膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子/膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體信號通路在乳鼠先天性巨結(jié)腸相關(guān)性小腸結(jié)腸炎中的作用實驗研究

牛志新,何 峰,宋春光,肖玉清

(1.秦皇島市第一醫(yī)院肛腸科,河北 秦皇島 066000;2.青龍滿族自治縣醫(yī)院外二科,河北 秦皇島 066500)

先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung’s disease,HD)是外科常見小兒消化道畸形,主要以結(jié)腸遠段神經(jīng)節(jié)細胞缺失引起便秘、腹脹及腸梗阻等為主要表現(xiàn)[1-2]。HD相關(guān)性小腸結(jié)腸炎(Hirschsprung-associated enterocolitis,HAEC)是HD常見并發(fā)癥,是導致HD患兒死亡的主要原因之一[3-4]。目前有關(guān)HAEC發(fā)病機制尚未明確,研究表明,免疫功能低下、腸黏膜屏障炎性損傷、菌群失調(diào)等均是影響HAEC發(fā)病的相關(guān)因素,但都不能完全解釋HAEC發(fā)生機制[5-6]。研究顯示,腸神經(jīng)系統(tǒng)改變在HAEC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7],但具體分子機制尚不十分清楚。膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)是由神經(jīng)膠質(zhì)細胞分泌的營養(yǎng)因子,大量存在于胃腸道平滑肌中,其生物信息介導主要通過與其受體(GDNF family receptor alpha 1,GFRα1)、酪氨酸酶受體(Receptor tyrosine kinase,RET)協(xié)同作用促進神經(jīng)元生長、保護腸黏膜,促進腸道蠕動,對慢傳輸型便秘有一定改善作用[8-10]。目前有關(guān)GDNF/GFRα1信號通路在HAEC中的作用研究少見報道,因此本研究建立HAEC乳鼠模型,探討GDNF/GFRα1信號通路在HAEC中的作用,以期為完善HAEC病理生理過程有效治療HAEC提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 16只SPF級SD雌雄各半內(nèi)皮素受體B基因(Endothelin receptor B,Ednrb)敲除乳鼠(B6-129),體重18～26 g,平均(21.06±3.57)g,購買自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心[動物合格批號:SCXK(湖北)2014-0004]。

1.2 HD乳鼠模型建立及分組 鑒定出Ednrb基因敲除乳鼠基因后,篩選出雜合乳鼠,雜合乳鼠雜交獲得純合乳鼠。21日齡純合乳鼠為HD模型組(實驗組),同日齡野生型乳鼠為對照組,8只/組。

1.3 腸道組織標本采集 將21日齡的兩組乳鼠以脊髓脫臼法處死,取結(jié)腸組織沖洗干凈,依據(jù)腸管形態(tài)將實驗組標本分為狹窄段、擴張段,對照組標本相應分為遠段、近段。每段標本均分4部分,分別用于蘇木精-伊紅(HE)染色、酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assey,ELISA)檢測白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α);免疫印跡(Wb)法蛋白檢測。

1.4 HE染色及HAEC判定 乳鼠結(jié)腸組織標本經(jīng)多聚甲醛固定、石蠟包埋、KH-Q350型病理組織切片機(購自湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司)切片(6 μm厚)并脫蠟水化,進行HE染色(試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司),以中性樹膠封片,OLYMPUS CX23型光學顯微鏡(購自上海普赫光電科技有限公司)下觀察組織病理學變化,并拍照。腸道組織炎癥損傷程度采用Teitelbaum等[11]標準進行評估,病理評分≥Ⅲ級定為HAEC,用于后續(xù)實驗。

1.5 ELISA法檢測結(jié)腸組織中IL-10、TNF-α水平檢測 將實驗組、對照組組織標本置于kimble微量組織勻漿器(購自上海研卉生物科技有限公司)中,加入少量生理鹽水,充分勻漿,離心10 min(800 g),取上清。嚴格按照IL-10、TNF-α ELISA試劑盒說明書(均購自無錫云萃生物科技有限公司)測定IL-10、TNF-α水平。

1.6 結(jié)腸組織中GDNF/GFRα1通路相關(guān)蛋白表達檢測 采用WB法測定結(jié)腸組織中GDNF/GFRα1通路相關(guān)蛋白表達。加入裂解液提取實驗組、對照組結(jié)腸組織總蛋白,用BCA蛋白定量試劑盒(購自北京伊塔生物科技有限公司)檢測蛋白濃度及純度。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,加入兔抗鼠GDNF、GFRα1、RET、核轉(zhuǎn)錄因子κB p65(NF-κB p65)、TNF-α及內(nèi)參β-actin多克隆抗體(均購自美國Abcam公司)一抗,1∶500稀釋比,4 ℃過夜。加入HRP標記的山羊抗兔二抗(購自美國Abcam公司)(1∶1000)孵育2 h。曝光顯影、成像,采用Image J軟件進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 實驗組、對照組乳鼠結(jié)腸組織病理學變化 實驗組結(jié)腸狹窄段肌間、神經(jīng)叢未見神經(jīng)節(jié)細胞,神經(jīng)叢顯著增厚且失去正常形態(tài);而擴張段神經(jīng)細胞數(shù)目增多、形態(tài)正常。對照組各腸段神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)正常、胞質(zhì)豐富、數(shù)量較多。炎癥損傷病理評分顯示:對照組乳鼠結(jié)腸遠段、近段均為0級;實驗組8只乳鼠結(jié)腸狹窄段為Ⅱ級或以下,而擴張段為Ⅲ級或以上為HAEC,說明HAEC主要發(fā)生在結(jié)腸擴張段。

2.2 兩組乳鼠結(jié)腸組織IL-10、TNF-α水平比較 對照組乳鼠結(jié)腸組織遠段、近段IL-10、TNF-α水平比較均無統(tǒng)計學差異(均P>0.05);實驗組乳鼠結(jié)腸組織擴張段IL-10水平顯著低于狹窄段,TNF-α水平顯著高于狹窄段(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組乳鼠結(jié)腸組織IL-10、TNF-α水平比較

2.3 兩組乳鼠結(jié)腸組織GDNF/GFRα1通路相關(guān)蛋白表達比較 對照組乳鼠結(jié)腸組織遠段、近段GDNF、GFRα1、RET、NF-κB p65、TNF-α蛋白表達水平比較均無統(tǒng)計學差異(均P>0.05);實驗組乳鼠結(jié)腸組織擴張段GDNF、GFRα1、RET蛋白表達均顯著低于狹窄段(均P<0.05),NF-κB p65、TNF-α蛋白表達均顯著高于狹窄段(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組乳鼠結(jié)腸組織GDNF/GFRα1通路相關(guān)蛋白表達比較

3 討 論

HAEC是HD常見嚴重并發(fā)癥,可發(fā)生在疾病任何時期,多出現(xiàn)腹脹、腹痛、高熱等,若未得到及時治療將給患兒生命帶來嚴重威脅[12]。目前有關(guān)HAEC病理生理機制尚未完全明確,臨床尚無確切治療方式,因此探究HAEC具體機制對其預防及治療有重要意義。

Ednrb基因敲除的純合乳鼠模型是研究HD腸炎發(fā)病機制的常用模型,表現(xiàn)為遠端結(jié)腸細小、近端擴張顯著,尤在乳鼠21日齡時表現(xiàn)明顯,且與野生型比較體重較輕。本研究HD模型建立成功并篩選出HAEC乳鼠進行后續(xù)實驗。研究表明腸神經(jīng)系統(tǒng)異常及炎癥反應是HD主要發(fā)生原因[13-14]。IL-10是抗炎因子之一,由巨噬細胞、樹突狀細胞等產(chǎn)生,能夠通過抑制炎癥因子及其受體表達、活化發(fā)揮抗炎作用[15-16]。本研究顯示,與HAEC乳鼠結(jié)腸狹窄段比較,擴張段IL-10水平顯著升高,與陳鋒等[17]研究結(jié)果一致,說明結(jié)腸狹窄段與擴張段炎癥反應程度不同,可能與抗炎因子IL-10水平高低有關(guān)。

胃腸道蠕動受腸神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié),腸壁內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育依賴其神經(jīng)營養(yǎng)因子的支持、維護,其中GDNF是成熟腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞分泌產(chǎn)生的營養(yǎng)因子,GFRα1、RET是與神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育、遷移有關(guān)的功能因子,是神經(jīng)節(jié)發(fā)育主要的信號傳輸系統(tǒng)[18-19]。SORET[8]研究顯示,先天性直腸肛門畸形患兒的直腸末端中神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF、GFRα1和RET水平異常低表達可能與直腸肛門畸形術(shù)后排便功能障礙關(guān)系密切。金曼等[20]動物實驗研究顯示,促進GDNF/GFRα1/RET信號通路活化可對慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸組織發(fā)揮保護作用。既往研究顯示,GDNF與GFRα1結(jié)合形成復合物后,再與RET相互作用可激活磷脂肌醇3-激酶(Phosphatei-dylinositol 3 kinase,PI3K),活化產(chǎn)生第二信使PIP3,進一步磷酸化蛋白激酶B(Serine-threonine kinase,AKT)蛋白的Thr308位點,促使AKT活化,而活化的AKT發(fā)生磷酸化,抑制下游靶基因NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,而NF-κB是一種氧化應激轉(zhuǎn)錄因子,主要以p50/p65二聚體形式與其抑制蛋白(Inhibitor kappa,I-κB)形成復合體存在于正常細胞中,在細胞因子刺激下p50/p65二聚體與I-κB發(fā)生解離并轉(zhuǎn)移至細胞核中,進而調(diào)控多種炎性介質(zhì)如IL-6、TNF-α等的轉(zhuǎn)錄表達,造成細胞DNA損傷或突變,促使炎癥反應及進展[21-23]。既往動物實驗研究顯示,促進GDNF/PI3K/AKT信號通路激活可明顯改善功能性便秘乳鼠胃腸動力,并減輕炎癥反應[24-25]。本研究結(jié)果顯示,實驗組乳鼠結(jié)腸組織擴張段GDNF、GFRα1、RET蛋白表達均顯著低于狹窄段,NF-κB p65、TNF-α蛋白表達均顯著高于狹窄段,且炎癥較重,與既往相關(guān)研究結(jié)果一致,說明HAEC乳鼠炎癥反應主要發(fā)生在擴張段,可能與GDNF/GFRα1/RET/NF-κB信號通路受抑制,腸神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)異常有關(guān)。

綜上所述,HAEC乳鼠結(jié)腸擴張段炎癥相對較重,可能與GDNF/GFRα1信號通路及相關(guān)蛋白表達受抑制,腸神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)異常有關(guān),而具體分子機制有待進一步探究。