草魚nrf1基因的克隆與表達及其應激響應研究

莫郁堅 易成琳 肖揚波 楊立權 宋世航 湛瑞杰 夏浩云 孫 琳 周羅璟 瞿符發 唐建洲 劉 臻 曹申平

(長沙學院生物與化學工程學院, 水生動物營養與品質調控湖南省重點實驗室, 長沙 410022)

應激反應是指動物體在受到內外環境的各種刺激時所產生的非特異全身反應[1]。應激不僅會破壞動物機體的內穩態, 同時, 還對消化系統、呼吸系統和免疫系統造成損傷, 進而影響動物生長性能,甚至危害生命[2]。在水產養殖過程中, 應激反應的來源有很多種。比如, 在高密度集約化養殖過程中,殘留飼料和排泄物的氨化作用會使魚類受到持續性氨氮脅迫, 氨氮脅迫會引發其體內氧化應激反應,并激活其抗氧化應激系統, 清除應激反應產生的自由基[3,4]。此外, 飼料中高含量的植物性粕類, 由于抗營養因子的存在, 往往也會損傷動物腸道上皮細胞, 誘導腸道炎癥, 造成應激反應[5]。

跨膜轉錄因子核因子E2相關因子1 (Nuclear factor-erythroid 2 related factor 1,nrf1)是堿性亮氨酸拉鏈CNC-Bzip (cap’n’collar basic-region leucine zipper)家族成員之一[6]。CNC-Bzip家族成員目前包 括Nrf1 (Nuclear factor-erythroid 2 related factor 1)、Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2 related factor 2)、Nrf3 (Nuclear factor-erythroid 2 related factor 3)、p45-NFE2 (p45 Nuclear factor-erythroid 2)、Bach1 (BTB domain and CNC homolog 1)、Bach2 (BTB domain and CNC homolog 2)、SKn-1 (Skinhead-1)、CNC蛋白[7]。nrf1廣泛存在于動物機體各組織[8], 在動物體內有著調節抗氧化應激反應、抗炎癥與抗癌癥反應, 維持細胞和器官的正常發育等多方面作用[9]。研究表明, 敲除小鼠胚胎中nrf1基因將會導致胚胎死亡[10]; 閻煜等[11]在敲除人肺癌A594細胞nrf1基因時, 發現肺癌細胞增殖速度顯著提高; Chen等[12]培育nrf1缺失的小鼠嵌合肝細胞時發現, 缺失nrf1的肝細胞會發生嚴重的氧化應激反應, 進而引發小鼠肝細胞的大量凋亡和組織壞死。在水產動物中的研究發現, 凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)體內存在著nrf1介導的抗應激系統, 該系統在應對副溶血弧菌感染引發的氧化應激和內質網應激反應中起著至關重要的作用[13]。大西洋鳉(Atlantic killifish)和金頭鯛(Sparus aurata)經低溫處理, 代謝速率會迅速下降, 而nrf1的表達量卻逐漸增加, 且其表達量增加速率與溫度下降速率緊密相關[14,15]。然而,目前尚未有關于淡水魚類中nrf1基因分子特征與功能的研究報道。

草魚(Ctenopharyngodon idella), 屬鯉形目鯉科草魚屬, 是四大家魚之一, 是目前中國養殖產量最大的淡水經濟魚類[16]。作為我國高密度集約化養殖模式的代表性品種, 草魚養殖過程由于養殖密度過高、投餌過量導致養殖水體氨氮和亞硝態氮增多的問題頻繁發生; 同時, 作為草食性魚類, 其配合飼料中植物性成分比例遠高于其他養殖品種。本實驗以草魚為實驗對象, 克隆草魚nrf1基因CDS區,進行生物信息學分析; 采用實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR)進行各組織中表達量的分析檢測; 進而通過急性氨氮脅迫實驗和不同蛋白源飼料的營養生長實驗, 探究草魚體內nrf1基因在不同營養和環境應激條件下的變化和調節作用。

1 材料與方法

1.1 養殖實驗和組織取樣

實驗用草魚購于湖南省水產科學研究所(湖南,中國)。所有魚類均在4%的鹽水中浸泡20min, 然后轉移到室內循環水養殖系統。在養殖實驗開始前,將所有草魚置于室內循環水養殖系統2個1500 L養殖缸中暫養馴化2周, 使用商品飼料每天投喂兩次(8:30和14:30)。實驗魚飼養在湖南省長沙市長沙學院室內循環水養殖系統中, 光照周期為12 L/12 D(8:00—20:00), 水溫為(28±2)℃。每周監測水體溶氧和氨氮,溶氧＞7.0 mg/L, 氨氮＜0.1 mg/L。pH為6.5—7.2。

養殖實驗結束, 實驗魚禁食24h后分別從各缸撈出, 經MS-222 (50 mg/L)麻醉, 冰上解剖取樣相關組織。取樣后將組織立即放入液氮中凍存, 然后轉移至-80℃保存, 直至分析。

1.2 nrf1在各組織中的表達模式和晝夜節律規律

實驗草魚在室內循環水養殖系統馴化2周后,禁食24h, 隨機選取大小相近、健康狀況良好的5尾魚(30.00±0.45) g經MS-222麻醉后冰上解剖收集草魚肝臟、腸道、心臟、腎臟、脾臟、腦和肌肉組織, 以檢測nrf1的組織表達模式; 為探究nrf1表達量的晝夜規律, 分別在同1天8個時間點(03:00、06:00、09:00、12:00、15:00、18:00、21:00和24:00)隨機取3尾草魚(30.00±0.45) g解剖取肝臟組織, 通過qRT-PCR分析nrf1的表達水平。

1.3 氨氮脅迫對草魚肝臟nrf1基因表達的影響

采用氯化銨(國藥集團, 上海)調整水體氨氮濃度, 共設置3個處理組: 對照組(經充分曝氣的自來水)、低氨氮組(氨氮濃度為5 mg/L)和高氨氮組(氨氮濃度為20 mg/L), 每個處理組分配3個實驗養殖缸。實驗前將魚禁食24h, 選取規格均一、健康狀況良好的個體(30.00±0.45) g, 稱重后放入各實驗養殖缸(100 L)中, 每缸15尾實驗魚。分別在實驗開始后0、24h和48h, 每缸撈取3尾魚, 每組9尾魚, 通過qRT-PCR對所取的魚肝臟組織樣品進行基因表達水平分析。

1.4 不同蛋白源對草魚nrf1基因表達的影響

實驗設計了3種等氮等脂等能但主要蛋白源不同的實驗飼料, 實驗配方如表1所示, 分別為魚粉(FM)組, 菜粕(RM)組和豆粕(SM)組。每個處理組3個平行, 每個平行15尾實驗魚(30.00±0.45) g, 采用室內循環水進行養殖, 每日于8:30和14:30飽食投喂2次。在養殖實驗開始后14d、21d、28d和35d, 每缸取2尾魚, 冰上解剖取腸道組織, 使用qRT-PCR分析nrf1基因的相對表達水平。

表1 飼料配方及化學組成(干物質, %)Tab.1 Formula and chemical composition of diets (dry matter, %)

1.5 RNA提取和cDNA合成

使用Trizol試劑(TaKaRa, Kusatsu, 日本)用于從草魚各組織中分離總RNA。使用1%瓊脂糖凝膠電泳測定RNA質量。通過分光光度計(BioPhotometer Eppendorf, Hamburg, 德國)評估RNA的 純 度 和 濃度。參照PrimeScrip反轉錄試劑盒(TaKaRa, Kusatsu,日本)說明書合成第一鏈cDNA。

1.6 nrf1基因克隆

以草魚心、肝、脾、肌、腸混合組織cDNA作為模板進行nrf1基因克隆?；贜CBI上已公布的草魚近似物種的nrf1基因編碼保守區序列, 利用軟件Primer Premier5.0軟件設計克隆引物(表2), 并委托擎科生物科技有限公司(湖南, 中國)合成引物。對cDNA模板進行PCR擴增, PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和分離, 用DNA回收試劑盒(艾科瑞,湖南, 中國)回收并純化目的PCR產物, 將目的產物連接到pMD19-T載體(TaKaRa, Kusatsu, 日 本)上,然后轉化到感受態大腸桿菌DH5 α細胞中, 選擇陽性克隆由擎科生物科技有限公司測序。PCR反應體系(25 μL): 12.5 μL PremixTaqTMHot Version, 1 μL cDNA, 正反引物各1 μL, 9.5 μL ddH2O。PCR擴增程序為: 94℃預變性3min; 94℃變性30s, 53℃退火30s, 72℃延伸1min, 3個循環; 72℃延伸7min。

表2 用于草魚nrf1基因克隆和熒光定量PCR的引物序列Tab.2 Primers used for nrf1 cloning and RT-PCR of Ctenopharyngodon idella

1.7 實時熒光定量PCR檢測

使用Bio-Rad CFX96TM實時PCR系統(Bio-Rad,Hercules, CA, 美國)檢測nrf1基因表達水平。實驗選取β-actin作為內參基因, 使用軟件Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物, 引物序列見表2。PCR反應體系(16 μL)為: 1 μL cDNA模板, 8 μL 2× SYBR?Green ProTaqHS Premix(湖南艾科瑞生物工程有限公司, 長 沙), 正反 引 物各0.64 μL, 0.32 μL ROX Reference Dye (20 μmol/L), 5.4 μL ddH2O。擴增程序: 95℃預變性10min; 95℃ 15s, 60℃ 1min, 進行40個循環。qRT-PCR實驗數據使用2-ΔΔCt法進行分析[17]。

1.8 草魚nrf1序列分析

使用NCBI在線程序ORF (Open Reading Frame,開放閱讀框) Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)推測氨基酸序列, 再使用ExPASy (http://www.expasy.org/tools)預測分子量和等電點。利用SMART (http://smart.embl-hei-delberg.de/)預測蛋白結構域。利用MEGA 11軟件的鄰接法基于多重比對構建系統進化樹。

1.9 數據分析

使用SPSS 19.0軟件對實驗數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA), 通過Levene檢驗對數據進行方差同質性分析, 然后使用Duncan檢驗進行多重比較,P＜0.05表示差異顯著; 實驗結果均采用“平均值±標準誤”(mean±SE)表示。

2 結果

2.1 草魚nrf1克隆與序列分析

經測序得到長度為2035 bp的草魚nrf1基因序列(NCBI GenBank登記號: OM867543)。本研究克隆驗證的CDS區為64—1645 bp, 編碼519個氨基酸。分子量為55470.24 Da, 等電點為5.05。包含1個pfam域, 即Nrf1_DNA-bind。

在NCBI中比對氨基酸序列發現, 草魚nrf1與團頭魴的一致性高達99.42%。系統進化樹顯示草魚(Ctenopharyngodon idella)與團頭魴(Megalobrama amblycephala)聚為一支, 親緣關系較近, 與其他魚類聚為一簇, 與智人(Homo sapiens)、小白鼠(Mus musculus)、蘇門答臘猩猩(Pongo abelii)等哺乳動物親緣關系較遠(圖1)。

圖1 基于不同物種NRF1氨基酸序列構建的系統進化樹(NJ法)Fig.1 Phylogenetic tree of NRF1 in different species based on NJ method

2.2 草魚nrf1組織表達模式和晝夜節律表達

采用qRT-PCR分析草魚nrf1組織分布和晝夜節律表達。草魚nrf1組織分布結果如圖2所示, 草魚nrf1在肝臟、腸道、心臟、腎臟、脾臟、腦和肌肉均有表達, 各組織中表達量有顯著差異(P＜0.05)。nrf1在肝臟表達量最高, 其次是腸道與心臟, 然后是脾臟和腦, 腎臟和肌肉他組織中表達水平最低(P＜0.05)。

圖2 nrf1在草魚不同組織中的表達情況Fig.2 Relative expression of nrf1 gene in different tissues of Ctenopharyngodon idella

肝臟nrf1基因表達晝夜節律如圖3所示,nrf1基因的表達具有一定周期性, 且周期約為24h。nrf1表達量在15:00至24:00呈下降趨勢, 在24:00至9:00呈上升趨勢, 并在9:00達到一天表達量的最大值(P＜0.05)。nrf1的 表 達 水 平 在12:00和24:00較 低(P＜0.05)。

圖3 草魚肝臟nrf1的晝夜變化節律Fig.3 Circadian rhythm of nrf1 in liver of Ctenopharyngodon idella

2.3 氨氮脅迫對草魚肝臟nrf1基因表達的影響

由圖4可見, 經氨氮暴露后24h或48h,nrf1基因無論在低氨氮(5 mg/L)組和高氨氮(20 mg/L)組表達量均顯著上升(P＜0.05);nrf1在高氨氮脅迫時, 會更早(24h)出現顯著上調(P＜0.05)。在48h時低氨氮脅迫組nrf1表達量較其24h時的nrf1表達量升高。

圖4 氨氮脅迫對草魚肝臟nrf1基因表達的影響Fig.4 Effect of ammonia nitrogen stress on nrf1 gene expression in liver of Ctenopharyngodon idella

2.4 不同蛋白源對草魚nrf1基因表達的影響

如圖5所示, 飼料蛋白來源對nrf1表達具有顯著影響(P＜0.05)。在養殖后14d、28d和35d, 草魚腸道中nrf1基因在菜粕組和豆粕組相對于魚粉組均出現顯著的上調(P＜0.05), 其中28d時豆粕組nrf1表達量顯著高于魚粉組和菜粕組(P＜0.05), 21d時三者表達量則無顯著差異(P＞0.05)。

圖5 不同蛋白源對草魚腸道nrf1基因表達的影響Fig.5 Effects of different protein sources on nrf1 gene expression in intestine of Ctenopharyngodon idella

3 討論

3.1 草魚nrf1基因序列分析

本研究從草魚中克隆出nrf1cDNA開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)區長度為1560 bp, 編碼519個氨基酸, 存在一個Nrf1_DNA-bind保守結構域。鯽(Carassius auratus, XM_026209166)和 鯉(Cyprinus carpio, XM_042740248) ORF區 長 度 均為1518 bp, 斑馬魚(NC_007115) ORF區長度則為1545 bp, 與本文研究相似。NRF1系統發育樹結果顯示, 草魚與團頭魴聚為一小支, 其NRF1序列與魚類的相似性較高, 親緣較近; 而與哺乳動物的相似性則較低, 親緣較遠。這可能與動物的早期進化過程有關,nrf1在應激過程中發揮著不同的生理功能,以便于動物適應不同環境, 更有利于生存。

3.2 草魚nrf1基因組織表達及晝夜節律表達分析

NRF1作為轉錄調節因子[18], 其基因在草魚體內各組織均有表達, 在肝臟中表達程度最高, 其次是腸道與心臟, 肌肉與腎臟最低。這可能是因為肝臟是動物體內最大的解毒器官, 需要處理各種應激反應, 所以肝臟細胞相較于肌肉與腎臟的細胞更為活躍, 需要nrf1基因高表達以維持肝臟的正常生理功能。但Howe等[19]在斑馬魚上的研究發現,nrf1在斑馬魚卵巢中表達量最高; Brawand等[20]發現nrf1在尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)肝臟和眼睛中表達量最高, 其次是腦和皮膚, 而在肝臟中的表達量最低, 與本實驗的研究結果截然不同。這說明nrf1在不同魚類中存在組織表達差異性, 可能與nrf1在動物體不同發育時期所發揮功能不同有關。此外, 本實驗還研究了草魚nrf1表達的晝夜變化規律。實驗結果顯示, 草魚nrf1表達具有一定的晝夜節律。nrf1表達量在15:00至24:00呈下降趨勢, 在24:00至9:00呈上升趨勢, 并在9:00達到一天表達量的最大值。nrf1的表達水平在12:00和24:00較低。在本實驗養殖期間, 草魚于8:30、14:30進行投喂,晝夜節律實驗期間雖然沒有投喂, 但實驗魚還是表現出每日進食后0.5—1h內, 肝臟nrf1基因表達量顯著升高。馮軍廠等[21]在研究草魚小肽轉運載體PepT1基因時發現, 草魚中腸端在每日兩次投食后,PepT1表達量都會升高; 這是因為PepT1作為腸道小肽轉運載體, 草魚進食后腸道需要增加小肽轉運載體的表達量, 滿足機體對外源蛋白的消化吸收的需要。Xiao等[22]在研究湘云鯽gls1基因也發現, 喂食后一段時間后gls1基因表達量升高的現象。結合上述研究, 推測這種晝夜節律現象, 可能是由于肝臟作為魚類體內最大的消化腺和最大的解毒器官, 而草魚的攝食消化作為一種刺激信號, 誘導其肝臟nrf1基因的表達。

3.3 氨氮脅迫對草魚nrf1基因表達影響的分析

在大規模集約化的養殖過程中, 投喂的餌料及排泄的糞便會使水體氨氮濃度升高, 較高濃度的氨氮會引起魚類的氧化應激, 對其生長與健康造成嚴重損害, 甚至導致死亡[23,24]。氨氮暴露實驗結果表明, 草魚在高氨氮組和低氨氮組均出現nrf1表達量的顯著上升, 且高氨氮組則更快速的出現顯著上調,但高氨氮組在48h時nrf1表達量出現顯著下降, 而低氨氮組則還在上升。與本研究高氨氮組結果相似,黃姑魚(Nibea albiflora)經96h半致死濃度(20.23 mg/L)氨氮攻毒后, 體內錳-超氧化物歧化酶(Mn-Superoxide dismutase, Mn-SOD)在肝臟與頭腎組織中表達水平均呈現先升高后下降的趨勢[25]。孫盛明等[26]在團頭魴的研究中也發現谷胱甘肽S-轉移酶(Glutathione S-transferase, GST)基因在受到氨氮脅迫后表達水平表現先上升后下降的變化。Cao等[27]對草魚進行48h氨氮脅迫, 其腸道中抗氧化酶SOD和過氧化氫酶(Catalase, CAT)活性在低氨氮脅迫組(1.7 mg/L)和高氨氮脅迫組(50 mg/L)均顯著高于對照組, 且nrf1和hsp90(Heat stress protein 90, 熱應激蛋白90)基因在高氨氮組也表現出先顯著上調后下調的趨勢。結合以上研究結果, 可以推測本實驗草魚經氨氮脅迫后, 高氨氮組nrf1基因之所以表現先升高后下降趨勢, 是因為高氨氮濃度的刺激強烈, 使草魚更快達到氧化應激反應閾值, 肝臟快速表達nrf1, 從而抑制機體氧化應激反應, 至48h時氧化應激反應得到部分抑制, 從而nrf1表達量下降; 而低氨氮脅迫組受到的應激刺激較弱,nrf1表達則相對遲緩,24h時表達水平低于高氨氮脅迫組, 此時機體未能抑制氧化應激反應, 所以低氨氮脅迫組持續表達nrf1至48h。有研究表明, 高密度集約化養殖過程中水體氮濃度最高可達46 mg/L[28], 結合本實驗成果進一步探究或可發現nrf1在魚類抗氧化應激反應過程中的重要作用, 并為解決高密度集約化養殖過程中水體氨氮脅迫提供新的思路。

3.4 不同蛋白源對草魚nrf1基因表達影響的分析

魚粉是水產飼料中的優質蛋白源, 但將其用于飼料中的成本較高, 且產量較為有限[29]; 植物性蛋白豆粕與菜粕可以替代魚粉, 但在生產使用中二者有一定的限制, 植物性蛋白中的抗營養因子如硫葡萄糖苷、單寧、蛋白酶抑制因子等往往會損傷動物腸道上皮細胞, 破壞細胞黏膜層, 誘導腸道炎癥,進而對魚類健康和營養吸收產生毒害影響[30]。養殖實驗結果顯示, 在14d、28d和35d時, 草魚腸道中nrf1基因表達水平在菜粕組和豆粕組均顯著高于魚粉飼料組。Krogdahl等[31]以大豆蛋白代替大西洋鮭(Salmo salar)飼料中魚粉蛋白作為主要蛋白源時,大西洋鮭腸道黏膜酶活性顯著下降, 腸道固有層細胞出現炎癥反應。進一步研究發現, 以高水平的豆粕替代魚粉, 不僅會引發大西洋鮭腸道末端炎癥,且其腸道末端的胰蛋白酶活性顯著升高, 但近側小腸的胰蛋白酶活性卻下降; 此外, 豆粕還能調節魚體內17個組織胰蛋白酶的轉錄活性, 對胃、腸道和大腦組織的影響最為顯著[32]。血清堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)活性是判斷肝臟損傷的一項重要指標。在吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)中的研究發現, 飼料中添加高水平菜粕會導致羅非魚血清SOD活性降低, 堿性磷酸酶活性升高, 這表明長期攝食菜粕造成魚抗氧化能力下降, 生物體內自由基超標, 機體組織器官誘發炎癥反應, 進而造成肝臟損傷[33]。分析本研究實驗結果, 推測草魚投喂高菜粕與高豆粕飼料導致nrf1基因表達量顯著上調的原因是豆粕和菜粕中存在著多種抗營養因子,造成腸道上皮細胞損傷, 誘發草魚腸道炎癥反應。進而草魚激活體內的抗氧化反應體系, 上調nrf1等炎癥調節因子的表達, 以抑制腸道中炎癥反應。然而在本實驗21d時, 魚粉組、豆粕組和菜粕組三者在nrf1基因表達水平上無顯著差異。分析原因可能是本次取樣期間的氣溫突然升高引起。有研究表明, 小黃魚受到高溫脅迫時, 其體內熱應激蛋白hsp90b1和hspb1表達量顯著升高, 應激水平顯著上升[34]。因此, 在本實驗21d取樣時, 可能由于突然高溫, 導致草魚體內應激水平顯著上升,nrf1基因的表達顯著上調, 甚至掩蓋了飼料對其影響, 從而出現nrf1基因在各處理組表達水平無顯著差異的實驗結果。

4 結論

本研究通過同源克隆得到了草魚nrf1的基因序列, 該序列編碼519個氨基酸。在所有研究的組織中,nrf1在肝臟組織中表達量最高。晝夜節律實驗結果表明nrf1在草魚體內具有一定的晝夜表達周期, 并在9:00出現每日最高表達量。水體中低氨氮濃度(5 mg/L)和高氨氮濃度(20 mg/L)均能顯著促進肝臟nrf1基因的表達。分別以魚粉、豆粕和菜粕為主要蛋白源的飼料投喂草魚, 在養殖后14d、28d和35d時, 腸道nrf1基因表達水平在豆粕組與菜粕組相對魚粉組均顯著升高。綜上所述, 本研究揭示了草魚nrf1基因的分子特征, 并證實其在氧化應激反應和炎癥反應中的響應調節作用。本研究為后續開展nrf1基因調控魚類應激反應的分子機制的研究提供理論基礎。