抗大口黑鱸彈狀病毒發酵中草藥的篩選及其效果評價

曾榮博 劉 爽 張玉軍 李 陳 余艷枝 李元平肖運才 劉學芹

(1.華中農業大學水產學院, 農業微生物資源發掘與利用全國重點實驗室, 武漢 430070; 2.湖北省水生動物病害防控工程技術研究中心, 武漢 430070; 3.湖北華大瑞爾科技有限公司, 武漢 430070; 4.華中農業大學動物醫學院, 武漢 430070)

大口黑鱸(Micropterus salmoides)是我國重要的淡水養殖魚類, 又名加州鱸, 黑鱸等。因其肉質鮮美, 無肌間刺, 營養價值高, 深受消費者喜愛, 現已成為我國重要的淡水養殖魚類之一[1,2]。大口黑鱸彈狀病毒(Micropterus salmoidesrhabdovirus, MSRV)屬于彈狀病毒科, 是單股負鏈RNA病毒, 病毒粒子形態似棒狀或子彈狀[2]。這種病毒會造成較高的死亡率, 使大口黑養殖行業遭受嚴重的經濟損失。MSRV基因組共有5個開放閱讀框(ORFs), 分別編碼5種不同結構的蛋白, 分別為磷蛋白(Phosphoprotein, P)、糖蛋白(Glycoprotein, G)、核蛋白(Nuclear protein, N)、RNA聚合酶(RNA polymerase, L)和基質蛋白(Matrixprotein, M), 3′端到5′端的排列順序為N-P-M-G-L[3]。大口黑鱸彈狀病毒病的暴發有很強的季節性, 多發于每年春季的4、5月和秋季的10、11月, 最易感水溫為25—28℃, 水溫急劇升高或降低時易發。MSRV主要感染2—5 cm的幼魚, 該病毒傳染性強, 致死率高, 1周內死亡率高達90%[4]。MSRV不僅能夠通過養殖水體水平傳播, 還可以通過繁殖垂直傳播[5]。感染MSRV后可導致病魚鰓部有出血點、體色發黑、體表出血、攝食停止、呈不規則或螺旋游泳狀態、身體彎曲、鰭部出現潰爛、拖便等癥狀。組織病理學觀察可發現肝臟呈“花肝”樣, 肝、脾、腎腫大、充血; 胃、腸較空, 沒有食物[6]。近年來大口黑鱸彈狀病毒嚴重危害大口黑鱸養殖行業。

中草藥具有抗病毒、抗菌和抗寄生蟲作用[7]。發酵后的中草藥能夠提高活性物質的含量, 增強藥效; 降低中草藥的毒性; 還可以產生新活性成分, 提高中草藥的利用率和降低副作用的優勢[8], 在我國病害防治方面具有較廣闊的應用前景。并因其價格低廉, 作用廣泛, 在水產養殖行業也得到應用。發酵中草藥可以增強機體抗病能力, 提高機體免疫力, 提高藥效和抗病毒作用等。湯菊芬等[9]在對吉富羅非魚進行免疫保護率測定時, 使用發酵中草藥制劑的實驗組效果最好, 說明這些中草藥對增強羅非魚的抗病力效果都有非常顯著的效果。謝炎福[10]使用發酵中草藥后, 鯽存活率明顯高于單純使用復方中草藥的對照組, 說明中草藥發酵劑對鯽出血性疾病有較好的療效。由于發酵中草藥在抗病毒方面具有良好的效果, 因此近年來發酵中草藥得到廣泛關注和研究。

病毒性疾病是我國大口黑鱸養殖行業可持續發展的一個重要制約因素, MSRV導致的大口黑鱸彈狀病毒病, 病程短, 死亡率高, 對大口黑鱸養殖行業帶來了巨大的經濟損失。良好的檢測方法對病毒性疾病的預防和診斷也至關重要, 張敏琳等[11]基于CRISPR/Cas13a系統結合等溫擴增MIRA技術建立的MSRV檢測方法, 方便快捷、靈敏度高、特異性高, 具有較大的應用和推廣前景。目前針對MSRV,暫無有效的藥物治療和預防。因此本實驗基于湖北華大瑞爾公司開發的8種發酵中草藥, 篩選出能夠對MSRV具有抑制效果的發酵中草藥, 在細胞水平、活體水平上進行安全性、有效性驗證, 為發酵中草藥在水產養殖行業的應用提供理論依據, 為魚類傳染病的防控提供科學支撐。

1 材料與方法

1.1 細胞及毒株

鯉上皮瘤細胞(Epithelioma papulosum cyprini cells, EPC)來源于筆者所在實驗室細胞庫。MSRV毒株為本實驗室分離保存[12]。

1.2 實驗試劑

2×TaqPCR Mix、反轉錄酶、DNA Marker、購自TaKaRa公司; M199細胞基礎培養液購自Hyclone; 胎牛血清(FBS)購自Gibco公司; MTT試劑盒購自碧云天公司; 2×SYBR 購自愛博泰克生物有限公司;SteadyPureVirus病毒DNA/RNA提取試劑盒購自艾科瑞生物公司。

1.3 引物序列

本研究所用引物序列見表1。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.4 發酵中草藥來源、成分及有效物質的提取

8種發酵中草藥由湖北華大瑞爾有限公司提供,名稱依次為L1、L2、L3、L4、L5、X1、X2和ZHS(表2)。發酵中草藥是使用1—2 cm的中藥材, 將其混合物浸入50%水分的水中, 加熱至80℃ 1h, 然后冷卻至37℃。發酵菌種使用枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和釀酒酵母菌進行聯合發酵, 將3種益生菌按不同比例加入加工后的中草藥混合物中, 發酵72h,干燥, 粉碎而成。

表2 八種發酵中草藥成分信息Tab.2 Ingredient information for 8 fermented Chinese herbs medicine

稱取5 g發酵中草藥置于燒杯中, 加入100 mL純凈水, 溫度設置為100℃, 放置恒溫磁力攪拌器上進行熬制。熬制揮發至50 mL (濃度為100 mg/mL)時, 冷卻后使用0.22 μm濾器過濾, 過濾后分裝保存。

1.5 發酵中草藥對細胞的毒性檢測

將不同濃度的發酵中草藥加入96孔板中, 孵育24h后使用MTT法, 同時設置調零孔(培養基、MTT和MTT溶解液), 對照孔(細胞、培養液、MTT和MTT溶解液), 酶標儀在570 nm測定吸光度。

1.6 抗MSRV的發酵中草藥的篩選

使用0.1 MOI接毒劑量感染EPC細胞, 置于28℃培養箱中1h, 在5%維持培養基中加入40 μL發酵中草藥藥液, 離心混勻后加入細胞孔中, 24h后用TRIzol收集細胞孔中貼壁細胞, 提取細胞RNA, 而后反轉錄為cDNA, 使用qRT-PCR法檢測抗病毒效果。qRT-PCR反應程序: 95℃ 3min; 94℃ 25s; 55℃25s; 72℃ 15s, 35個循環; 72℃ 10min。

1.7 發酵中草藥在細胞水平上的抗MSRV效果

在安全濃度范圍內, 選用不同濃度梯度的藥物探究藥物濃度對抗病毒效果的影響。分別設置攻毒組, 預防組, 共育組, 治療組。

(1)攻毒組: 用0.1 MOI MSRV緩慢加入細胞孔中, 置于28℃培養箱中, 并在1h后更換5%維持培養基。

(2)預防組: 取3個1.5 mL EP管, 每管加入1 mL MEM基礎培養基, 依次加入20、40和80 μL熬制后的發酵中草藥藥液, 即終濃度為2、4 和8 mg/mL,短暫離心并混勻后緩慢加入細胞孔中, 置于28℃培養箱中, 4h后棄去培養基, 緩慢加入0.1 MOI MSRV,并在1h后更換5%維持培養基。

(3)共育組: 取3個1.5 mL EP管, 每管加入0.1 MOI MSRV, 依次加入20、40和80 μL熬制后的發酵中草藥藥液, 即終濃度為2、4 和8 mg/mL, 短暫離心并混勻后緩慢加入細胞孔中, 置于28℃培養箱中, 并在1h后更換添加5%血清的維持培養基。

(4)治療組: 將3個細胞孔中緩慢加入0.1 MOI MSRV, 置于28℃培養箱中, 并在1h后棄去病毒液。取3個1.5 mL EP管, 每管加入1 mL添加5%血清的維持培養基, 依次加入20、40 和80 μL熬制后的發酵中草藥藥液, 即終濃度為2、4 和8 mg/mL,短暫離心并混勻。

24h后收集細胞上清, 凍存于-80℃冰箱, 用于空斑實驗。每孔用1 mL TRIzol將貼壁細胞緩慢吹打下來, 吸出后放入2 mL EP管中。用TRIzol法提取RNA后并進行反轉錄為cDNA, 使用qRT-PCR法檢測抗病毒效果。

1.8 空斑實驗(Plaque assay)

本實驗使用空斑實驗檢測病毒滴度, 實驗步驟: (1)將細胞接種到24孔板中, 待單層細胞長至100%用于病毒感染; (2)無血清培養基洗滌細胞兩次, 每個樣品取5個2 mL EP管, 每管中加入1800 μL基礎培養基, 在第一管中加入200 μL樣品, 震蕩混勻吸取200 μL后加入第2個EP管中, 以此類推, 10倍梯度稀釋病毒。在24孔板中每孔加入500 μL的病毒液, 每個濃度做3次重復, 置于28℃培養箱孵育1h; (3)用無血清培養基清洗1次, 加入1 mL含有甲基纖維素半固體培養基; (4) 28℃培養箱繼續培養60—72h, 待形成肉眼可見空斑后用10%的甲醛固定12h, 自來水沖洗干凈; (5)倒扣在吸水紙上晾干,加結晶紫染色液染色3h, 自來水沖洗干凈后晾干,計算讀數。

1.9 大口黑鱸攜帶病毒檢測

大口黑鱸28℃暫養7d后, 隨機取3條, 勻漿后混勻。使用DNA/RNA提取試劑盒進行RNA/DNA提取。采用特異性引物進行PCR檢測有無攜帶病毒。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.10 發酵中草藥對魚體的毒性實驗

大口黑鱸28℃暫養7d后, 取50條分為5個組, 沿胸鰭基部注射0、5、20、100和1000 μg (體積為10 μL)發酵中草藥藥液, 記錄死亡率。

1.11 發酵中草藥在魚體水平抗MSRV效果檢測及效果評定

大口黑鱸28℃暫養7d后, 取150條分為5個組做不同處理, 分別為藥物組、對照組、攻毒組、預防組、治療組。

藥物組: 沿胸鰭基部注射10 μL發酵中草藥藥液, 注射30條;

對照組: 沿胸鰭基部注射10 μL MEM基礎培養基, 注射30條;

預防組: 沿胸鰭基部注射10 μL的發酵中草藥藥液, 36h后, 將107PFU的MSRV用MEM基礎培養基稀釋10倍后, 沿胸鰭基部注射10 μL;

治療組: 將107PFU的MSRV使用發酵中草藥藥液稀釋10倍后, 沿胸鰭基部注射10 μL;

攻毒組: 使用MEM基礎培養基將107PFU的MSRV稀釋10倍后, 沿胸鰭基部注射10 μL。觀察10d, 記錄死亡率和存活率。并同時設置取樣組, 取大口黑鱸肝臟組織和脾臟組織, 做HE染色病理切片及組織病毒載量檢測。用TRIzol法提取RNA后并進行反轉錄為cDNA。通過qRT-PCR的方法檢測MSRV-G基因的水平, 來檢測X1藥物不同濃度不同處理方式抗MSRV的能力。

1.12 組織病理學觀察

分別取魚的肝、脾組織, 4%多聚甲醛固定24h,各組織分別經70%、80%、95%和100%乙醇脫水,二甲苯透明、石蠟包埋切片(5—7 μm)、HE染色,最后在顯微鏡下觀察、拍照。

2 結果

2.1 MTT法檢測發酵中草藥對細胞的毒性

通過MTT法檢測發酵中草藥(L1、L2、L3、L4、L5、X1、X2和ZHS)對細胞的毒性, 結果表明發酵 中 草藥L1、L2、L3、X1、X2和ZHS未對EPC細胞造成明顯的損傷和毒性, 細胞存活率無顯著差異。中草藥L4和L5在4 mg/mL時對細胞造成損害, L4處理后細胞存活率下降約50%, L5處理后細胞存活率下降80%。此外, 中草藥X1和X2表現出促進EPC細胞生長的作用(圖1)。

圖1 八種發酵中草藥對 EPC細胞的毒性檢測Fig.1 The toxicity of eight kinds of fermented Chinese herbal medicines to EPC cells

2.2 抗MSRV的發酵中草藥篩選

MSRV感染EPC細胞后, 在12孔板中加入8種中草藥, 24h后收取細胞樣。根據qRT-PCR檢測結果表明, 8種發酵中草藥對MSRV都有明顯的抗病毒效果, 能夠顯著抑制MSRV的感染, 其中X1效果最好(圖2), 因此選X1藥物進行后續的效果評價實驗。

圖2 八種發酵中草藥抗MSRV的效果篩選Fig.2 Screening of the anti-MSRV effects of eight fermented Chinese herbal medicines

2.3 X1藥物在細胞水平上的抗MSRV效果

使用不同方式進行處理EPC細胞后, 24h后收取細胞樣。qRT-PCR檢測結果表明X1藥物3種處理方式對MSRV都有明顯的抗病毒效果, 且治療組效果最為明顯, 其次為預防組和共育組。其中在治療組和共育組, X1藥物表現出其抗病毒效果與藥物濃度呈正相關關系(圖3A—C)。

圖3 發酵中草藥X1在細胞水平上的抗MSRV效果Fig.3 Anti-MSRV effect of fermented Chinese herbal medicine X1 at the cellular level

收集細胞病毒上清, 通過空斑實驗檢測X1藥物抗MSRV的能力。空斑實驗結果表明經過X1藥物處理后, 預防組、共育組和治療組都使MSRV的病毒滴度降低10倍左右。其中共育組和治療組抗病毒效果與藥物濃度呈正相關關系, 濃度為8 mg/mL時效果最好。預防組在濃度為4 mg/mL時效果最為顯著(圖3D—G)。

2.4 大口黑鱸攜帶病毒檢測

為檢測大口黑鱸是否攜帶其他病毒, 針對大口黑鱸易攜帶的病毒(LMBV、ISKNV、MSRV和NNV)進行檢測。通過PCR基因擴增瓊脂糖凝膠電泳后,未看到特異性條帶, 證明大口黑鱸未攜帶LMBV、ISKNV、MSRV和NNV。

2.5 發酵中草藥對魚體的毒性實驗

大口黑鱸胸鰭基部注射10 μL藥物濃度為0、0.5、2、10和100 mg/mL的發酵中草藥液, 統計死亡率。根據實驗結果表明發酵中草藥未對魚體造成傷害及死亡, 存活率100% (表3)。

表3 大口黑鱸存活率Tab.3 Survival rate of largemouth bass

2.6 X1藥物在魚體水平抗MSRV存活率檢測

設置不同處理方式, 進行大口黑鱸存活率檢測。分別為空白對照組、攻毒組、預防組、治療組、藥物對照組。處理后觀察7d, 記錄每天的死亡率。結果表明, 攻毒組在第2天出現大量死亡, 第4天時全部死亡, 存活率為0; 預防組和治療組均能提高大口黑鱸存活率, 預防組存活率提高10%, 治療組存活率提升20%, 治療組效果優于預防組(圖4)。

圖4 大口黑鱸存活率檢測Fig.4 Results of largemouth bass survival assay

2.7 X1 藥物對大口黑鱸肝臟、脾臟組織病毒載量作用的結果

根據大口黑鱸不同組織病毒載量檢測結果表明, 第1天在肝臟組織中, 預防組和治療組對MSRV的增殖有明顯抑制效果; 在脾臟組織中, 預防組與攻毒組相比差異不顯著; 治療組對MSRV具有明顯的抑制效果。第3天在肝臟組織中, 預防組和治療組與攻毒組相比都具有明顯差異; 在脾臟組織中,預防組和攻毒組病毒載量差異不顯著, 治療組具有顯著差異。綜上結果, X1對MSRV具有良好的抗病毒作用(圖5)。

圖5 大口黑鱸組織病毒載量測定Fig.5 Measurement of tissue viral load in largemouth bass

2.8 組織病理學觀察

大口黑鱸肝臟組織切片觀察發現對照組肝臟組織結構正常, 肝索、肝細胞排列緊密; 肝竇未見擴張。治療組未見明顯變化; 預防組少量肝細胞輕度水腫; 攻毒組視野內大量肝細胞輕度水腫, 細胞腫脹, 胞漿淡染, 可見大量圓形空泡, 肝實質內可見炎癥細胞浸潤(圖6)。

圖6 大口黑鱸肝臟組織切片Fig.6 Liver tissue sections of largemouth bass

大口黑鱸脾臟組織切片觀察發現, 預防組和治療組與對照組相比未見明顯異常, 脾組織結構正常。攻毒組脾組織結構異常, 視野內脾組織明顯水腫, 部分細胞呈空泡樣變性, 組織間隙增大, 紅髓內小淋巴細胞數量明顯減少(圖7)。

3 討論

水產養殖病害已嚴重影響了我國水產養殖業的健康可持續發展, 并且病毒性傳染病對水產養殖行業危害巨大, 其傳播速度快, 能夠造成魚體大量死亡。大口黑鱸肉質鮮美, 營養價值高, 經濟價值高, 屬于名特優魚類。然而大口黑鱸養殖業受到病毒的威脅, 其中大口黑鱸彈狀病毒主要感染大口黑鱸幼魚導致較高的死亡率, 是大口黑鱸主要的病原。近年來MSRV對水產養殖行業帶來的危害逐年遞增, 我國多地報道了MSRV感染事件, 給大口黑鱸養殖行業帶來了一定的經濟損失。目前針對該病毒無有效的商品化治療手段, 對MSRV的防治以疫苗和藥物開發為主要方向。大口黑鱸彈狀病毒疫苗已經有減毒活疫苗及亞單位疫苗的相關研究, 使用疫苗后可以提高非特異性免疫水平和特異性的抗體水平, 在實驗室水平下都有可觀的保護率[13—16]。但是MSRV的主要感染對象是幼魚, 沒有成熟的免疫系統, 接種疫苗后很難產生較強的免疫應答, 疫苗的商品化應用存在一定難度。鑒于此, 針對MSRV的藥物開發是一種更有效的治療手段, 有研究發現多種天然植物提取物及合成的化合物具備作為治療MSRV藥物的潛力。張雨[17]篩選出3種對MSRV具有明顯抑制效果的化合物, 分別為鳥嘌呤核苷、阿糖腺苷、牛蒡子苷元。對MSRV的抑制率分別為95.77%、83.3%和54.73%。Yang等[18]研究結果表明利巴韋林對MSRV也具有良好的抗病毒效果,能夠抑制MSRV感染的CPE和核損傷, 這一發現可為水產養殖抗MSRV藥物的發現和開發提供參考。杭小英等[1]選擇了8種中草藥(板藍根、黃芪多糖、白花蛇舌草、金銀花、黃藤素、葡萄糖酸鋅、白芍及連翹)進行體外抗病毒實驗, 結果表明,黃芪多糖、白芍、金銀花等對MSRV都有良好的抗病毒效果。中草藥是中國特有的技術, 已經從中草藥中發現大量有效的藥物, 由于其低耐藥性、低毒性, 從中草藥中開發治療MSRV的藥物也是有效的嘗試。

3.1 發酵中草藥X1顯著抑制MSRV感染

本研究中篩選出發酵中草藥X1, 在細胞水平上和魚體水平上對MSRV有較好的抗病毒效果, 其成分為魚腥草、板藍根、南芪和杏仁。有研究表明,魚腥草水提物通過阻斷NF-κB的激活來阻斷單純皰疹病毒2型的感染, 從而發揮抗病毒效果[19]; 而魚腥草揮發油提取物對1型皰疹病毒具有良好的抗病毒效果; 并且魚腥草揮發油在發揮其抗病毒效果時, 對細胞無毒性[20]。此外, 魚腥草對其他病毒(EV71、DENV-2、NDV、ZIKV等)也具有良好的抗病毒效果。板藍根的主要成分為板藍根多糖, 板藍根多糖能夠直接作用8種流感病毒和殺滅豬偽狂犬病毒及豬流感病毒H3N2[21]。南芪和杏仁研究相對較少, 南芪具有提高抗應激能力, 增強免疫功能和補血作用[22]。杏仁具有抗炎, 抗腫瘤, 免疫調節等藥理作用[23]。因此, 在X1復方發酵中草藥中, 可能是魚腥草和板藍根主要發揮了抗病毒作用, 南芪和杏仁可能發揮了抗應激、抗炎等功能。

本研究表明X1發酵中草藥對MSRV具有良好的抗病毒效果, 在細胞水平上的實驗結果能夠表明X1能夠顯著抑制MSRV感染, 在魚體水平上對大口黑鱸的存活率提高了20%。相關研究表明, 厚樸酚及其衍生物在濃度為40 mg/kg時將大口黑鱸的存活率提高了72%; 幾種香豆素類化合物在體外也具有顯著的抗SVCV效果, 但是在體內的抗病毒效果也并不顯著, 導致這一原因可能是由于藥物在魚體內代謝過快或是藥物利用率低等。因此本研究推測是由于藥物濃度低, 魚體代謝快, 利用率較低等導致在魚體上抗病毒效果不佳。后續可具體探究發揮其抗病毒效果的有效成分, 對有效成分進行提取或合成化合物, 在實際應用中發揮作用。

3.2 發酵中草藥的給藥方式

本研究使用魚體注射的方式, 注射具有吸收快,藥物直接進入體內發揮作用等優點。研究表明腹腔注射8-羥基喹啉及熊果酸都可以分別提高15%和12.5%的鱸感染MSRV的相對存活率[24,25]。所以我們首先使用了注射的方式評價X1發酵中草藥對MSRV感染大口黑鱸的影響。未探究與口服、浸泡等其他使用方式之間的差異。某些中草藥使用浸泡、潑灑、口服等方式也可以發揮較好的效果。在水產養殖行業的實際應用上, 注射的給藥方式成本高, 操作不便, 且注射方式可能會對幼魚產生應激, 且會對魚體產生機械性損傷, 從而會導致幼魚存活率降低。因此, 注射產生的效果與口服給藥的效果在差異不顯著的情況下, 口服給藥的方式更具有操作簡便、可行性強、成本低的優勢。不同的提取方式帶來的效果也可能存在差異, 應根據中草藥在實際應用時來選定最適合最有效的使用方法。在后續的研究中, X1發酵中草藥的口服給藥、浸泡給藥等其他使用方式也是值得進一步探究的。

本研究篩選出對MSRV具有良好抗病毒效果的中草藥, 并從體外實驗和魚體實驗評定其抗病毒效果, 這為中草藥及發酵中草藥在水產養殖中的防控應用提供參考依據, 為中草藥抗水產病毒性疾病及將來開發抗病毒藥物具有重大意義。