谷氨酸和α-酮戊二酸對鱖生長、脫氨及糖代謝的影響

楊 儒 張 冬 吳璐瑤 胡 兵 陳加成 李 顏 劉立維

(1.華中農業大學水產學院, 華中農業大學鱖魚研究中心, 長江經濟帶大宗水生生物產業綠色發展教育部工程研究中心, 武漢430070; 2.福建省特種水產配合飼料重點實驗(福建天馬科技集團股份有限公司), 福清 350308)

谷氨酸(Glu)是一種重要的非必需氨基酸, 它在機體氮代謝中可以被轉換成α-酮戊二酸(AKG)[1],這一過程由不同的轉氨酶和谷氨酸脫氫酶介導[2]。腸道吸收的谷氨酸有很大一部分被運送到肝臟[3],肝臟將營養物質轉化成為可氧化底物(如葡萄糖和脂肪酸)。研究表明, 谷氨酸可以提高金頭鯛(Sparus aurata)[4]的生長性能和提高松浦鏡鯉(Cyprinus carpio)、雜交鱘等水產動物肝臟的抗氧化能力和蛋白質代謝[5,6]。

α-酮戊二酸也被稱作2-氧基戊二酸, 可以在機體內快速轉化, 是三羧酸循環的中間體, 可以進行轉運和儲存氮[7]。谷氨酸、精氨酸、谷氨酰胺等谷氨酸家族氨基酸能經谷氨酸轉化為AKG。AKG還能利用谷氨酸產生其他氨基酸, 對氨基酸代謝具有重要的生理功能[8]。相關研究表明AKG可被谷氨酸脫氫酶(GDH)快速氨基轉化為谷氨酸, 減少尿素產生和降解毒氮[9,10]。此外添加AKG可以促進松浦鏡鯉蛋白質代謝[11]。目前在畜禽方面, 已有AKG添加實驗。結果表明, AKG對畜禽的生長、腸道發育和抗氧化方面有積極的促進作用[12—14]。目前來說國內外關于飼料中添加Glu和AKG的研究主要集中在家禽動中, 對肉食性魚類攝食和氨基酸代謝方面的影響的相關研究卻很少。

鱖(Siniperca chuatsi) 是鮨科、鱖屬, 為肉食性魚類, 生性兇猛, 終生以魚類和其他水生動物為食[15]。作為一種特殊的珍稀淡水魚類, 其肉質細嫩、口感好、無肌間刺、營養價值高, 在國內外市場上廣受歡迎。目前, 國家大力支持提倡綠色健康的水產養殖, 谷氨酸和α-酮戊二酸在飼料中適當添加可以促進魚類的生長, 增強魚類對飼料中蛋白質的吸收利用, 在水產養殖中新型飼料研發方面有很大發展潛力。因此本研究初步探討了谷氨酸和α-酮戊二酸對鱖生長、食欲及排氨的影響, 推進鱖低氨排放養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗魚和養殖條件

實驗用魚來自華中農業大學鱖育種創新基地。暫養2周后選擇大小均勻、體格健壯、無損傷并攝食活躍具有活力的相同生長階段的鱖90尾(25±3) g進行實驗。將90尾鱖隨機分到9個循環系統式圓柱狀實驗缸(養殖水體體積: 0.3 m3)中, 每個實驗缸放養10尾, 其中3個缸1個重復。實驗設置3個組, 分別為對照組、Glu組和AKG組(添加量2%[6,16—18])。養殖過程中溶氧維持在7—8 mg/L, 溫度19—24℃, pH為7.8—8.1。每日10: 00和17: 00定時定點投喂飼料, 并于14: 00吸糞便換水。前40d按初始體質量的3%定量投喂, 后20d飽食投喂。

1.2 實驗飼料

本實驗的飼料以魚粉和酪蛋白為蛋白質源, 魚油、豆油為脂肪源配制3組等氮(添加量2%, 粗蛋白45.5%)等能的飼料, 飼料配方見表1。飼料原料按表1的添加量由小到大逐一混合均勻, 飼料中的微量添加成分采取逐級稀釋法混合均勻。飼料原料粉碎后全部通過60目篩, 按照添加量從小到 大的順序逐級攪拌混勻, 在添加魚油和豆油后, 手戴一次性防滑聚乙烯手套, 人工將油脂微小顆粒搓散,將飼料混合均勻。而后根據飼料的分組收入自封袋, 并將飼料放置于-20℃冰箱冷凍保存待用。

表1 實驗飼料配方(%干物質)Tab.1 Experimental feed formula (% dry matter)

1.3 樣品采集

每天在投喂結束3h后(晚上8:00)在每個實驗缸隨機取樣, 取樣3次, 利用納氏試劑法測量各水體氨氮[19], 采用鹽酸奈乙二胺分光光度法測量各水體亞硝酸鹽[20]。在養殖結束后,實驗魚禁食24h,使用MS-222麻醉后稱重。每缸隨機選取約9尾鱖, 擦干稱重后于 -4℃保存, 用于實驗樣本的基本組分的測定。每缸隨機抽取9尾鱖, 進行靜脈取血, 室溫放置1—2h后3000 r/min離心15min, 收集上清, 用于檢測血糖含量。然后解剖背部肌肉、肝臟和腦, -80℃保存待測。

1.4 樣品分析

血糖和組織中糖原采用南京建成生物工程研究所試劑盒(貨號A154-1-1)進行測定。根據GenBank數據庫中已公布的鱖序列設計引物, 引物序列見表2,由生工生物工程有限公司合成。用TRIzol (Invitrogen, USA)提取各組織的總RNA, 用HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme, 中國)反轉錄合成第一鏈cDNA, 反應體系20 μL, 在Light Cycle 480 Ⅱ PCR儀(Roche, Germany)上進行實時熒光定量反應。以鱖rpl13a為內參基因, 參考Su等[21]實驗程序, 計算方法參考Livak等[22]。

表2 鱖熒光定量引物序列Tab.2 Real-time primer sequence for Chinese perch

1.5 計算公式

飼料系數(Feed conversion ratio, FCR)=飼料攝食量÷魚體增重

特定生長率(Specific growth rate, SGR, %)=100×(ln 終末均重-ln 初始均重)÷養殖天數

增重率(Weight gain rate, WGR, %)=100×(終末均重-初始均重)÷初始均重

蛋白質效率比(Protein efficiency ratio, PER)=魚體增重(g)÷蛋白質攝入量(g)

1.6 數據分析

本實驗中所有數據都用平均值±標準誤(mean±SE)表示。數據統計分析前, 用SPSS 23.0軟件進行單樣本t檢驗(One Samplet-test)剔除偏離總體均值的樣本數據。針對鱖同一指標不同攝食模式下的數據比較, 使用單因素方差分析(One-way ANOVA)。針對同一指標下的數據比較, 使用獨立樣本t檢驗(Independentt-test)。運用Duncan氏檢驗法進行多重比較,P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 飼料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸對鱖攝食生長性能的影響

由表3可知, 在飼料中添加Glu和AKG能提高鱖的生長性能。在等量投喂階段飼料中添加Glu和AKG能顯著提高飼料蛋白質效率, 鱖的增重率和特定生長率、顯著降低餌料系數(P＜0.05)。在飽食投喂階段, 飼料中添加Glu和AKG能提高鱖的增重率,顯著提高飼料蛋白質效率比和鱖的特定生長率(P＜0.05), 降低飼料的餌料系數。

表3 谷氨酸和 α-酮戊二酸對鱖生長指標的影響Tab.3 Effects of glutamic acid and α-ketoglutarate on growth index of Chinese perch (n=10)

2.2 飼料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸對鱖攝食的影響

在飼料中添加Glu和AKG能顯著提高鱖日攝食量(圖1B)和大腦中促攝食基因npy的相對表達(圖1A和1C), 并降低大腦中抑攝食基因pomc的相對表達(圖1A和1C;P＜0.05)。其中在等量投喂階段AKG組大腦中npy的相對表達與對照組相比有顯著性差異(圖1A;P＜0.05); 在飽食投喂階段Glu和AKG組大腦中npy、pomc的相對表達與對照組相比均有顯著性差異(圖1C;P＜0.05)。

圖1 攝食相關的基因表達量Fig.1 Expression of genes related to food intake

2.3 飼料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸對鱖氨排泄的影響

圖2和3顯示,在等量投喂階段, AKG組和Glu組的氨氮和亞硝酸鹽含量均低于對照組, 其中AKG組氨氮含量與對照組差異顯著(P＜0.05); 在飽食投喂階段, AKG組和Glu組的氨氮和亞硝酸鹽含量均顯著高于對照組(P＜0.05)。

圖2 等量投喂和飽食投喂階段實驗水體氨氮含量Fig.2 Ammonia nitrogen in the water at the equal feeding stage and satiety feeding stage

圖3 等量投喂和飽食投喂階段實驗水體亞硝酸鹽含量Fig.3 Nitrite in the water at the equal feeding stage and satiety feeding stage

2.4 飼料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸對鱖脫氨相關基因的影響

如圖4所示, AKG組和Glu組gdh、ampd相對表達量均高于對照組。其中等量投喂和飽食投喂階段二者gdh相對表達量與對照組之間均有顯著性差異(P＜0.05), 而Glu組與AKG組之間無顯著差異。而等量投喂和飽食投喂階段三者ampd相對表達量差異不顯著。

圖4 脫氨代謝相關的基因表達量Fig.4 Gene expression related to deamination metabolism

2.5 飼料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸對鱖血糖和肝肌糖原的影響

由圖5A可知, 飽食投喂階段, Glu組和AKG組中鱖血清中葡萄糖濃度顯著高于對照組(P＜0.05),而Glu組與AKG組之間無顯著差異; 圖5B顯示Glu組和AKG組中鱖肝臟中肝糖原濃度顯著低于對照組(P＜0.05), 而Glu組和AKG組無顯著差異; 圖5C顯示Glu組和AKG組中鱖肌肉中肌糖原濃度Glu組和AKG組均低于對照組, 但無顯著性差異。

圖5 血清中葡萄糖、肝糖原、肌糖原濃度Fig.5 Gene expression related to deamination metabolism

2.6 飼料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸對鱖糖異生的影響

如圖6所示, Glu組和AKG組鱖肝臟中g6pase基因和pepck基因的相對表達量高于對照組。其中在等量投喂階段, AKG組鱖肝臟中g6pase基因相對表達量顯著高于對照組(P＜0.05; 圖6A),pepck基因的相對表達量與對照組相比均無顯著性差異(圖6A)。在飽食投喂階段, Glu組和AKG組鱖肝臟中g6pase和pepck基因與對照組有顯著性差異(P＜0.05; 圖6B)。

圖6 糖異生相關的基因表達量Fig.6 Gene expression related to gluconeogenesis

2.7 飼料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸對鱖糖酵解的影響

由圖7可知, Glu組和AKG組鱖肝臟中gk基因和pk基因的相對表達量均高于對照組。其中在等量投喂階段, 三者gk和pk基因的相對表達量均無顯著性差異。在飽食投喂階段, Glu組和AKG組鱖肝臟中gk基因和pk基因的相對表達量顯著高于對照組(P＜0.05), 二者之間無顯著性差異。

圖7 糖酵解相關的基因表達量Fig.7 Gene expression related to glycolysis

3 討論

3.1 飼料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸對鱖攝食、生長性能的影響

谷氨酸是腸道腎臟中氨生成的最重要底物之一, 在檸檬酸循環中谷氨酰胺經過谷氨酸轉化為α-酮戊二酸。其環化產生的脯氨酸與合成膠原蛋白和結締組織息息相關[23]。谷氨酸作為谷胱甘肽的前體, 對氧化應激有緩解作用[24]。AKG作為谷氨酰胺的前體, 比谷氨酰胺更便宜、更穩定, 在許多細胞過程中作為抗氧化劑代替谷氨酰胺[25]。并通過三羧酸循環為機體提供能量。在本實驗中, 在飼料中添加谷氨酸和AKG顯著提高飼料蛋白質效率比、鱖的特定生長率、提高增重率、降低餌料系數, 并促進鱖攝食。這一結果與Caballero-Solares等[4]、Zhelyazkov等[26]研究相似。此外魏玉強等[5]、陳迪[6]的研究也表明α-酮戊二酸可以提高松浦鏡鯉、雜交鱘等水產動物肝臟抗氧化、蛋白質代謝等生長性能。其原因可能是AKG參與三羧酸循環, 為機體提供能量并刺激腺苷酸活化蛋白激酶的磷酸化和促進脂肪酸、葡萄糖、氨基酸等物質在腸黏膜的氧化[27,28]。此外, 還有研究中表明, 飼料中添AKG和Glu可以增強松浦鏡鯉腸道消化酶活性, 促進腸道發育[18,29]。此外谷氨酸和AKG還能促進腸道生長、發育消化吸 收。Hou等[30,31]研究表明添加1%的AKG能促進豬腸黏膜蛋白質的合成和減輕腸道黏膜的損傷, 同時在一定程度上增加小腸的吸收功能。

在脊椎動物中npy被認為是進中化最保守的神經肽之一, 神經分泌細胞中直接釋放, 用于調節饑餓和飽腹感[32]和抵抗饑餓狀態[33]。POMC是MSHs和促腎上腺皮質激素(ACTH)及β-內啡肽的前體, 與CART共同調節食欲[34]。根據攝食基因的表達顯示, 飼料中Glu和AKG的添加使得npy表達顯著提高, 抑攝食基因pomc顯著降低。在鱖攝食中促攝食基因的表達主要是攝取營養, 表明Glu和AKG飼料對其生長較為適宜, 這與增重率、特定生長率增加相符。此外本研究還表明, 在等量投喂時, AKG組與谷氨酸組相比,npy表達量更高, 對鱖攝食更有促進作用。

3.2 飼料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸對鱖脫氨的影響

魚類組織中谷氨酸和谷氨酰胺的氧化率高于其他營養物質, 是全身的主要能量來源[35]。谷氨酸主要通過GDH脫氨產生AKG, 進而進入三羧酸循環, 為機體提供大量能量[8,36]。在本研究中, 飼料中添加谷氨酸肝臟中gdh和ampd的表達增加, 這表明谷氨酸在魚體內進行了脫氨, 促進GDH表達。AMPD參與氨基酸代謝的方式為谷氨酸在轉氨酶的作用下, 轉氨基至草酰乙酸最終生成天冬氨酸進入嘌呤核苷酸循環, 而天冬氨酸經AMPD的催化反應脫去氨基產生能量[37,38]。進而魚體內谷氨酸的增加在一定程度上促進了AMPD的表達。AKG具有良好的溶解性, 在水溶液中相對穩定且無毒, 不會增加氮負荷[39]?？赏ㄟ^GDH快速氨基轉化為谷氨酸[9,10],并在谷氨酰胺合成酶(GS)作用下轉化為谷氨酰胺,減少尿素產生和解毒氮[40]。本實驗飼料中添加AKG能促進肝臟中gdh和ampd表達, 且等量投喂下與對照組和谷氨酸組相比, 水體氨氮亞硝酸較低, 對魚體毒性較小。這表明AKG通過GDH進行了轉化,降低了魚體的毒性和體外氨氮的排放, 這與甄吉福等[41]結論相似。研究表明魚類攝食量會影響魚體生長性能和氮排泄率, 在攝食量高時, 氨氮排泄率下降, 蛋白質保留量增加[37]。本實驗結果顯示, 在飽食投喂階段, Glu組和AKG組攝食量均高于對照組, 鱖體重增加, 故與等量投喂和對照組相比氨排泄量隨之增加, 飼料中添加AKG和Glu已經無法彌補飽食投喂水體氨氮的上升, 從而導致水體氨氮和亞硝酸鹽增加。

3.3 飼料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸對鱖葡萄糖代謝的影響

血糖是糖代謝的重要指標, 它反映機體的消化吸收能力。機體內的糖類分解可以為機體新陳代謝提供能量。在一定的范圍內, 血糖水平的上升表示機體已經攝取了一定營養物質, 可以替代血糖提供能源[42]。實驗結果顯示, Glu組和AKG組血糖含量顯著高于對照組, 說明Glu 和AKG在體內發生反應釋放能量, 使機體具有較高的能量可用于生長。在雜交條紋鱸(Plectorhinchus lineatus)和斑馬魚(Danio rerio)[43]及大口黑鱸[44]中研究也表明, Glu、Gln、Asp和Leu的分解代謝共同貢獻了肝臟、近端腸、腎臟和骨骼肌中約80%的ATP生成。血液與魚類生長息息相關, 在流經各組織時, 血液中的葡萄糖能被組織吸收。其中一部分被機體氧化利用, 另一部分則被作為糖原或脂肪儲存起來[45,46]。肌糖原可以分解供能, 是肌肉中糖的儲存形式[47]。在本實驗中飼料中添加Glu和AKG組中肌肉、肝臟中糖原含量較低, 則表明大部分葡萄糖被機體氧化吸收用于生長,少部分轉化為糖原和脂肪用于儲存。

谷氨酸在魚體中可以通過GS可逆地轉化為谷氨酰胺進而產生AKG, 為機體提供能量[48]。本實驗中當飼料中添加Glu和AKG時,g6pase、pepck、gk和pk的基因表達量都高于對照組。這表明, 飼料中添加谷氨酸使魚體能量充足, 糖異生增加。當機體能量過多時, 機體將會經過肝臟進行糖異生轉化為葡萄糖, 肝臟又將葡萄糖釋放到血液當中, 這與本實驗血糖含量增加相符[49]。糖酵解和糖異生是維持機體糖穩態的兩條重要代謝通路[50], 而糖酵解是所有生物體內葡萄糖代謝的唯一途徑[51]。當機體糖異生增強時, 為維持體內糖穩定, 進而糖異生越強,gk和pk表達量增加。AKG作為三羧酸循環中一種重要物質, 參與三羧酸循環產生大量ATP, 為機體提供能量[52]。因而飼料中添加AKG時, 體內能量充足, 糖異生增加,g6pase和pepck的基因表達量都高于對照組。此外長期投喂AKG, 糖異生增強, 魚體為維持體內糖穩定, 進而增加糖酵解, 從而gk和pk表達量增加, 釋放能量。從而魚體內的糖類消化和吸收速率提高, 可以增加糖的能量供應, 減少蛋白質的消耗量, 起到節省蛋白質的作用。

4 結論

在飼料中添加谷氨酸和 α-酮戊二酸, 能夠顯著促進鱖的攝食, 顯著提高增重率和特定生長率, 降低飼料系數, 提高其對蛋白質的利用效率。此外,也能夠顯著提升脫氨代謝供能水平, 在一定程度上減少鱖的體外氨排泄量。同時, Glu和AKG能促進鱖的糖異生和糖酵解, 促進糖代謝, 能夠提高鱖體內蛋白質合成水平, 飼料中氨基酸被更多地用來合成蛋白, 而非分解供能。然而, 谷氨酸和 α-酮戊二酸在飼料中具體的添加比例, 還需進一步研究。