固態(tài)發(fā)酵改善棉籽粕品質(zhì)的研究

鄒峰余 賈冰玉 鄭 華 趙述淼 羅 智 劉志博 柯 江 譚肖英

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 武漢 430070)

棉籽粕(Cottonseed meal, CSM)是水產(chǎn)飼料中替代魚(yú)粉的重要蛋白源之一[1], 具有產(chǎn)量穩(wěn)定、蛋白質(zhì)含量高、氨基酸組成較為平衡等優(yōu)點(diǎn)。然而,棉籽粕中高水平的游離棉酚(Free gossypol, FG)限制了其在飼料行業(yè)的應(yīng)用。游離棉酚會(huì)影響生物機(jī)體內(nèi)酶的功能, 改變細(xì)胞膜的通透性[2], 并且會(huì)影響生物機(jī)體對(duì)礦物質(zhì)元素和蛋白質(zhì)的消化吸收[3],一旦攝入量過(guò)大, 會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生不可逆的傷害。此外, 還存在如植酸、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子, 同樣會(huì)對(duì)生物體的營(yíng)養(yǎng)利用及健康造成損害[4,5]。

目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種方法來(lái)降解棉籽粕中的游離棉酚, 例如使用有機(jī)溶劑, 如丙酮和乙醇, 可以從棉籽粕中提取游離棉酚, 從而減少游離棉酚含量[6]。然而, 此方法會(huì)造成棉籽粕中蛋白質(zhì)溶失, 降低蛋白質(zhì)質(zhì)量。此外, 促使游離棉酚與其他化合物的結(jié)合也是有效方法, 如FeSO4或Ca(OH)2[7], 然而, 用FeSO4等化合物結(jié)合游離棉酚會(huì)導(dǎo)致飼料顏色及其他性狀的變化, 并且會(huì)降低棉籽粕的適口性和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量。

固態(tài)發(fā)酵被認(rèn)為是降解棉籽粕中游離棉酚及其他抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的最有效方法之一。此外,發(fā)酵過(guò)程中的代謝活動(dòng)可能會(huì)產(chǎn)生一些酶、維生素和一些其他未知的有益物質(zhì), 提高棉籽粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[8], 這些物質(zhì)往往會(huì)對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)和健康產(chǎn)生有利效果, 從而擴(kuò)大了棉籽粕在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。芽孢桿菌可以有效降解游離棉酚, 然而一些芽孢桿菌在氨基酸代謝過(guò)程中會(huì)發(fā)生脫羧基或脫氨基作用, 產(chǎn)生刺激性的氨, 影響發(fā)酵的風(fēng)味, 而乳酸菌和酵母菌在厭氧發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸、醇類(lèi)物質(zhì)等, 能夠提升棉籽粕的品質(zhì)及風(fēng)味[9—11]。基于此, 本研究首先以抗?fàn)I養(yǎng)因子降解能力為指標(biāo), 篩選出降解能力強(qiáng)的枯草芽孢桿菌, 并使用單因素試驗(yàn)法對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,隨后在此優(yōu)化結(jié)果基礎(chǔ)上, 采用枯草芽孢桿菌配合釀酒酵母、植物乳桿菌, 并且加入纖維素酶、植酸酶輔助發(fā)酵棉籽粕, 對(duì)混菌發(fā)酵的菌液接種比例及酶添加量進(jìn)行優(yōu)化, 隨后對(duì)其發(fā)酵效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

枯草芽孢桿菌購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心;釀酒酵母和植物乳桿菌均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院發(fā)酵與酶工程教研室惠贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

牛肉膏、氯化鈀、鎢酸鈉-磷鉬酸和植酸鈉(上海麥克林生化科技有限公司); 酚酞和單寧酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司); 植酸酶(10000 U/g,武漢新華揚(yáng)生物公司); 纖維素酶(50000 U/g, 上海源葉生物科技有限公司); 其他化學(xué)試劑均為分析純, 購(gòu)自上海國(guó)藥。

LB培養(yǎng)基(100 mL, 枯草芽孢桿菌用): 蛋白胨1 g, 酵母粉0.5 g, 氯化鈉0.5 g, 121℃滅菌20min。

MRS培養(yǎng)基(100 mL, 植物乳桿菌用): 蛋白胨1 g, 牛肉膏1 g, 酵母粉0.5 g, 葡萄糖2 g, 無(wú)水醋酸鈉0.5 g, 檸檬酸二銨0.2 g, 吐溫-80 0.1 mL, 硫酸鎂0.058 g, 硫酸錳0.025 g, 121℃滅菌20min。

YPD培養(yǎng)基(100 mL, 釀酒酵母用): 酵母粉l g,蛋白胨2 g, 葡萄糖2 g, 121℃滅菌20min。

固體培養(yǎng)基為上述液體培養(yǎng)基中加1.5—2.0 g的瓊脂。

棉籽粕固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基: 棉籽粕經(jīng)粉碎過(guò)60目篩, 稱(chēng)取適量后置于250 mL錐形瓶中, 121℃滅菌20min, 備用。

1.3 菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)

使用接種環(huán)將保藏在斜面上的單一菌種刮取2—3環(huán), 接種于對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中, 枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌培養(yǎng)溫度為37℃, 釀酒酵母培養(yǎng)溫度為30℃, 振蕩培養(yǎng)24h, 為一級(jí)種子液。再以一級(jí)種子液的5%接種于250 mL錐形瓶中, 振蕩培養(yǎng)24h, 置于4℃冰箱備用。

固態(tài)發(fā)酵枯草芽孢桿菌單菌固態(tài)發(fā)酵: 將棉籽粕用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩, 120℃高壓滅菌20min, 分別以接種量(5%、8%、11%和14%), 水料比(0.4∶1、0.6∶1、0.8∶1和1∶1), 發(fā)酵時(shí)間(36h、48h、60h和72h)為變量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn), 加入二級(jí)種子液以及滅菌水, 于500 mL錐形瓶中攪拌均勻, 放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中, 以37℃進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵, 其中每組3個(gè)平行, 并且設(shè)置不接種任何菌株的空白料作為對(duì)照。

混菌發(fā)酵將枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和植物乳桿菌分別以菌液體積比例1∶1∶1、2∶1∶1、1∶2∶1和1∶1∶2(其中1=3%、2=6%)接種于棉籽粕中,添加滅菌水使得初始水分含量為60%, 放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中, 發(fā)酵溫度37℃, 先好氧發(fā)酵48h (采用3層透氣膜封口, 保持物料蓬松, 每12h攪拌1次), 再厭氧發(fā)酵(三層透氣膜加一層保鮮膜封口, 將物料壓實(shí), 且不攪拌) 48h, 其中每組3個(gè)平行, 并且設(shè)置不接種任何菌株的空白料作為對(duì)照。在發(fā)酵完成后, 收集發(fā)酵原料, 55℃烘干24h, 粉碎機(jī)粉碎至過(guò)40目篩, 放至-20℃保存, 用于后續(xù)分析檢測(cè)。

參照最優(yōu)菌種比例將菌液接種于棉籽粕固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基, 分別添加纖維素酶(0、0.50%、1.25%和2.00%)或植酸酶(0.00%、0.03%、0.10%和0.33%)至發(fā)酵培養(yǎng)基, 放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中, 發(fā)酵溫度37℃, 先好氧發(fā)酵48h (采用3層透氣膜封口, 保持物料蓬松, 每12h攪拌1次), 再厭氧發(fā)酵(三層透氣膜加一層保鮮膜封口, 將物料壓實(shí), 且不攪拌) 48h, 其中每組3個(gè)平行, 并且設(shè)置不接種任何菌株的空白料作為對(duì)照。在發(fā)酵完成后, 收集發(fā)酵原料, 55℃烘干24h, 粉碎機(jī)粉碎至過(guò)40目篩, 放至-20℃保存, 用于后續(xù)分析檢測(cè)。

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 設(shè)置接種菌液體積為枯草芽孢桿菌(3%)∶釀酒酵母(3%)∶植物乳桿菌(6%)=1∶1∶2, 其中各菌種的活菌數(shù)為枯草芽孢桿菌(2.08×108CFU/mL)、釀酒酵母(1.25×107CFU/mL)、植物乳桿菌(1.36×108CFU/mL)。添加滅菌水使得初始水分含量為60%, 植酸酶添加量為0.1%, 纖維素酶添加量1.25%, 放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中, 發(fā)酵溫度37℃。先好氧發(fā)酵48h (采用3層透氣膜封口, 保持物料蓬松, 每12h攪拌1次), 再厭氧發(fā)酵(三層透氣膜加一層保鮮膜封口, 將物料壓實(shí), 且不攪拌) 48h, 其中每組3個(gè)平行, 并且設(shè)置不接種任何菌株的空白料作為對(duì)照。在發(fā)酵完成后, 收集發(fā)酵原料, 55℃烘干24h, 粉碎機(jī)粉碎至過(guò)40目篩, 放至-20℃保存,用于后續(xù)分析檢測(cè)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

感官評(píng)價(jià)發(fā)酵結(jié)束后每組抽取3個(gè)樣品,按照羅遠(yuǎn)琴等[10]的方法進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

游離棉酚含量檢測(cè)采用國(guó)標(biāo)法(GB/T 13086-2020)檢測(cè), 大致步驟如下: ①精確稱(chēng)取適量樣品于250 mL具塞錐形瓶中, 加入玻璃珠, 準(zhǔn)確加入50 mL試劑A(6∶4異丙醇-正己烷混合溶液500 mL,加入2 mL氨基丙醇, 8 mL冰醋酸, 50 mL水, 再用異丙醇-正己烷混合溶液定容至1000 mL), 室溫下振蕩提取3h, 用濾紙過(guò)濾, 獲得濾液為待測(cè)樣品。②移液管取雙等份濾液10 mL于25 mL棕色容量瓶a、b中, 取雙等份溶劑A 10 mL于25 mL容量瓶中a0、b0, 用混合溶液定容a、a0至刻度做參比溶液, 向b、b0中加入2 mL苯胺, 沸水浴30min, 冷卻至室溫后,用混合溶液定容至刻度。用酶標(biāo)儀測(cè)定各吸光值,隨后根據(jù)國(guó)標(biāo)法中計(jì)算公式計(jì)算。

單寧含量檢測(cè)采用國(guó)標(biāo)法(GB/T 27985-2011)檢測(cè), 大致步驟如下: ①準(zhǔn)確稱(chēng)取適量樣品1—2 g, 精確加入1∶1丙酮水溶液50 mL, 振蕩提取2h, 濾紙過(guò)濾, 濾液為待測(cè)樣品。②精確量取試樣1 mL, 加入含有約30 mL蒸餾水的50 mL容量瓶中,加入鎢酸鈉-磷鉬酸溶液2.5 mL, 碳酸鈉溶液5 mL,定容至刻度, 搖勻, 放置顯色30min, 760 nm處測(cè)吸光度后代入標(biāo)曲計(jì)算濃度。根據(jù)國(guó)標(biāo)法中計(jì)算公式計(jì)算樣品中單寧酸含量。

植酸含量檢測(cè)采用改良WADE法[12]進(jìn)行。WADE試劑: 稱(chēng)取1.5 g三氯化鐵(0.03%)、15 g磺基水楊酸(0.3%)。加水溶解并定容至500 mL, 使用前用水稀釋10倍。0.2 mg/mL植酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配置:1.8889 g植酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品, 先加蒸餾水溶解并定容至100 mL, 使用前吸取5 mL, 定容至500 mL。植酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作: 精確吸取0.2 mg/mL的植酸標(biāo)準(zhǔn)使用液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL于7支試管中, 用蒸餾水補(bǔ)足至5 mL, 吸取1 mL WADE試劑混合, 10℃, 1000 rpm離心10min。取200 μL, 500 nm處讀取吸光值, 以吸光度為縱坐標(biāo), 植酸含量為橫坐標(biāo), 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用凱氏定氮法(K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀)測(cè)定樣品的總氮含量, 操作步驟及計(jì)算公式參照GB/T 6432-2018《飼料中粗蛋白的測(cè)定凱氏定氮法》。

總酸含量參照蔡國(guó)林等[13]的方法進(jìn)行測(cè)定, 結(jié)果用乳酸含量計(jì)。

酸溶蛋白含量根據(jù)NY/T 3801-2020《飼料原料中酸溶蛋白的測(cè)定》方法測(cè)定: 稱(chēng)取2 g發(fā)酵樣品于50 mL離心管中, 加入20%三氯乙酸溶液40 mL,搖床 150 r/min振蕩30min, 靜置5min后, 4000 r/min離心5min。取10 mL濾液加入消化管中, 加入催化劑, 按照粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE,n=3)表示。使用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行不同組間指標(biāo)差異性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn), 若不同組間的差異顯著, 則采用Duncan多重比較來(lái)檢驗(yàn)不同處理組間的差異顯著性, 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵條件對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵效果的影響

由圖1可知, 當(dāng)使用枯草芽孢桿菌對(duì)棉籽粕進(jìn)行單菌發(fā)酵時(shí), 其接種量為11%時(shí), 游離棉酚、植酸及單寧的降解效果均高于其他組。

由圖2可知, 當(dāng)使用枯草芽孢桿菌對(duì)棉籽粕進(jìn)行單菌發(fā)酵時(shí), 當(dāng)蒸餾水添加量和底物比例為0.8∶1時(shí), 對(duì)游離棉酚的降解效果均高于其他組, 而當(dāng)比例為0.6∶1時(shí), 對(duì)棉籽粕中單寧和植酸的降解效果均高于其他組。

圖2 水料比對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉籽粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的影響Fig.2 Effect of water-to-material ratio on antinutritional factor content in Bacillus subtilis fermented cottonseed meal

由圖3可知, 當(dāng)使用枯草芽孢桿菌對(duì)棉籽粕進(jìn)行單菌發(fā)酵60h之后, 游離棉酚、植酸及單寧的降解效果均顯著高于前三組而與后一組無(wú)顯著性差異。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉籽粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on antinutritional factor content in Bacillus subtilis fermented cottonseed meal

2.2 混菌比例對(duì)固態(tài)發(fā)酵效果影響

如圖4所示, 當(dāng)枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌的接種比例為1∶1∶2時(shí), 固態(tài)發(fā)酵棉籽粕的植酸和單寧含量均低于其他組, 而總酸含量均高于其他組。綜合考慮, 枯草芽孢桿菌、釀酒酵母及植物乳桿菌的比例選取1∶1∶2時(shí)發(fā)酵效果較好, 此時(shí), 棉籽粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子得到有效降解, 總酸含量得到顯著提高。

圖4 枯草芽孢桿菌、釀酒酵母及植物乳桿菌比例對(duì)固態(tài)發(fā)酵棉籽粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子及總酸含量的影響Fig.4 Effect of ratio of Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus plantarum on antinutritional factor content and total acid content in fermented cottonseed meal

2.3 纖維素酶添加比例對(duì)混菌發(fā)酵棉籽粕抗?fàn)I養(yǎng)因子含量影響

由圖5可知, 纖維素酶添加對(duì)混菌固態(tài)發(fā)酵棉籽粕的植酸及單寧含量沒(méi)有影響, 而能夠進(jìn)一步顯著降低游離棉酚含量, 且當(dāng)纖維素酶添加比例為1.25%時(shí), 游離棉酚含量顯著低于前三組而與第五組沒(méi)有顯著差異。

圖5 纖維素酶對(duì)混菌固態(tài)發(fā)酵棉籽粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的影響Fig.5 Effect of cellulase on antinutritional factor content in fermented cottonseed meal

2.4 植酸酶添加比例對(duì)混菌發(fā)酵棉籽粕抗?fàn)I養(yǎng)因子含量影響

由圖6可知, 植酸酶添加對(duì)混菌固態(tài)發(fā)酵棉籽粕的單寧含量沒(méi)有影響, 而能夠進(jìn)一步顯著降低游離棉酚和植酸含量。且當(dāng)植酸酶添加比例為0.03%時(shí), 游離棉酚含量顯著低于前兩組而與后兩組無(wú)顯著性差異, 添加比例為0.1%時(shí), 植酸含量顯著低于前三組而與后一組無(wú)顯著性差異。

圖6 植酸酶對(duì)混菌固態(tài)發(fā)酵棉籽粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的影響Fig.6 Effect of phytase on antinutritional factor content in fermented cottonseed meal

2.5 混菌發(fā)酵感官評(píng)測(cè)

由表1可知使用混菌發(fā)酵后, 棉籽粕的質(zhì)地和氣味都有改善, 并且在感官評(píng)價(jià)上要優(yōu)于枯草芽孢桿菌單菌發(fā)酵。

表1 單菌和混菌發(fā)酵棉籽粕感官評(píng)價(jià)對(duì)比Tab.1 Comparison of sensory evaluation of single bacteria and mixed bacteria fermented cottonseed meal

2.6 混菌發(fā)酵后棉籽粕中抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)、粗蛋白、酸溶蛋白、總酸含量測(cè)定

由表2可知, 發(fā)酵后棉籽粕中的抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)顯著降低, 其中游離棉酚降解率達(dá)到40.13%, 植酸降解率達(dá)到34.92%, 單寧降解率達(dá)到40.24。此外, 粗蛋白, 酸溶蛋白, 總酸含量顯著上升, 分別提高了10.26%、59.20%和79.49%。

表2 混菌發(fā)酵棉籽粕各成分變化(風(fēng)干物質(zhì))Tab.2 The change of the component in mixed bacteria fermented cottonseed meal (air-dry matter)

3 討論

枯草芽孢桿菌是美國(guó)食品藥品管理局認(rèn)證的無(wú)害菌種, 是目前工業(yè)生產(chǎn)中使用最普遍的一種菌[14,15]。有研究人員對(duì)一株產(chǎn)植酸酶枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉籽粕的工藝進(jìn)行優(yōu)化, 結(jié)果表明最佳發(fā)酵條件: 溫度37℃, 時(shí)間周期72h, 底物初水分30%, 初始pH 7.0, 接種量為7%[16]。Zhang等[17]通過(guò)單因素試驗(yàn)獲得枯草芽孢桿菌對(duì)棉籽粕的最佳發(fā)酵條件為: 發(fā)酵時(shí)間72h, 發(fā)酵溫度39℃, 初始pH 6.5, 初始含水量50%, 接種量1.0×107CFU/g。對(duì)一株高效降解棉酚的芽孢桿菌誘變菌株進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化發(fā)現(xiàn): 物料含水量控制在45%—50%, 菌劑使用量為1.0×1010CFU/kg, 發(fā)酵時(shí)間13—15d為最佳發(fā)酵條件[18]。而在本研究中通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定枯草芽孢桿菌單菌發(fā)酵最佳條件為接種量為11%, 最佳水料比為(0.6—0.8∶1), 最佳發(fā)酵時(shí)間60h, 不同種的枯草芽孢桿菌的最佳發(fā)酵條件不同, 這種差異可能是由物種本身的生物多樣性造成, 也有可能是因?yàn)榈琢系牟町愃鶎?dǎo)致。

感官性狀是評(píng)價(jià)棉籽粕應(yīng)用效果的最直接指標(biāo)。我們?cè)谑褂每莶菅挎邨U菌單菌發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn), 發(fā)酵之后棉籽粕常常結(jié)塊嚴(yán)重, 在烘干之后, 硬度增加, 不利于粉碎, 并且散發(fā)出刺鼻的酸腐味, 這些性狀的變化都不利于發(fā)酵棉籽粕的應(yīng)用, 并且其對(duì)植酸的降解效果不理想。有研究人員利用多種酵母菌分別對(duì)棉籽粕進(jìn)行發(fā)酵, 發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵產(chǎn)物均具有酒香味[19]。此外, 許多研究者發(fā)現(xiàn), 采用酵母菌、乳酸菌和芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵, 能夠有效的改善棉籽粕的感官性狀, 提升其風(fēng)味[9—11], 并且乳酸菌發(fā)酵還有提升飼料適口性及消化率等功效[20,21]。因此, 我們使用釀酒酵母、植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌混合, 并在物料中初始添加植酸酶及纖維素酶溶液, 隨后采用好氧-厭氧分步發(fā)酵棉籽粕, 發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵相比于單菌發(fā)酵顯著提升了棉籽粕的感官評(píng)價(jià)指標(biāo)。這可能是因?yàn)榻湍妇腿樗峋趨捬醢l(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了醇類(lèi)物質(zhì)及有機(jī)酸等[22,23], 提升了發(fā)酵棉籽粕的風(fēng)味。此外, 還發(fā)現(xiàn)植酸降解效果的提升, 說(shuō)明發(fā)酵前添加植酸酶溶液, 酶的水解作用與微生物發(fā)酵過(guò)程能夠協(xié)同進(jìn)行。

在發(fā)酵植物原料的實(shí)際操作過(guò)程中, 微生物自身產(chǎn)生的酶可能量不足或者活性不夠, 因此在對(duì)某些大分子物質(zhì)的水解過(guò)程當(dāng)中并不能產(chǎn)生很好的效果。而單獨(dú)的酶解過(guò)程并不能產(chǎn)生有益的微生物代謝物, 如檸檬酸、草酸和乳酸可分別由黑曲霉、米曲霉和乳酸桿菌分泌[24]。因此菌酶協(xié)同發(fā)酵結(jié)合了單獨(dú)微生物發(fā)酵或酶解發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn), 不僅能顯著分解植物原料中的大分子物質(zhì), 而且能得到有機(jī)酸等有益的微生物代謝產(chǎn)物, 具有很高的實(shí)際生產(chǎn)價(jià)值。由于單胃動(dòng)物消化系統(tǒng)中沒(méi)有粗纖維降解相關(guān)酶, 過(guò)量粗纖維不僅會(huì)增加動(dòng)物飽腹感,降低攝食量, 還會(huì)降低飼料轉(zhuǎn)化率[25]。棉籽粕中含有大量的粗纖維, 添加纖維素酶通過(guò)破壞植物細(xì)胞壁降解棉籽粕中的粗纖維, 可以增加棉籽粕的利用率[26]。本研究發(fā)現(xiàn), 添加纖維素酶能進(jìn)一步降低混菌發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚的含量, 可能原因是其對(duì)粗纖維的降解提升了微生物對(duì)棉籽粕中碳水化合物的利用率從而促進(jìn)其生長(zhǎng)代謝。植酸能和金屬陽(yáng)離子或蛋白質(zhì)發(fā)生螯合作用, 從而降低礦物質(zhì)的生物效能, 影響水解酶的活性, 降低蛋白質(zhì)的利用率并影響動(dòng)物的消化吸收功能[27]。在單獨(dú)微生物發(fā)酵中, 我們發(fā)現(xiàn)植酸的降解效率不高, 因此在發(fā)酵底物中添加植酸酶。結(jié)果表明植酸酶能顯著降低棉籽粕中的植酸含量, 并進(jìn)一步提升對(duì)游離棉酚的降解效果, 說(shuō)明植酸酶的水解作用能夠與微生物的發(fā)酵過(guò)程協(xié)同進(jìn)行, 在有效水解植酸的同時(shí)能進(jìn)一步提升微生物的繁殖及代謝活動(dòng)。

隨后我們分析了混菌發(fā)酵的抗?fàn)I養(yǎng)因子降解率以及粗蛋白、酸溶蛋白、總酸含量。發(fā)現(xiàn)游離棉酚、植酸和單寧的降解率分別達(dá)到了40.13%、34.92%和40.24%, 粗蛋白、酸溶蛋白和總酸含量分別提升了10.26%、59.2%和79.49%。其中, 酸溶蛋白是反映發(fā)酵底物中小肽和游離氨基酸含量的重要指標(biāo)[28], 而發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌產(chǎn)生的乳酸等有機(jī)酸, 通常能起到抑制有害微生物生長(zhǎng)、促進(jìn)有益微生物生長(zhǎng)的作用。宣秋希等[29]用釀酒酵母、植物乳桿菌、芽孢桿菌進(jìn)行厭氧-好氧分步發(fā)酵, 結(jié)果表明, 游離棉酚降解了66.28%、粗蛋白提升了6.38%、酸溶蛋白提升了88.30、L-乳酸的含量從0.01提升到了1.83 g/L。亓秀曄等[9]用植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌進(jìn)行好氧-厭氧分步發(fā)酵棉籽粕,顯著降低了棉籽粕游離棉酚含量、顯著提升了酸溶蛋白含量。此外, 羅遠(yuǎn)琴等[10]使用枯草芽孢桿菌和釀酒酵母對(duì)棉籽粕進(jìn)行混菌發(fā)酵, 顯著提升了棉籽粕的酸溶蛋白及棉籽肽含量, 以上這些研究結(jié)果都與本研究得到類(lèi)似的結(jié)果。綜上, 使用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母及植物乳桿菌混菌發(fā)酵不僅能有效降解棉籽粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量, 同時(shí)能提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。并且相比于枯草芽孢桿菌單菌發(fā)酵, 配合釀酒酵母以及植物乳桿菌能提升發(fā)酵棉籽粕的感官指標(biāo)及其風(fēng)味, 此外, 在底物中添加外源性纖維素酶以及植酸酶能進(jìn)一步提升發(fā)酵效果, 從而提升其應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究探究了枯草芽孢桿菌單菌發(fā)酵棉籽粕降解抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)含量的最佳條件, 同時(shí)測(cè)評(píng)了枯草芽孢桿菌配合釀酒酵母、植物乳桿菌及添加纖維素酶及植酸酶溶液進(jìn)行混菌發(fā)酵的效果。結(jié)果表明, 混菌加酶發(fā)酵能有效降低棉籽粕抗?fàn)I養(yǎng)因子含量, 提升營(yíng)養(yǎng)價(jià)值, 并提升其風(fēng)味, 從而提升其應(yīng)用價(jià)值, 為生產(chǎn)實(shí)際提供了一定的理論基礎(chǔ)。