低魚粉高脂飼料添加大豆卵磷脂對黃鱔生長、血清生化指標(biāo)及腸道菌群的影響

湯 哲 林東曉 蔡明浪 張俊智 朱 波 石 勇 鐘 蕾 胡 毅

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 長沙 410128)

魚粉因營養(yǎng)組成均衡、適口性好而被大量應(yīng)用于水產(chǎn)飼料中。然而目前受海洋氣候與貿(mào)易形勢影響, 全球魚粉供應(yīng)緊張, 其價格也呈現(xiàn)迅速上漲的態(tài)勢, 因此降低飼料中魚粉的使用迫在眉睫[1]。目前, 生產(chǎn)上傾向從兩方面來減少飼料中魚粉使用。一方面是進(jìn)行飼料魚粉的替代, 提高飼料中豆粕等植物蛋白含量, 降低飼料成本。但魚粉替代比例過高后, 由于植物源性蛋白存在抗?fàn)I養(yǎng)因子、必需氨基酸不平衡等因素會影響魚體生長性能且損害腸道健康, 從而限制了低魚粉飼料的使用[2—4]; 另一方面, 因脂肪對蛋白的節(jié)約作用, 適宜提高飼料脂肪水平以提高飼料中蛋白利用, 間接達(dá)到降低魚粉的使用。然而, 過高脂肪的攝入易引發(fā)機體脂肪異常沉積, 并影響腸道菌群穩(wěn)態(tài), 減弱魚體抗應(yīng)激能力[5—7]。前期研究表明, 黃鱔(Monopterus albus)在飼料含有51%魚粉, 且蛋白質(zhì)/脂質(zhì)比為(450/40) g/kg條件下生長性能最佳[8], 低魚粉高植物蛋白飼料會降低黃鱔生長[9], 而適當(dāng)提高低魚粉飼料中脂肪水平可促進(jìn)黃鱔生長[10], 但脂肪水平過高會干擾脂質(zhì)轉(zhuǎn)運并損害腸道健康, 而蛋氨酸[11]與牛磺酸[12]的添加可減少脂質(zhì)沉積, 并維護(hù)高脂營養(yǎng)壓力下腸道健康, 因此低魚粉高脂飼料的負(fù)面影響在一定程度上可由添加劑緩解。

大豆卵磷脂為大豆加工副產(chǎn)物之一, 由多種優(yōu)質(zhì)不飽和脂肪酸、腦磷脂及磷脂酰膽堿等營養(yǎng)元素組成。2021年國產(chǎn)大豆產(chǎn)量為1640萬噸, 且呈逐年增加的趨勢[13], 其衍生產(chǎn)物具有極大的應(yīng)用潛力。近年, 大豆卵磷脂廣泛應(yīng)用于飼料行業(yè), 有效改善了畜禽對高植源性飼料的利用能力[14], 并促進(jìn)凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[15]生長, 而其促進(jìn)脂肪乳化的特性可改善動物機體對飼料中脂肪的吸收轉(zhuǎn)運, 緩解團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)[16]魚體脂類氧化應(yīng)激。此外, 大豆卵磷脂中磷脂成分可以提高魚體免疫機能, 修復(fù)腸道損傷并增強肝細(xì)胞抗脂肪化能力, 改善腸道菌群組成[17—20]。因此本試驗以湖南特種魚黃鱔為研究對象, 在低魚粉高脂飼料中添加大豆卵磷脂, 探究其對黃鱔生長、血清生化指標(biāo)及腸道菌群的影響, 以期降低黃鱔魚粉使用量, 緩解原料供應(yīng)壓力, 并為大豆卵磷脂在低魚粉高脂飼料中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以魚粉、豆粕為主要蛋白源, 豆油與魚油為主要脂肪源, 共設(shè)4個處理, 以含有42%魚粉、22%豆粕、6%粗脂肪的飼料為正常魚粉組(對照組, FM組), 另以含有22%魚粉、52%豆粕、9%粗脂肪為低魚粉高脂飼料(SL0組), 分別在低魚粉高脂飼料中添加1% (SL1組)、2% (SL2組)的大豆卵磷脂, 其飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料原料由張家界新瑞生物飼料有限公司提供, 飼料原料經(jīng)80目超微粉碎后, 按用量逐級混勻, 后加入混合機中, 同步加油,約進(jìn)行10min; 隨后用60目篩網(wǎng)篩選觀察是否有大顆粒油脂混合物, 磨碎后反復(fù)進(jìn)行, 直至全部過篩,烘干機風(fēng)干后-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

表1 飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Tab.1 Feed composition and nutrient level (air-dry basis) (%)

1.2 飼養(yǎng)與管理

實驗在湖南常德黃鱔實驗養(yǎng)殖基地進(jìn)行, 實驗魚選自湖南省常德市洞庭湖區(qū), 于實驗開展1月前購買, 暫養(yǎng)期間禁食。實驗正式開展前, 先用少許蚯蚓投喂馴食, 逐漸加入鮮魚漿, 蚯蚓與鮮魚漿達(dá)到1∶1后緩慢減少蚯蚓比例, 同時加入等比重的飼料; 每日依據(jù)試驗調(diào)控投喂總量, 并調(diào)整誘食餌料與飼料比例, 直至黃鱔可全面攝食飼料, 馴食時間為15d。馴食完成后, 禁食24h, 挑選體格健壯、大小相當(dāng)?shù)狞S鱔(20.03±0.01) g隨機分入12個規(guī)格一致的網(wǎng)箱中(2.0 m×1.5 m×1.5 m), 試驗共設(shè)4組, 每組3個重復(fù), 網(wǎng)箱內(nèi)放養(yǎng)50尾。試驗網(wǎng)箱集中設(shè)于水域中央, 池塘面積為1畝左右, 網(wǎng)箱內(nèi)鋪設(shè)等量水花生, 飼料投喂時劃船將粉料加水搓團(tuán)置于水花生上, 下端接觸水面。在養(yǎng)殖試驗期間, 日投喂1次(18: 00—19: 00), 定時清理殘餌并記錄重量, 投喂量為黃鱔體重3%—5%, 每3日調(diào)整投喂量, 養(yǎng)殖攝食試驗共持續(xù)8周(以開始攝食飼料的時間為實驗正式開始的時間)。在試驗期間, 水溫(32.3±4.2)℃, 溶氧含量≥5.0 mg/L, 氨氮含量≤0.5 mg/L。

1.3 生長形體指標(biāo)

在養(yǎng)殖試驗結(jié)束后, 禁食24h, 并對黃鱔進(jìn)行稱重和計數(shù), 計算存活率(Survival rate, SR)、增重率(Weight gain rate, WGR)、飼料系數(shù)(Feed conversion ratio, FCR)。隨機取6尾試驗魚, 測量記錄其體重、體長、全長、肝重和內(nèi)臟團(tuán)重量, 用于計算肝體比(Hepatopancreas index, HSI)、臟體比(Viscerosomatic index,VSI)和肥滿度(Condition factor, CF)。計算方法:

存活率(%)=100×試驗?zāi)S鱔尾數(shù)(尾)/試驗初黃鱔尾數(shù)(尾);

增重率(%)=100×[末體重(g)-初體重(g)]/初體重(g);

飼料系數(shù)=飼料攝取量(g)/[末體重(g)-初體重(g)];

肝體比=100×黃鱔肝臟重(g)/黃鱔末體重(g);

臟體比=100×黃鱔內(nèi)臟團(tuán)重(g)/黃鱔末體重(g);

肥滿度(g/cm3)=100×黃鱔體重(g)/黃鱔體長(cm)3。

1.4 營養(yǎng)成分指標(biāo)

試驗飼料的水分、粗蛋白、粗脂肪與粗灰分分別使用105℃恒溫干燥法(GB/T5009.3-2003)、凱氏定氮法(GB/T5009.5-1985)、索氏抽提法(GB/T5009.6-1985)與550℃馬弗爐測定(GB/T5009.4-1985)。

1.5 血清生化指標(biāo)

在養(yǎng)殖試驗結(jié)束后, 每個網(wǎng)箱隨機取6尾禁食24h的黃鱔, 用1 mL無菌注射劑于肛門下0.5—1 cm取血, 血樣分裝于4℃冰箱, 靜置2h后, 在3000 r/min離心10min, 吸取上清液并混樣, 每組混合樣本約有5—6管(200 μL), 儲存于-80℃超低溫冰箱備用。黃鱔血清生化指標(biāo)包括甘油三酯(Triglyceride, TG)、總膽固醇(Total cholesterol, TC)、高低密度脂蛋白(High-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein cholesterol, HDLC)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、尿素氮(Blood urea nitrogen, BUN)、血氨(Blood ammonia, Ba)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ACP)與免疫球蛋白M (ImmunoglobulinM, IgM), 均采用試劑盒測定。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所和浙江伊利康生物科技有限公司。

1.6 腸道切片的制備與觀察

在養(yǎng)殖試驗結(jié)束后, 每個網(wǎng)箱隨機取3尾禁食24h的黃鱔, 解剖分離出腸道, 于腸道食結(jié)之后取0.5 cm3腸組織, 確保切面光滑齊整, 置于4%甲醛溶液中固定24h, 制樣時取出, 微流水沖洗, 先由乙醇梯度脫水后置于二甲苯透明, 再由低熔點石蠟包埋, 于包埋機中橫向切片, 切片厚度為5 μm, 后使用HE染色,中性樹膠封片, 具體參考劉祥等[21]方法。

切片制備完成, 送于艾方生物公司完成白光掃描, 后利用Image J軟件隨機選定多組區(qū)域測量皺襞高度(Fold height, FH)、肌層厚度(Intestinal muscular thickness, IMT)及杯狀細(xì)胞數(shù)目(Amounts of intestinal goblet cells per root, AIGC), 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 腸道菌群分析

養(yǎng)殖試驗結(jié)束, 立即從FM、SL0與SL2組的每個網(wǎng)箱中取5尾魚后腸內(nèi)容物, 置于2 mL無酶防爆管中, 液氮速凍后, -80℃保存。對FM、SL0與SL2組的腸道內(nèi)容物樣品進(jìn)行DNA提取, 采用通用引物(正向引物338F: 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′, 反向引物806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′)擴增16S rRNA基因V3—V4區(qū)域。采用Illumina平臺對PCR純化樣品中的DNA片段進(jìn)行雙端(Paired-end)測序, 后續(xù)利用派森諾基因云(https://www.genescloud.cn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用Microsoft office Excel 2019進(jìn)行初步整理分析, 采用SPSS 22軟件將符合方差齊質(zhì)性的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。當(dāng)差異顯著時(P＜0.05), 采用Duncan’s進(jìn)行事后多重比較,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 低魚粉高脂飼料中添加大豆卵磷脂對黃鱔生長性能的影響

由表2可知, 各組間黃鱔的存活率、臟體比和肥滿度均無顯著差異(P＞0.05)。與FM組相比, SL0組黃鱔增重率顯著降低(P＜0.05), 而餌料系數(shù)、肝體比均顯著增加(P＜0.05); SL1和SL2組黃鱔餌料系數(shù)顯著增加(P＜0.05), 增重率顯著降低(P＜0.05)。與SL0組相比, SL1組黃鱔肝體比顯著降低(P＜0.05);SL2組黃鱔增重率顯著增加(P＜0.05), 而餌料系數(shù)、肝體比顯著降低(P＜0.05)。

表2 低魚粉高脂飼料中添加大豆卵磷脂對黃鱔生長性能的影響Tab.2 Effects of supplementation of soybean lecithin to low-fishmeal and high-fat diet on growth performance of Monopterus albus

2.2 低魚粉高脂飼料添加大豆卵磷脂對黃鱔血清生化的指標(biāo)影響

由表3可知, 相較于FM組, SL0組黃鱔血清的TC、TG、HDL-C、LDL-C、Ba、BUN、AST、ALT、ACP和IgM水平顯著提高(P＜0.05), 而AKP水平則顯著降低(P＜0.05); SL1和SL2組黃鱔血清的HDLc、Ba、BUN和AST也顯著高于FM組(P＜0.05), 而SL2組的黃鱔血清中TG、TC、LDL-c、ALT、ACP、AKP和IgM則與FM組無顯著差異(P＞0.05)。相較于SL0組, SL2組黃鱔血清的HDL-C和AKP含量顯著增加(P＜0.05), 而LDL-C、Ba、BUN、AST、ALT、ACP和IgM含量顯著下降(P＜0.05)。

表3 低魚粉高脂飼料中添加大豆卵磷脂對黃鱔血清生化指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of supplementation of soybean lecithin to low-fishmeal and high-fat diet on serum biochemical indexes of Monopterus albus

2.3 低魚粉高脂飼料添加大豆卵磷脂對黃鱔腸道結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知, 與FM組(圖1a)相比, SL0組(圖1b)黃鱔腸道皺襞稀疏且部分上皮細(xì)胞脫落甚至溶解,皺襞間隙增大, 上皮下方的固有層內(nèi)細(xì)胞排列紊亂。SL2組(圖1c)黃鱔腸道皺襞損傷得到修復(fù), 上皮細(xì)胞排列整齊, 皺襞輪廓相對清晰, 但腸道完整性仍未及正常魚粉組。

圖1 低魚粉高脂飼料添加大豆卵磷脂對黃鱔腸道切片的影響(HE)Fig.1 Effects of lowfishmeal and high fat diet supplemented with soybean lecithin on gut sections of Monopterus albus (HE)

由表4可知, 各組間在黃鱔腸道皺襞高度、杯狀細(xì)胞與肌層厚度上存在顯著差異(P＜0.05)。相較于FM組, SL0組黃鱔腸道皺襞高度與杯狀細(xì)胞數(shù)目顯著下降(P＜0.05), 而肌層厚度顯著上升(P＜0.05)。相對SL0組, SL2組黃鱔腸道肌層厚度顯著下降(P＜0.05),而皺襞高度與杯狀細(xì)胞數(shù)目無顯著差異(P＞0.05)。

表4 低魚粉高脂飼料添加大豆卵磷脂對黃鱔腸道切片的影響Tab.4 Effects of low-fishmeal and high-fat diet supplement with soybean lecithin on intestinal sections of Monopterus albus

2.4 低魚粉高脂飼料添加大豆卵磷脂對黃鱔腸道菌群的影響

低魚粉高脂飼料添加大豆卵磷脂對黃鱔腸道菌群多樣性的影響由圖2可知, FM組操作分類單元(OTU)數(shù)目為700個, SL0組OTU數(shù)目為837個,SL2組OTU數(shù)目為1828個, 3組共有的OTU數(shù)目為177個, FM組與SL0組共有OTU數(shù)目為70個, FM與SL2組共有OTU數(shù)目為73個, SL0組與SL2組共有OTU數(shù)目為173個, FM組、SL0組與SL2組特有OTU數(shù)目分別為380、417和1405個。由圖3可知,從黃鱔腸道菌群主坐標(biāo)分析來看, 各組間單獨成簇,組間總體群落結(jié)構(gòu)相似性低。

圖2 OTU韋恩圖Fig.2 OTU Venn chart

圖3 基于Bray_curtis (a)與jaccard (b)算法的不同分組腸道菌群的主坐標(biāo)分析Fig.3 The Bray_curtis (a) and jaccard (b) algorithms are used to analyze the principal coordinates of intestinal flora in different groups

由表5可知, 相較于FM組, SL0組黃鱔腸道菌群的香農(nóng)指數(shù)與辛普森指數(shù)顯著增加(P＜0.05), 但在Chao1、菌群豐富度指數(shù)上無顯著差異(P＞0.05)。而相較于SL0組, SL2組黃鱔腸道菌群的Chao1、菌群豐富度指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)與辛普森指數(shù)皆顯著增加(P＜0.05)。

表5 低魚粉高脂飼料添加大豆卵磷脂對黃鱔腸道菌群Alpha多樣性Tab.5 Alpha diversity of intestinal flora of Monopterus albus by supplementation of soybean lecithin to low-fishmeal and high-fat diet

低魚粉高脂飼料添加大豆卵磷脂對黃鱔腸道菌群物種組成的影響由圖4可知, 在黃鱔腸道菌群門水平物種組成上, 物種優(yōu)勢菌門為(相對豐度由高到低)變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)等。對門相對豐度前四的物種分析可得(表6), 各組黃鱔腸道中變形菌門、放線菌門、綠彎菌門存在顯著差異(P＜0.05), 而厚壁菌門未有顯著差異(P＞0.05)。其中, 相較于FM組, SL0組在此四類物種的相對豐度上無顯著差異(P＞0.05); 相較于SL0組, SL2組黃鱔腸道中變形菌門的相對豐度顯著下降(P＜0.05), 綠彎菌門的相對豐度顯著增加(P＜0.05), 而厚壁菌門與放線菌門未有顯著差異(P＞0.05)。

圖4 門水平物種相對豐度Fig.4 Relative abundance of species on phylum level

表6 門水平排名前四的物種相對豐度Tab.6 Relative abundance of top 4 species on phylum level

通過對黃鱔腸道菌群屬水平物種相對豐度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)(圖5), 其腸道菌群中相對豐度前四的依次為不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅桿菌屬(Rhodobacter)和考克氏菌屬(Kocuria)。由表7可知, 相較于FM組, SL0組黃鱔腸道菌群的不動桿菌屬相對豐度顯著增加(P＜0.05), 而假單胞菌屬、紅桿菌屬與考克氏菌屬相對豐度無顯著差異(P＞0.05)。相較于SL0組, SL2組黃鱔腸道菌群的假單胞菌屬與紅桿菌屬相對豐度顯著增加(P＜0.05), 而不動桿菌屬與考克氏菌屬相對豐度顯著下降(P＜0.05)。

圖5 屬水平物種相對豐度Fig.5 Relative abundance of species on genus level

表7 屬水平排名前四的物種相對豐度Tab.7 Relative abundance of top 4 species on genus level

3 討論

3.1 低魚粉高脂飼料中添加大豆卵磷脂對黃鱔生長性能指標(biāo)的影響

在本試驗中, 降低飼料中20%魚粉, 提高脂肪水平并不能達(dá)到正常魚粉飼喂的生長效果。本實驗室前期研究表明, 黃鱔為偏肉食性魚類, 高比例魚粉有利于黃鱔生長發(fā)育, 過高魚粉替代水平會抑制黃鱔生長[9]。而適宜的添加脂肪可改善黃鱔生長[10],但脂肪對蛋白的節(jié)約作用是機體營養(yǎng)物質(zhì)均衡且充足的前提下實現(xiàn)的, 可能因魚粉替代比例過高干預(yù)了脂肪節(jié)約蛋白的效果, 進(jìn)而未達(dá)到正常魚粉飼喂黃鱔的生長水平。值得注意的是, 低魚粉高脂飼料影響黃鱔生長性能是否與使用豆粕進(jìn)行替代有關(guān), 有研究表明黃鱔對不同蛋白源的利用不同[22],合理利用其他植物蛋白源是否可以緩解此類現(xiàn)象,有待進(jìn)一步探究。但在低魚粉高脂飼料中添加大豆卵磷脂后顯著改善了黃鱔生長性能, 可能因大豆卵磷脂充當(dāng)乳化劑, 可促進(jìn)黃鱔對飼料中脂肪的消化吸收, 且自身攜帶較多的長鏈多不飽和脂肪酸,其長鏈多不飽和脂肪酸可以競爭性地與不同脂質(zhì)代謝酶結(jié)合[23], 從而改善黃鱔對低魚粉高脂飼料的利用效果, 提高生長性能。但過高的飼料脂肪水平誘使黃鱔肝臟脂質(zhì)沉積, 同樣在雜交石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus♀ ×Epolyphekadion♂)[24]與羅非魚(Oreochromis mossambicus)[25]的脂肪水平研究中發(fā)現(xiàn), 過高的脂肪水平導(dǎo)致胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加,促使魚體肝體比增加。而在磷脂對中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)[26]脂代謝影響的研究發(fā)現(xiàn), 磷脂可能通過促進(jìn)脂肪氧化, 抑制肝臟脂肪合成, 從而降低脂肪在肝臟的沉積。因此添加大豆卵磷脂后黃鱔肝體比下降的現(xiàn)象可能與飼料中添加適量的磷脂有關(guān)。

3.2 低魚粉高脂飼料中添加大豆卵磷脂對黃鱔血清生化指標(biāo)的影響

甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白是衡量機體脂肪沉積的重要指標(biāo), 低密度脂蛋白將脂質(zhì)分子從肝臟運輸?shù)饺? 而高密度脂蛋白將脂質(zhì)從周圍組織運輸?shù)礁闻K[27]。在本試驗中, 相較于正常魚粉組, 低魚粉高脂飼料中較高的脂肪水平誘使黃鱔血脂水平上升, 并影響肝臟脂質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)代謝酶含量，而大豆卵磷脂的添加有效地改善了黃鱔血脂水平, 促進(jìn)肝臟脂肪轉(zhuǎn)運。此與大豆卵磷脂飼喂斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)[28]的研究類似, 可能因卵磷脂的乳化特性, 促進(jìn)血脂轉(zhuǎn)運, 從而改善魚體血脂水平[29]。同時大豆卵磷脂通過調(diào)控黃鱔脂蛋白產(chǎn)生, 增強黃鱔肝臟與周圍組織膽固醇的交換, 進(jìn)而調(diào)控機體脂質(zhì)分布, 改善低魚粉高脂飼料引起的黃鱔脂肪紊亂。血氨為氨基酸脫氨作用主要產(chǎn)物, 尿素氮是過量的氨基酸分解成的氨和碳骨架, 而氨會進(jìn)一步代謝為尿素氮, 間接反映機體蛋白利用程度。從本試驗結(jié)果看, 低魚粉高脂飼料組的搭配不利于魚體對飼料蛋白的利用, 阻礙了蛋白沉積。而在金頭鯛(Sparus aurata)[30]幼魚中已表明大豆卵磷脂可以調(diào)控魚體不飽和脂肪酸代謝的功能, 因此本試驗中大豆卵磷脂可能通過促進(jìn)機體脂質(zhì)供能, 以降低機體蛋白質(zhì)分解供能,來減緩低魚粉高脂飼料對蛋白沉積的抑制作用, 在一定程度上提高對蛋白的利用, 以緩解低魚粉高脂飼料的負(fù)面影響, 此結(jié)果也與魚體的生長指標(biāo)相印證。

谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶為衡量肝臟損傷的指標(biāo)。谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶由肝臟產(chǎn)生, 其為大分子蛋白物質(zhì), 當(dāng)肝細(xì)胞損壞或細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化時, 血液中含量才會大量提升[31]。與紅羅非魚(Red tilmpa)[32]稚魚上研究類似, 飼料中過高脂肪水平促使黃鱔肝細(xì)胞發(fā)生損傷, 血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶與谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量上升。大豆卵磷脂的添加使黃鱔的肝臟功能得到保護(hù)與恢復(fù), 血清中轉(zhuǎn)氨酶減少,推測大豆卵磷脂通過減少肝臟脂肪沉積, 降低肝臟細(xì)胞過氧化風(fēng)險, 從而減緩肝臟細(xì)胞的營養(yǎng)壓力[33]。堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和免疫球蛋白M, 三者為機體重要的免疫指標(biāo)。堿性磷酸酶為免疫防御重要的磷酸單脂水解酶, 其可增強細(xì)菌的異己性, 從而增強吞噬細(xì)胞的降解能力, 進(jìn)而增強機體免疫性能[34], 酸性磷酸酶參與蛋白質(zhì)胞飲作用和細(xì)胞內(nèi)消化[35], 免疫球蛋白M為機體循環(huán)性抗體, 常用于衡量機體感染程度[36]。在本試驗中, 相較于正常魚粉水平, 低魚粉高脂飼料干擾魚體免疫代謝, 下調(diào)免疫識別機能。而隨著大豆卵磷脂加量增加, 其有效提高黃鱔血清中堿性磷酸酶的活性, 改善了黃鱔血清免疫識別的機能, 而酸性磷酸酶活性的下降, 可能因磷脂參與細(xì)胞膜構(gòu)成, 改善細(xì)胞膜通透性, 減少了酸性磷酸酶胞外釋放量; 同時血清中免疫球蛋白M水平下降, 可能因豆粕的抗原性難以消解[2], 黃鱔對豆粕產(chǎn)生抗性導(dǎo)致免疫球蛋白M水平上升, 而隨著大豆卵磷脂添加緩解了此類現(xiàn)象, 但具體機制有待進(jìn)一步研究。

3.3 低魚粉高脂飼料中添加大豆卵磷脂對黃鱔腸道結(jié)構(gòu)與菌群的影響

腸道為魚體營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所, 腸道結(jié)構(gòu)對動物的整體健康狀況和營養(yǎng)素的利用具有重要作用[37]。對比正常魚粉組, 低魚粉高脂飼料中高豆粕的攝入導(dǎo)致黃鱔腸道皺襞斷裂損傷嚴(yán)重, 腸道多處皺襞出現(xiàn)破裂, 從而嚴(yán)重影響黃鱔的腸道健康。而大豆卵磷脂的添加并未顯著改善過量豆粕配置引起的腸道結(jié)構(gòu)損傷, 但使腸皺襞完整性與密集性一定程度上得到恢復(fù), 可能因飼料中大豆抗原蛋白等抗?fàn)I養(yǎng)因子持續(xù)破壞腸皺襞結(jié)構(gòu), 以致大豆卵磷脂難以完全修復(fù)腸皺襞其損傷[33]。此外, 適宜的腸刺激可促進(jìn)杯狀細(xì)胞分化, 而低魚粉高脂飼料組由于黃鱔腸結(jié)構(gòu)持續(xù)遭受的高豆粕飼料刺激, 使腸道自我防御失衡, 導(dǎo)致腸道杯狀細(xì)胞數(shù)目減少,以至于大豆卵磷脂的添加并不能顯著改善其數(shù)目;而低魚粉高脂飼料組的肌層厚度顯著上升, 可能是因高纖維素飼料有使腸道肥大的作用[38], 而大豆卵磷脂可潤滑腸道內(nèi)容物, 減輕腸道蠕動壓力, 促使肌層厚度適應(yīng)性下降。總的來說, 大豆卵磷脂改善腸道不利影響的特性在前言已述, 如果選用去除大部分抗原因子的植源性蛋白, 應(yīng)可緩解黃鱔腸道損傷, 推進(jìn)低魚粉高脂飼料的應(yīng)用。

腸道微生物與機體免疫系統(tǒng)是協(xié)同進(jìn)化的。結(jié)合上面的組織結(jié)構(gòu)和免疫指標(biāo)變化, 本試驗中攝食低魚粉高脂飼料的黃鱔可能發(fā)生了腸道菌群失調(diào)。研究發(fā)現(xiàn), 營養(yǎng)條件的改變, 誘使腸道菌群失調(diào), 去除互作弱相關(guān)的菌種, 篩選或促生互作強相關(guān)菌種, 長期干預(yù)下形成新的群落穩(wěn)態(tài)[39]。在本試驗中, 低魚粉高脂飼料促使腸道微生物菌落多樣性改變, 而低魚粉高脂飼料中大豆卵磷脂的添加進(jìn)一步提高了黃鱔腸道微生物群落豐富度與多樣性, 促使特有物種數(shù)目增多。

本研究中變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和綠彎菌門為黃鱔腸道中主要菌門, 其中變形菌門為所有試驗組最占優(yōu)勢的菌門。變形菌門多為兼性厭氧性的革蘭陰性菌, 可產(chǎn)生脂多糖與促炎癥蛋白物質(zhì), 影響機體免疫狀態(tài)[40]。放線菌門的微生物能合成抗生素次級代謝物, 從而抑制腸道中有害菌的生長, 維護(hù)腸道健康[41]。綠彎菌門在水生動物上鮮有研究, 其菌屬可能參與碳水化合物分解利用, 產(chǎn)生多糖和黃酮類化合物等活性物質(zhì), 對腸道免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)[42]。在低魚粉高脂飼料中添加大豆卵磷促使腸道菌群組成改變, 這與Tilocca等[39]提出的飼料成分可影響機體腸道菌群組成的研究結(jié)果相似, 大豆卵磷脂可能通過調(diào)控短鏈脂肪酸分解代謝,來限制兼性厭氧性菌的能量獲取, 從而下調(diào)腸道菌群內(nèi)變形菌門的相對豐度, 進(jìn)而增加放線菌門與綠彎菌門生態(tài)空間, 減緩低魚粉高脂飼料對黃鱔腸道菌群的壓力[43]。而在屬水平上來看, 相對豐度前四的菌屬依次為不動桿菌屬、假單胞菌屬、紅桿菌屬和考克氏菌屬, 這些菌屬皆屬于變形菌門。不動桿菌屬下多為致病菌, 菌種產(chǎn)生毒力因子, 參與抗生素耐藥性與免疫逃避[44], 而考克菌屬的菌種能溶解角質(zhì), 大多發(fā)現(xiàn)于哺乳動物致病部位, 對腸道穩(wěn)態(tài)有脅迫作用[45]。本試驗低魚粉高脂飼料組因飼料中豆粕與高脂的影響, 誘使腸道微生物氧化應(yīng)激與炎癥風(fēng)險增加, 從而有害菌種豐度上升, 而大豆卵磷脂的添加顯著下調(diào)此類致病性屬相對豐度, 紅桿菌屬相對豐度顯著上升。在中華絨螯蟹[46]中及趙志平等[47]的研究發(fā)現(xiàn), 紅桿菌屬下菌種多為固氮抗病菌, 可降解多環(huán)芳烴等有毒有害物質(zhì), 說明大豆卵磷脂的添加可在一定范圍內(nèi)控制有害菌與有益菌的豐度, 從而調(diào)控腸道環(huán)境, 促使腸道菌群豐富度與多樣性增加, 在一定范圍內(nèi)緩解低魚粉高脂飼料對黃鱔腸道菌群的影響。

綜上, 在22%魚粉、52%豆粕和9%粗脂肪的飼料條件下, 添加2%大豆卵磷脂可促進(jìn)脂肪代謝和提高機體免疫性能, 并修復(fù)腸道組織結(jié)構(gòu)與維持菌群穩(wěn)態(tài), 進(jìn)而緩解低魚粉高脂飼料對黃鱔生長的負(fù)面影響。