紅景天苷對Lewis肺癌小鼠惡性胸腔積液的抑制作用及其對免疫功能的影響

王松海,凡 瑾,陳 捷

(1.陜西省中醫醫院腫瘤科,陜西 西安 710003;2.陜西中醫藥大學,陜西 咸陽 712046)

目前肺癌在全球范圍內成為所有癌類疾病中最為常見的類型,我國肺癌發病率及病死率均居首位[1]。惡性胸腔積液(Malignant pleural effusion,MPE)是原發于胸膜或其他部位的腫瘤細胞轉移至胸膜所引起的異常胸腔積液,為中晚期非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)臨床常見的并發癥之一。MPE常生長迅速,反復胸腔置管引流可引起蛋白大量丟失,中等量積液即可引起顯著的胸悶、氣短等癥狀,嚴重影響生存時間[2],臨床治療多以緩解呼吸困難癥狀為主。

紅景天屬于景天科紅景天屬植物,其主要的活性成分為紅景天苷(Salidroside,SAL),具有抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤等作用[3-4]。本課題組前期的臨床工作發現,運用大株紅景天注射液聯合胸腔灌注治療肺癌MPE患者臨床效果良好。本研究采用紅景天苷為研究對象,建立Lewis肺癌小鼠模型,觀察SAL聯合順鉑對 Lewis肺癌小鼠MPE的抑制作用及其可能機制,為 SAL 治療 MPE 的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與細胞:實驗動物選擇C57BL/6小鼠共40只,均購自第四軍醫大學實驗動物中心,雌雄各20只,鼠齡8周,體重20 g,飼養在SPF級環境下。小鼠Lewis肺癌瘤株GFP-LLC細胞,上海研生實業有限公司提供。

1.1.2 主要試劑:SAL (HPLC 法檢測純度> 98%,CAS:82373-94-2)購自四川維克奇生物科技有限公司; DMEM培養基、胎牛血清購自Gibco公司;人腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)購自武漢賽培生物,貨號:SP10205;低氧誘導因子(Hypoxia inducible factor 1alpha,HIF-1α)購自蘇州卡爾文生物科技有限公司,批號:E20181118A;血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)美國R&D 公司 ELISA 試劑盒,批號:17795715182;注射用順鉑(凍干型)購自齊魯制藥有限公司,批號:1K0574B02。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養:使用小牛血清的高糖DMEM完全培養基(100 IU/ml青霉素、100 IU/ml鏈霉素),在CO25%、37 ℃的孵箱里進行GFP-LLC細胞系培養。每3天傳代一次,取對數生長期、長勢好細胞完成實驗,細胞計數板計數,最終制備成濃度為5.0×106個/ml的細胞懸液 。

1.2.2 小鼠建模方法:實驗動物選擇C57BL/6小鼠,將GFP-LLC細胞制成濃度為2.5×106個/ml(PBS緩沖液調節濃度)的細胞懸液,碘伏消毒小鼠胸前區皮膚,使用1 ml注射器抽吸制備好的LLC細胞懸液,使其充分混勻后,自小鼠胸部右側靠近腋中線,約平第6肋間隙處注射入胸腔,每只小鼠注射0.2 ml。連續注射14 d后CT檢查表明建模成功。

1.2.3 實驗分組:選取40只老鼠,每組8只,進行實驗。①正常組:正常未加任何實驗C57BL/6小鼠,胸腔注射0.9% NaCl 0.4 ml,1次/d;②模型組:在造模成功的基礎上,胸腔注射0.9% NaCl 0.4 ml,1次/d;③SAL組:在造模成功的基礎上,皮下注射SAL(SAL 50 mg/kg),1 次/d;④化療組(DDP組):在造模成功的基礎上,胸腔注射順鉑5 mg/kg,隔 3 d 1 次;⑤SAL+DDP組: 在造模成功的基礎上,給予紅景天苷1 次/d和順鉑隔1 次/3 d (SAL 50 mg/kg+順鉑5 mg/kg)。 連續給藥2周。第 15 天,頸椎脫臼法處死后立即解剖取材備用。

1.3 觀察指標

1.3.1 MPE標本采集及體積測量:給藥第15天每組選取8只小鼠,乙醚麻醉小鼠后。將小鼠仰臥位固定于解剖板上,消毒胸部皮膚,依序剝離胸部皮膚、肌肉、壁層胸膜等結構,觀察胸水性狀,用 1 ml 注射器收集胸水并測量體積。將收集到的胸水置于1.5 ml EP管內,加入3.8%枸櫞酸鈉抗凝,以枸櫞酸鈉∶胸水體積比1∶9混合,隨即放于冰中快速冷凍。并以2500 r/min于4 ℃離心機中離心10 min,取上清液,-70 ℃保存。收集胸膜、肺、縱隔腫瘤組織,以4%甲醛固定,-80 ℃保存標本備用。

1.3.2 生存周期計算:實驗結束后統計21 d內,各組小鼠存活情況。

1.3.3 檢測小鼠血清中HIF-1α、TNF-α、VEGF的表達水平:使用酶聯免疫吸附法(ELISA)。

1.3.4 細胞免疫指標:在治療的前1 d及完成2個周期治療后早晨采血,流式細胞儀定量檢測T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及自然殺傷細胞(Natural killer cell,NK)。

2 結 果

2.1 各組小鼠生存時間比較 小鼠平均生存時間以SAL+DDP組最長(16.88±1.46)d,模型組最短 (10.13±1.73)d。DDP組、SAL+DDP組與模型組比較,差異有統計學意義 (均P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠生存時間比較

2.2 各組MPE小鼠胸腔積液比較 經治療,SAL組、DDP組和聯合組小鼠MPE體積減小(均P<0.05); 與模型組比較,SAL組、DDP組、SAL+DDP組小鼠MPE體積減少顯著,比較差異有統計學意義(均P<0.01)。見表2。

表2 各組MPE小鼠胸腔積液比較(μl)

2.3 各組MPE小鼠血清中TNF-α、HIF-1α、VEGF水平比較 與正常組相比,模型組外周血TNF-α水平降低,而HIF-1α、VEGF值升高(均P<0.05);與模型組比較,SAL組、DDP組和SAL+DDP組外周血中TNF-α水平均升高,HIF-1α、VEGF水平降低,比較差異有統計學意義(均P<0.05)。見表3。

表3 各組MPE小鼠血清中TNF-α、HIF-1α、VEGF水平比較

2.4 各組小鼠治療前后免疫細胞比較 造模成功后,與正常組比較,模型組、SAL組、DDP組和SAL+DDP組各組小鼠免疫細胞均顯著減少(均P<0.05),各組之間免疫細胞水平比較無明顯統計學差異(均P>0.05)。分組治療后與模型組相比較,SAL組、DDP組和SAL+DDP組血清CD3+均顯著升高(均P<0.05);SAL組、SAL+DDP組CD4+均顯著升高(均P<0.05),DDP組CD4+升高但差異無統計學意義(P>0.05);SAL組、SAL+DDP組CD8+、CD4+/CD8+、NK數值均顯著升高 (均P<0.05),而DDP組降低(P>0.05)。見表4。

表4 各組小鼠治療前后免疫細胞比較

3 討 論

惡性胸腔積液(MPE)是原發性胸膜腫瘤或腫瘤轉移至胸膜最常見的臨床癥狀,僅有3～12個月的中位生存期,肺癌是導致MPE最主要的原因,無 MPE肺癌患者中位生存期明顯優于并發MPE者,后者僅為 3～4個月[5-6]。目前MPE治療方法包括胸膜固定術、導管引流術、胸腔鏡及胸腔灌注術等,可有效緩解呼吸困難,但多數患者難以徹底治愈或長期控制,反復操作感染風險明顯增加[7-9]。目前MPE發病機制較多,包括淋巴回流障礙,血管活性因子過度表達引起胸膜腔血管新生、血管通透性增高,胸膜腔局部的腫瘤細胞與免疫細胞相互作用進而形成促惡性胸腔積液生成的免疫微環境等學說[10-11]。

目前研究表明中醫藥在惡性腫瘤治療,尤其是腫瘤晚期惡液質、惡性積液、癌性疲乏等方面具有創傷小、并發癥少、副作用輕、可長期服用的治療特點。多個研究發現紅景天苷不僅具有抗疲勞、抗氧化、抗衰老、抗炎、抗纖維化等作用,還可通過抑制細胞增殖、遷移、侵襲等發揮抗腫瘤作用[12-14]。本課題組前期通過臨床觀察發現靜脈滴注大株紅景天注射液聯合順鉑胸腔灌注可以抑制MPE的產生[15],但是對于進一步紅景天苷如何抑制胸水產生,是否抑制腫瘤血管產生,是否與局部胸腔免疫活性激活有關,與鉑類化療藥物聯合運用是協同作用還是拮抗作用,尚不明確。

因此本次研究采用紅景天苷聯合順鉑觀察MPE小鼠模型中相關分子表達情況,結果顯示與模型組比較,SAL組、DDP組和SAL+DDP組的MPE體積明顯下降,生存時間增加,SAL組和DDP組與SAL+DDP組小鼠MPE的體積和生存時間相比差異明顯,表明SAL和DDP聯用對腫瘤生長和MPE的抑制發揮協同作用?；熕幬锟芍苯託缒[瘤細胞或抑制腫瘤細胞增殖,但毒副作用較大,中晚期患者常耐受不佳,結合中藥以扶正祛邪、增效減毒,或可部分改善MPE患者的耐受性,提高臨床療效[16]。

血管內皮生長因子(VEGF)是促進血管生成、調節血管通透性的關鍵因子。研究發現,與癌旁組織標本相比,肺癌組織中VEGF陽性表達率及腫瘤血管密度(MVD)明顯更高,且二者呈正相關[17]。據報道,胸膜VEGF水平高的MPE患者生存期明顯低于VEGF水平正常者[18]。隨著腫瘤體積的增長,氧氣的需求逐漸增大,而腫瘤組織內的病理性新生血管不能滿足腫瘤組織生長所需氧量,形成瘤體內的相對低氧環境,進而刺激腫瘤細胞分泌HIF-1α,該因子是VEGF通路的上游因子,可使腫瘤細胞分泌的VEGF-A增多,與內皮細胞表面的VEGFR-2結合后發揮促血管生成作用[19]。相關研究也表明抑制VEGF可導致母血管塌陷為腎小球微血管增生,逐漸變化為正常的微血管[20]。VEGF調節血管通透性的作用是組胺的50000倍,能夠有效提升微小靜脈的血管通透性,導致血漿蛋白和纖維蛋白外滲至細胞外間隙,進而誘發MPE[21]。通過ELISA檢測各組HIF-1α、VEGF水平,發現SAL組、DDP組和SAL+DDP組小鼠HIF-1α、VEGF水平明顯下降,表明單純紅景天組或聯合治療均可抑制HIF-1α、VEGF的產生,在抑制腫瘤血管新生、降低血管通透性中二者具有協同作用,從而達到抑制MPE生成的作用。

近年來關于MPE局部免疫微環境的研究越來越多,活性下降的宿主免疫細胞與腫瘤細胞相互作用,使胸膜腔局部免疫微環境有利于MPE的生成[22]。活化的單核巨噬細胞、NK細胞等多種細胞可共同形成TNF-α,這是一種可參與機體炎癥反應、免疫調控、細胞凋亡等多種信號傳導通路的細胞調節因子。TNF-α在不同的細胞環境下具有促癌與抗癌的雙重作用,主要通過破壞血管內皮的完整性、減少腫瘤新生血管形成、誘導細胞凋亡等方式抗腫瘤[23-25]。ELISA檢測各組TNF-α水平,發現SAL組、順鉑組和SAL+順鉑組小鼠TNF-α水平較模型組明顯上升,同時我們還發現治療后SAL組和SAL+DDP組小鼠血清CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、NK細胞高于模型組?？梢?紅景天苷對免疫細胞的免疫功能具有較強的促進作用。

綜上所述,對晚期反復發作MPE患者,中藥紅景天具有減少MPE生成、提高免疫功能的作用,且與化療藥物聯合應用時作用明顯。由于本研究的局限性,需深入研究及推廣應用以進一步驗證紅景天對MPE的功效。