PKCδ 與MALT1 對HIV-TB 共感患者細胞免疫應答的作用

李邦躍，李 黎，鐘雪梅，鄒小廣

（1.新疆醫科大學第三臨床醫學院，新疆 烏魯木齊 830000；2.喀什地區第一人民醫院呼吸與危重癥醫學科，新疆 喀什 844000）

艾滋病（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）是一種具有高傳染率、高死亡率的疾病，會導致人體失去免疫功能，目前尚無有效的疫苗和治療方法。結核病（tuberculosis，TB）是人類免疫缺陷病毒（HIV）/艾滋病（AIDS）患者最常見的機會性感染和死亡的主要原因之一[1]，約1/3 的HIV/AIDS 患者合并有結核菌感染，HIV/AIDS 患者感染結核菌后發展成為活動性結核病的概率是非艾滋病毒感染者的30 倍[2]。艾滋病與結核病雙重感染時，患者免疫功能缺陷加速病情惡化，死亡率極高，是臨床診療工作的重點和難點，也是全球公共衛生的挑戰。近年研究發現[3]，HIV-TB 共感患者外周血IL-17、TNF-α、IL-23、IFN-γ 等促炎性因子表達異常，IL-10、IL-22 等抗炎性細胞因子的表達水平與單一感染患者有明顯差異。但有關于HIV-TB 共感患者體內相關細胞因子異常表達的機制目前尚未十分清楚。國外研究發現[4]，PKCδ 是一種抑制HIV-1 整合的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），其抑制劑已被設計用于治療自身免疫性疾病，在初次感染期間聯合使用這些抑制劑和高效的抗逆轉錄病毒治療，有助于避免大規模病毒感染和從受感染的CD4+T 細胞復制，在感染的早期階段減小儲存庫的大小。同時研究發現活動性肺結核患者全血中PKCδ 表達明顯上調，PKCδ 在結核肉芽腫的壞死區和空洞區高度豐富[5]。PKC可以通過CCR5 和gp120 之間的相互作用受到刺激[6]，這種激活有助于HIV-1 在其復制周期的不同步驟（包括進入、整合和基因表達）進行復制[7，8]。然而，PKCδ 在HIV-TB 共感染患者中的作用尚未見明確報道。而黏膜相關淋巴組織淋巴瘤異位基因1（mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1，MALT1）有助于穩定狀態下的免疫耐受，同時促進應激條件下的免疫反應[9]。研究表明[10]，在HIV 潛伏感染的ACH-2、Jurkat E4 和J-LAT 細胞中加入MALT1 抑制劑MI-2，可以在細胞刺激或蛋白激酶C 激動劑bryostatin 1 存在下加速細胞死亡，說明MI-2 和Bryostatin 1 的結合對HIV 潛伏感染的CD4+T 細胞具有選擇性殺傷作用。但是，MALT1 在HIV-TB 共感染患者疾病發生發展中的作用尚未見報道。因此，本研究通過使用PKCδ 抑制劑和MALT1 抑制劑，觀察PKCδ 抑制劑和MALT1 抑制劑對HIV-TB 感染者細胞免疫應答的影響，探討HIV/TB 雙重感染中PKCδ 和MALT1 的作用，對進一步闡明HIV/TB 雙重感染的發病機制以及防治具有十分重要的理論和實際應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021 年6 月-2022 年8 月喀什地區第一人民醫院收治的4 例HIV-TB 共感患者。HIV-TB 患者納入標準：既滿足TB 的診斷標準：滿足以下任何一條，痰查抗酸桿菌陽性2 次，痰查抗酸桿菌陽性1 次，同時結核分枝桿菌培養陽性1 次，痰查抗酸桿菌陽性1 次，同時影像學支持肺結核；或痰培養結核分枝桿菌培養陽性，影像學支持肺結核；或影像學支持肺結核，同時結核分枝桿菌核酸檢測陽性；或影像學支持肺結核，同時病理檢查支持肺結核，即可確診；又滿足HIV 的診斷標準：參照艾滋病診療指南[11]，研究對象經我院或外院艾滋病初篩陽性，后經喀什地區預防控制中心艾滋病確認實驗室確認陽性。排除標準：合并所有可能影響Th17/Treg細胞的疾病，如肺炎、腫瘤、血液系統疾病、結締組織疾病、心血管疾病等。本研究已通過喀什地區第一人民醫院醫院倫理委員會審批通過，所有患者入院時告知研究內容并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個核細胞（PBMC）的分離與培養 所有納入實驗患者于住院次日清晨空腹無菌抽取5 ml 患者靜脈血并肝素鈉（500 IU/ml）2 ml 抗凝，用PBS 液將血液稀釋2～3 倍，充分混勻后將6 ml 抗凝靜脈血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4 ml 淋巴細胞分離液的10 ml 離心管中，水平離心機中水平離心（400 r/min，20 ℃）35 min；離心后管內分為3層，上層為血漿和PBS 液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC，用毛細吸管插到云霧層，吸取PBMC 置入另一50 ml離心管中，加入5 倍以上體積PBS，離心（300 r/min，20 ℃）10 min，棄上清；50 mlPBS 重懸細胞，離心（350 r/min，20 ℃）15 min，棄上清，加入Buffer（PBS+0.5%新生胎牛血清+2 mmol/LEDTA，pH7.2）2 ml，重懸細胞。

1.2.2 實驗分組 將分離的PBMC 常規培養后分為4組：空白對照組（不作任何處理）和B106 組[PKCδ抑制劑BJE6-106（B106）處理細胞]、MI-2 組（MALT1 抑制劑MI-2 處理細胞）、B106+MI-2 組（PKCδ 抑制劑B106 與MALT1 抑制劑MI-2 共同處理細胞）3 個試驗組，觀察PKCδ 抑制劑和MALT1 抑制劑對HIV-TB 感染者細胞免疫應答的影響。

1.2.3 檢測各組細胞水平及因子表達水平 ①流式細胞術檢測Th17 細胞水平采用流式細胞術檢測Th17細胞水平（Human Th17 Staining Kit，人Th17 染色試劑盒，購自杭州聯科生物）。從樣本管和對照管中取100 μl 細胞懸液至新的流式管中，加入5 μl Anti-Human CD3，FITC 和5 μl Anti-Human CD8α，PerCP-Cy5.5。震蕩混勻，室溫避光孵育15 min。每管加入100 μl FIX &PERM Medium A，震蕩混勻，室溫避光孵育15 min。每管加入2 ml 預冷1×Flow Cytometry Staining Buffer，300 g 離心5 min，棄上清。每管加入100 μl FIX &PERM Medium B 和5 μl Anti-Human IL-17A，PE。震蕩混勻，室溫避光孵育15 min。每管加入2 ml 1×Flow Cytometry Staining Buffer，300 g 離心5 min，棄上清。每管加入500 μl 1×Flow Cytometry Staining Buffer 重懸，上機檢測。②ELIAS 檢 測IL-2、IL-10、IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ、TNF-α 水平采用酶聯免疫吸附驗（ELISA）檢測各組IL-2、IL-10、IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ、TNF-α 水平[人白細胞介素2（IL-2）ELISA 試劑盒、人白細胞介素10（IL-10）ELISA 試劑盒、人白細胞介素17（IL-17）ELISA 試劑盒、人白細胞介素21（IL-21）ELISA 試劑盒、人白細胞介素23（IL-23）ELISA 試劑盒、人γ 干擾素（IFN-γ）試劑盒、人腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒，均采購自上海酶聯]。加入稀釋好后的標準品50 μl 于反應孔、加入待測樣品50 μl 于反應孔內。立即加入50 μl 的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育1 h。甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，重復此操作3 次。每孔加入80 μl 的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育30 min。甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，重復此操作3 次。每孔加入底物A、B 各50 μl，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育10 min。避免光照。取出酶標板，迅速加入50 μl終止液，加入終止液后應立即測定結果。在450 nm波長處測定各孔的OD 值。③qPCR 檢測MALT1、Iκbα、P65 以及IL-17、IL-23 的mRNA 表達實熒定量PCR 檢測各組中MALT1、Iκbα、P65 以及IL-17、IL-23 的mRNA 表達，各組中加入少量DMSO，作用48 h 后，提取各組總RNA，加入Trizol 試劑，加入氯仿，離心分離，加入異丙醇，離心，乙醇洗滌沉淀，離心分離白色RNA 沉淀，分光光度計檢測RNA 純度、濃度，特異性逆轉目的miRNA，合成相應cDNA，熒光定量PCR 儀檢測分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計學軟件進行分析，納入研究對象一般臨床資料及病理特征，計量資料采用（±s）表示，兩組間采用獨立樣本t檢驗，三組間采用單因素方差分析。以P＜0.05 表示差異有統計學意義，P＜0.01 表示統計學差異顯著，P＜0.001 表示統計學差異極顯著。

2 結果

2.1 Th17 細胞水平 與對照組相比，B106 組、MI-2組、B106+MI-2 組Th17 細胞水平明顯增高（P＜0.01），見圖1。

圖1 PKCδ 或MALT1 抑制劑對HIV-TB 患者外周血Th17 細胞水平的影響

2.2 炎癥因子水平 B106 或MI-2 單獨使用或兩者連用均可有效抑制HIV-TB 的炎癥反應，表現為IL-6、IL-17、IL-23、IFN-γ、TNF-α、IL-10 以及IL-22 的濃度均顯著下降（P＜0.001），但兩者聯用并無顯著效果（P＞0.05），見圖2。

圖2 PKCδ 或MALT1 抑制劑對HIV-TB 患者外周血炎癥因子水平的影響

2.3 mRNA 表達 抑制PKCδ 或抑制MALT1，以及兩者聯用均可顯著降低IL-17、IL-23 的mRNA 表達（P＜0.01）；抑制PKCδ 可顯著降低MALT1、P65 的mRNA 表達，并增加Iκbα 的mRNA 水平（P＜0.01），抑制MALT1 可顯著上調Iκbα 的mRNA 水平并降低P65 的mRNA 表達（P＜0.01）。同樣，兩者聯用與兩者單獨使用比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 PKCδ 或MALT1 抑制劑對HIV-TB 患者外周血中SYK、PKCδ、MALT1、Iκbα 以及P65 蛋白表達的影響

3 討論

HIV/AIDS 患者合并TB 感染并非單純的合并感染，感染了HIV 的患者免疫系統缺損，所以大大增加了感染結核菌的風險，而感染結核同時也會促進HIV 的感染進程[12]。HIV 侵入人體后主要導致T淋巴細胞（特別是CD4+T 淋巴細胞）功能和數量減少，導致細胞免疫功能缺陷[13]，還會對體內的炎性細胞因子（包括IFN-γ、TNF-α 等）的分泌產生影響。然而，這些細胞因子又會進一步抑制身體的免疫能力。因此，在HIV/AIDS 患者中，TB 易于形成全身性播散，呈現出多器官彌散性的損傷[14]。

通常情況下，在細胞質中的NF-κB 處于失活狀態，它的二聚體形式的復合物能與一個抑制蛋白IkBα 結合成一個全新的三聚體復合物。在三聚體形式下，NF-κB 被IkBα 抑制而沒有活性。在類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）的研究中，在RA 的早期、晚期炎癥關節的滑膜組織中均可檢測到NFκB 的活化，導致滑膜中浸潤大量的T 細胞，以CD4+T 細胞為主，激活的T 細胞可產生IL-2、IL-4、IFNγ 等細胞因子，參與RA 病變的持續進展[15]。在微循環障礙中也會有NF-κB 的激活，通過調控IL-8、MCP 等趨化因子的表達，募集大量的單核巨噬細胞、中性粒細胞，引發炎癥浸潤和微血管內皮損傷。NF-κB 的激活還會促進vWF 等因子的表達，影響凝溶的動態平衡，促進微血栓的形成[16]。有研究顯示[17]，抑制PKCδ 可以影響HIV 的早期逆轉錄和限制后續的復制。在活動性TB 患者全血中的PKCδ 顯著上調[18]。

在本研究中，抑制PKCδ 或MALT1 可拮抗HIV-TB 患者的Th17 細胞數量下降，與Parihar SP等[18]的研究結果類似。本研究結果還顯示，單獨抑制或聯合抑制PKCδ 或MALT1 均可有效抑制HIV-TB 的炎癥反應，表現為IL-6、IL-17、IL-23、IFN-γ、TNF-α、IL-10 以及IL-22 的濃度均顯著下降，但兩者聯用并無顯著效果。而Parihar SP 等[18]在TB 動物模型的研究中發現，抑制PKCδ 后在肺泡中細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6 和IL-10 等表現出顯著增加。分析原因可能是兩試驗的研究對象不同，且Parihar SP 等[18]的研究未涉及HIV 感染，結果也可能會產生一定的差異。可見，抑制PKCδ 或MALT1 均可影響HIV-TB 共感患者免疫相關細胞因子的表達。

但抑制PKCδ 或MALT1 影響NF-κB 信號通路中相關基因mRNA 表達水平的研究甚少，本研究通過RT-qPCR 方法檢測抑制PKCδ 或MALT1 和聯合抑制后MALT1、Iκbα、P65 以 及IL-17、IL-23 的mRNA 表達水平發現，抑制PKCδ 或MALT1 可通過抑制NF-κB 炎癥通路拮抗HIV-TB 的炎癥反應。既往研究顯示[19]，在潛伏感染HIV-1 的細胞中，NF-κB通路的激活可以激活HIV-1 基因的轉錄，導致HIV復制的爆炸性增加。當結核分枝桿菌感染機體后，激活NF-κB 通路刺激炎癥因子的釋放，抵抗結核分枝桿菌的感染，藥物抑制NF-κB 蛋白后，則可以恢復結核分枝桿菌的感染[20]。

綜上所述，本研究證實了在HIV-TB 患者中，抑制PKCδ 或MALT1 均可影響HIV-TB 共感患者免疫相關細胞因子的表達，并進一步初步探明了抑制PKCδ 或MALT1 是通過NF-κB 通路發揮炎癥作用的。