自身抗體生成增多，致使血小板破壞增多、生成不足[4]。T、B 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞在ITP 免疫耐受失調(diào)中具有重要作用，其中B 細(xì)胞增殖、分化異常上調(diào)，產(chǎn)生自身特異性抗血小板抗體，識(shí)別血小板為自身抗原進(jìn)而破壞；另外，Treg 細(xì)胞為T 淋巴細(xì)胞的重要部分，具有抑制機(jī)體免疫反應(yīng)、控制免疫過度反應(yīng)的作用，為維持免疫穩(wěn)態(tài)與免疫耐受重要的調(diào)控因子，可根據(jù)炎性刺激，分泌相關(guān)抑炎因子且抑制自身反應(yīng)性T 細(xì)胞分化與增殖[26]。而Treg 細(xì)胞數(shù)量及功能減低，導(dǎo)致機(jī)體免疫失耐受，促進(jìn)免疫反應(yīng)，血小板破壞增多，致使ITP 發(fā)病[27-29]。NK 細(xì)胞為機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可分泌細(xì)胞因子干擾素-γ（interferon-γ，INF-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，激活后可抑制體內(nèi)免疫反應(yīng)，然而NK 細(xì)胞數(shù)量及功能下調(diào)，則與其他免疫細(xì)胞相互作用失調(diào)，對(duì)B 細(xì)胞分化的抑制能力、Treg 細(xì)胞的促進(jìn)作用降低，致使機(jī)體免疫失耐受，破壞血小板，參與ITP 的發(fā)病[30，31]。黃枝寧[11]在相關(guān)臨床研究中表明，NK 細(xì)胞數(shù)量、活性減低，對(duì)B 細(xì)胞增殖的抑制作用下降，B 細(xì)胞異常激活發(fā)生體液免疫而致使ITP 發(fā)病。由此得出，NK 細(xì)胞與ITP 發(fā)病關(guān)系密切。

然而本Meta 分析仍存在諸多不足，納入的7 篇文獻(xiàn)中研究對(duì)象的樣本量相對(duì)不足，影響研究質(zhì)量。臨床研究所納入的ITP 患者疾病的類型、病程未明確，對(duì)照組多為體檢中心健康人群，易混淆其他疾病人群，因此在合并研究資料時(shí)，則存在結(jié)局指標(biāo)異質(zhì)性偏大的問題。為此，未來需要更多的足夠樣本量及高質(zhì)量的臨床研究，探究NK 細(xì)胞與ITP 疾病之間的相關(guān)性，以便提供更高價(jià)值的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

綜上所述，本Meta 分析發(fā)現(xiàn)外周血NK 細(xì)胞表達(dá)水平與ITP 之間具有密切的相關(guān)性，靶向異常的NK 細(xì)胞可能對(duì)ITP 的發(fā)生、發(fā)展具有影響，為今后深入探究ITP 的發(fā)病機(jī)制以及治療方案提供了理論基礎(chǔ)。