miR-660-5p 靶向TET2 促進乳腺癌的增殖、遷移和侵襲

張秀娟，何莉莉，田 蜜，李 新

（1.復旦大學附屬華東醫院普外科，上海 200040；2.荊門市人民醫院甲乳外科，湖北 荊門 448000；3.荊門市公安局法醫鑒定中心，湖北 荊門 448000）

乳腺癌（breast cancer，BC）是女性中常見的高危惡性腫瘤，轉移是乳腺癌患者死亡的常見原因。microRNA 是一類非編碼RNA，長度為18～25 個核苷酸，參與許多癌癥的發生和發展[1]，通過在轉錄后水平上調節基因的表達來發揮功能[2，3]。miRNA 的異常表達可以作為多種癌癥的診斷指標和預后生物標志物[4]，miR-660-5p 與乳腺癌細胞的增殖，遷移和侵襲密切相關[5]。TET（ten-eleven translocation）蛋白家族是一類雙加氧酶，包括3 個成員（TET1，TET2和TET3）[6，7]。TET2 在癌癥中起抑制作用[8]，可促進乳腺癌的進展。PI3K/AKT/PKB/mTOR 信號通路與細胞分化，增殖和凋亡密切相關[9-11]，TET2 調節PI3K/AKT 通路促進冠心病進展[12]，TET1 通過PI3K/AKT通路參與生殖衰老過程[13]。最近的研究表明[14-16]，抑制PI3K/AKT/mTOR 信號傳導是治療乳腺癌的有效方法，但目前尚未闡明TET 與PI3K/AKT/mTOR 信號通路在乳腺癌中的作用機制。為此，本研究擬探索miR-660-5p/TET2 通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路調節乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的調控機制，為乳腺癌的治療提供新的靶點和依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2021 年1 月-2022 年6 月荊門市人民醫院65 例從未在接受過化學、放療或其他治療的乳腺癌患者，獲取65 組乳腺癌組織和鄰近的正常組織樣品。獲取組織后立即保存在-80 ℃冰箱中。本研究得到荊門市人民醫院倫理委員會的批準，所有患者在進行根治性切除術之前均簽署知情同意書。

1.2 細胞培養 人乳腺癌上皮細胞系MCF-10A 和人乳腺癌細胞系MCF-7 和MDA-MB-231 均獲自美國典型培養物保藏中心（ATCC，USA）。MCF-10A 細胞系用專用培養基培養（CM-0525）。10%胎牛血清的DMEM（Gibco）用于培養乳腺癌細胞系。所有細胞系均在37 ℃的5%CO2培養箱中培養。

1.3 細胞轉染 TET2 特異性小分子干擾RNA（si-TET2），陰性對照（negative control，si-NC），TET2 過表達質粒（NCBI 參考序列 ：NM_001127208.3）和空載體（vector）是從上海GenePharma 公司購買。miR-660-5p mimic，mimic NC，miR-660-5p inhibitor 和inhibitor NC 購自廣州Ribobio 公司。轉染時使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）進行轉染。

1.4 qRT-PCR 使用TRIzol 溶液（Invitrogen）提取細胞總RNA 樣品。逆轉錄使用M-MLV 逆轉錄酶試劑盒（Invitrogen）和All-in-OneTMmiRNA First Stand cDNA 合成試劑盒（GeneCopoeia）進行。下面列出了從GeneCopoeia 購買的特殊引物。SYBR Premix TaqTMⅡ試劑盒（Takara）用于PCR 反應。通過2-ΔΔCt方法分析了miR-660-5p（以U6 為內參）和TET2（以GAPDH 為內參）的表達量[17]。miR-660-5p（正向，5'-TACCCATTGCATATCGGAGTTG-3'；反向，通用引物），TET2（正向，5'-GGACTGAGCTGCTGAATTCAACT-3'；反向，5'-CCTCAACATGGTTGGTTCTATCC-3'），U6（正 向，5 ' -CTCGCTTCGGCAGCACA -3'；反 向，5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'）和GAPDH（正向，5'-CTGGGCTACACTGAGCACC -3'；反向，5' -AAGTGG TCGTTGAGGGCAATG-3'）。

1.5 Cell counting kit-8（CCK8）CCK8 試劑盒（Sigma）用于分析乳腺癌細胞的增殖能力。將乳腺癌細胞（5000 個細胞/孔）接種到96 孔板中過夜。轉染24 h后，將10 μl CCK8 溶液與乳腺癌細胞在室溫下孵育2 h。使用酶標儀測量在450 nm 下吸光度值。

1.6 流式細胞術 將乳腺癌細胞（3×105細胞/孔）鋪板到6 孔板中過夜。轉染72 h 后，使用冷磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗乳腺癌細胞兩次。乳腺癌細胞同時用5 μl Annexin V 組合的FITC 和PI（Solarbio）染色，以標記磷脂酰絲氨酸（PS）和DNA 含量。流式細胞儀用于區分早期（FITC+/PI-）和晚期凋亡細胞（FITC+/PI+）與正常和壞死細胞。

1.7 細胞遷移和侵襲 8 μmol/L 的Transwell 小室（Corning）用于Transwell 遷移和侵襲實驗。在Transwell 遷移實驗中，轉染24 h 后，將乳腺癌細胞（1×104細胞/100 μl 無血清培養基）接種到上室中，下室加入500 μl 完全培養基。24 h 后，用4%多聚甲醛（Sangon Biotech）固定20 min，并用結晶紫（Sangon Biotech）染色10 min。對5 個隨機視野中遷移的乳腺癌細胞的數量進行計數并取平均值。在侵襲試驗中，將40 μl BD Matrigel 基質在1∶8 的比例稀釋，再接種乳腺癌細胞，其余步驟與遷移相同。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗 TET2 的3'UTR 中的部分序列（基因ID：54790；3'UTR 1502 位點至1914位；413bp），克隆到pmirGLO 載體（Promega）中以構建TET2 WT 或TET2 MUT。在24 孔板中的乳腺癌細胞中轉染10 nmol/L miR-660-5p mimic 或mimic NC 和40 ng TET2 WT 或TET2 MUT。轉染48 h 后，用雙熒光素酶報告基因試劑盒（Promega）和酶標儀（Plate Chameleon V）測量熒光素酶活性。海腎熒光素酶活性作為對照。

1.9 Western blot 乳腺癌細胞用RIPA 裂解液（Beyotime）裂解。通過SDS-PAGE 凝膠分離蛋白質樣品。將蛋白質轉移到PVDF 膜（millipore）上。封閉1 h 后，用以下抗體TET2（ab94580，Abcam），GAPDH（ab37168，Abcam），p-AKT（T308，ab38449，Abcam），AKT（ab8805，Abcam），p-mTOR（ab109268，Abcam）或mTOR（ab2732，Abcam）孵育過夜，HRP 結合的二抗（ab6721，Abcam）孵育1 h。用增強的化學發光（ECL）系統分析蛋白質條帶的強度。

1.10 小鼠異種移植實驗 裸鼠異種移植實驗得到荊門市人民醫院動物研究委員會的批準。使用miR-660-5p inhibitor 或inhibitor NC 轉染MCF-7 細胞或未轉染的MCF-7 細胞建立腫瘤異種移植模型。將上述MCF-7 細胞（2×106細胞/200 μl PBS）皮下注射到裸鼠（n=5）背部的右側，每周測量一次腫瘤體積。4 周后，處死裸鼠，記錄腫瘤的重量。取腫瘤用于檢測miR-660-5p，TET2 的表達水平以及PI3K/AKT/mTOR 信號通路蛋白的表達水平。

1.11 統計學方法 每個實驗至少重復3 次以上。所有統計數據以（±s）表示，使用t檢驗和單向方差分析（ANOVA）。Kaplan-Meier 生存分析采用Log-rank檢驗方法，主要檢測乳腺癌患者長期生存率。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-660-5p 在乳腺癌組織中的表達情況qPCR 實驗發現，miR-660-5p 在乳腺癌組織中表達高于癌旁組織（圖1A）；miR-660-5p 高表達的患者存活率降低（圖1B）。正常人乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中miR-660-5p 也上調（圖1C）。單因素分析顯示，miR-660-5p 的表達與年齡、腫瘤大小和分化沒有明顯的相關性，而與淋巴結轉移、臨床TNM 分期和血管浸潤有關，見表1。

表1 乳腺癌患者中miR-660-5p 的表達水平[n（%）]

圖1 miR-660-5p 在乳腺癌組織中的表達情況

2.2 miR-660-5p inhibitor 對乳腺癌細胞的影響miR-660-5p inhibitor 可以顯著抑制miR-660-5p 的表達（圖2A、圖2B）。CCK8 實驗顯示，乳腺癌細胞中inhibitor 可以抑制乳腺癌細胞的增殖（圖2C、圖2D）。miR-660-5p inhibitor 還可以加速細胞的凋亡（圖2E）。miR-660-5p inhibitor 可以明顯抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲（圖2F～圖2I）。

2.3 TET2 是miR-660-5p 的直接靶標 TargetScan軟件預測下游靶基因，根據其序列構建雙熒光素酶質粒（圖3A），雙熒光素酶報告基因實驗發現miR-660-5p mimic 可明顯降低熒光素酶活性（圖3B、圖3C）。蛋白質印跡發現miR-660-5p mimic可以降低TET2 蛋白的表達水平，inhibitor 可以增加TET2 蛋白的表達（圖3D、圖3E）。乳腺癌細胞和組織中TET2 的表達水平都較正常乳腺上皮細胞低（圖3F、圖3G）；TET2 的表達與miR-660-5p 的表達呈負相關（圖3H）。

圖3 TET2 是miR-660-5p 的直接靶標

2.4 過表達TET2 抑制乳腺癌細胞的生長、遷移和侵襲 實驗構建成功表達oeTET2 的質粒（圖4A、圖4B）。過表達TET2 可以降低乳腺癌細胞的增殖能力（圖4C、圖4D），細胞凋亡顯著增加（圖4E），抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲（圖4F、圖4G）。

圖4 過表達TET2 抑制乳腺癌細胞的生長、遷移和侵襲

2.5 干擾TET2 抑制miR-660-5p inhibitor 介導乳腺癌的增殖、遷移和侵襲 si-TET2 抑制miR-660-5p inhibitor 引起上調的TET2 蛋白（圖5A）、細胞增殖（圖5B、圖5C）和細胞凋亡（圖5D）；si-TET2 部分挽救被miR-660-5p inhibitor 所抑制的細胞遷移和侵襲（圖5E、圖5F）。

圖5 干擾TET2 抑制miR-660-5p inhibitor 介導乳腺癌的增殖、遷移和侵襲

2.6 miR-660-5p 靶向TET2 參與乳腺癌細胞的分化miR-660-5p inhibitor 抑制N-cadherin 的表達，si-TET2 部分恢復N-cadherin 的蛋白質表達；而E-cadherin 的表達與N-cadherin 呈相反的趨勢（圖6A、圖6B）。

2.7 miR-660-5p 下調TET2 并激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路 miR-660-5p inhibitor 下調AKT和mTOR 的磷酸化水平，總的AKT 和mTOR 蛋白表達沒有變化，而si-TET2 部分挽救AKT 和mTOR的磷酸化（圖7A、圖7B）。

圖7 干擾TET2 抑制miR-660-5p inhibitor 介導PI3K/AKT/mTOR 信號傳導

2.8 miR-660-5p inhibitor 抑制體內腫瘤生長 miR-660-5p inhibitor 的腫瘤體積和重量均低于inhibitor NC 和對照組（圖8A、圖8B）。miR-660-5p 表達也明顯下降（圖8C），而TET2 蛋白的表達明顯上調（圖8D）。miR-660-5p inhibitor 中AKT 和mTOR 的磷酸化水平也顯著降低（圖8E）。

圖8 miR-660-5p inhibitor 抑制體內乳腺癌腫瘤生長

3 討論

乳腺癌是女性中常見的高危惡性腫瘤，轉移是乳腺癌患者死亡的常見原因。因此，研究乳腺癌的發病機制對于乳腺癌的治療至關重要。miR-660-5p和TET2 在乳腺癌中有重要的作用，但具體調節機制不清。本研究發現，miR-660-5p 可以靶向結合TET2，激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路傳導介導乳腺癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲，可能是治療乳腺癌新的潛在靶標。

miRNA 失調與癌癥的發生和發展有關[18，19]。miRNA 作為癌基因或抑癌基因，可抑制與增殖、凋亡、遷移、侵襲和分化有關的下游基因的表達，從而調節細胞的生物學過程[20]。在許多類型的癌癥中，miR-660-5p 的表達均升高。miR-660-5p 在乳腺癌細胞中上調，并通過靶向轉錄因子CP2（TFCP2）促進乳腺癌細胞的增殖和轉移[21]。miR-660-5p 在骨肉瘤中過表達，并且通過下調FOXO1 促進骨肉瘤細胞的增殖和侵襲[22]。非小細胞肺癌（NSCLC）患者的血漿和外泌體中miR-660-5p 的表達增加，而miR-660-5p 可能通過降低KLF9 的表達來促進NSCLC細胞的增殖和轉移[23]。抑制miR-660-5p 的表達可抑制乳腺癌細胞的進展[21]。本研究中，乳腺癌組織中miR-660-5p 的富集程度更高，且miR-660-5p 表達的增加與淋巴結轉移，晚期TNM 分期和血管浸潤以及預后不良密切相關。在乳腺癌細胞中干擾miR-660-5p 可以抑制細胞的生長和轉移并促進了細胞凋亡，而miR-660-5p 在乳腺癌中的致癌作用與先前的研究報道一致[21]。但是，miR-660-5p 介導乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的機制仍不清楚。轉錄因子CP2（TFCP2）是miR-660-5p 的靶標，而miR-660-5p 通過靶向TFCP2 促進了乳腺癌的發展[21]。在本研究中，通過TargetScan 軟件預測了miR-660-5p 的另一個靶標TET2，雙熒光素酶報告基因檢測驗證了miR-660-5p 與TET2 之間的靶向關系，在MCF-7 和MDA-MB-231 細胞中，miR-660-5p 對TET2 的表達有負調節作用。

TET2 是TET 雙加氧酶家族的成員，也稱為DNA 脫甲基酶。TET2 的突變或抑制通過增強腫瘤抑制基因的甲基化水平并下調其表達水平來促進腫瘤發生。TET2 的突變與血液系統惡性腫瘤的發生密切相關[24]。干擾TET2 促進了前列腺癌細胞的增殖和遷移[25]。抑制TET2 促進了乳腺癌的發展[26，27]。本研究表明，TET2 的上調抑制了乳腺癌細胞的生長、遷移和侵襲，但誘導了細胞凋亡。敲低TET2 可部分抵消miR-660-5p inhibitor 對乳腺癌細胞惡性行為的抑制作用。

在乳腺癌中經常發現PI3K/AKT/mTOR 信號通路的異常激活或突變[28]。有許多研究報道了乳腺癌中使用PI3K/AKT/mTOR 信號通路的抑制劑，可以改善患者的預后[29-32]。而干擾TET2 可以減輕由抑制miR-660-5p 引起的p-AKT 和p-mTOR 下調的磷酸化水平。

綜上所述，miR-660-5p 在乳腺癌中有致癌作用。miR-660-5p 通過下調TET2 激活PI3K/AKT/mTOR 信號傳導，從而促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制其凋亡。因此，miR-660-5p/TET2 軸可能是乳腺癌治療的潛在靶標。