微塑料PVC與磺胺甲惡唑聯(lián)合暴露大型溞引發(fā)的急慢性毒理效應(yīng)

修文潔 閆 淼 顧冀海, 柳峰松, 張玉明,

(1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 保定 071002; 2.河北省動物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用重點實驗室, 保定 071002)

塑料產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、物流交通等諸多領(lǐng)域, 塑料污染已成為當(dāng)代最重要的環(huán)境問題之一。環(huán)境中的廢棄塑料在紫外線、機械剪切力等理化作用下不斷破碎與降解, 最終形成微塑料[1]。常見微塑料類型有聚氯乙烯(Polyvinyl chloride,PVC)、聚乙烯(Polyethylene, PE)、聚苯乙烯(Polystyrene, PS)、聚丙烯(Polypropylene, PP)、聚酰胺(Polyamide, PA)和聚酯類(Polyester)等。塑料污染與人類活動密切相關(guān), 湖泊、河流等水環(huán)境已成為微塑料的主要歸宿與富集地。水生生物攝食多無選擇性, 被誤食的微塑料在腸道內(nèi)累積會影響其正常進食并產(chǎn)生機械損傷, 進而導(dǎo)致機體能量缺乏、運動和繁殖能力損傷, 甚至發(fā)生個體死亡現(xiàn)象[2]。微塑料具有的體積小、表面積大、難降解的特點[3],極易吸附環(huán)境中其他污染物, 進而對生物體產(chǎn)生聯(lián)合毒性。例如, 微塑料會促進銅在鯉(Cyprinus carpio)中積累, 造成嚴(yán)重的肝臟毒性[4]。類似的, 微塑料可通過吸附三氯生(Tricolsan), 提高其在斑馬魚(Danio rerio)腸道和肝臟中的積累量[5]。此外, 微塑料和菲(Phenanthrene)聯(lián)合暴露尖齒胡鯰(Clarias gariepinus)后, 不僅會引起魚體鰓和肝臟損傷, 而且會導(dǎo)致其生殖基因表達紊亂[6]。在水環(huán)境中, 微塑料與其他污染物長期共存互作, 會通過食物鏈“藻類-浮游動物-魚類”在不同營養(yǎng)級生物上富集傳遞,甚至有危害人體健康的生態(tài)風(fēng)險[7]。

PVC塑料廣泛用于包裝材料、防雨用品、農(nóng)用育秧膜、電纜絕緣層和建筑業(yè), 是環(huán)境中賦存量最大的微塑料種類之一。PVC微塑料不僅會對雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)[8]和蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)[9]等水生生物產(chǎn)生直接毒害,而且能作為載體, 攜帶其他環(huán)境污染物進入生物體內(nèi), 產(chǎn)生更為復(fù)雜的毒性效應(yīng)與生態(tài)風(fēng)險。此外,隨著我國社會經(jīng)濟的迅速發(fā)展, 抗生素的使用量日益增加。除了作為醫(yī)療處方藥物, 抗生素還作為獸藥在畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用[10]。并且, 抗生素生物利用度不高, 大部分藥物會隨著人體或動物的尿液和糞便排出體外, 進一步隨著雨水與市政廢水進入水體環(huán)境[11]。磺胺甲惡唑(Sulfamethoxazole, SMZ)是典型的磺胺類抗生素, 可競爭性抑制細菌二氫葉酸合成酶, 發(fā)揮抗菌作用。SMZ具有生產(chǎn)成本低、抗菌譜廣等特點, 除了用于治療細菌性感染疾病之外, 還曾作為飼料添加劑大量用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖[12]。SMZ化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、環(huán)境賦存量大, 是水產(chǎn)養(yǎng)殖等淡水環(huán)境中檢出率最高的抗生素之一[12]。已有多項研究證實SMZ可對水生生物產(chǎn)生毒性與器官損傷, 包括氧化應(yīng)激[13]、胚胎毒性[14]、遺傳毒性[15]和神經(jīng)毒性[16], 以及破壞腸道菌群平衡[17]等。由于SMZ在水體環(huán)境中頻繁檢出, 且毒性效應(yīng)涉及面廣, 其相關(guān)毒理學(xué)研究與生態(tài)風(fēng)險評估亟待開展。

目前, 微塑料與其他污染物聯(lián)合毒性的研究多集中在重金屬和農(nóng)藥等傳統(tǒng)污染物上[18,19]。微塑料和抗生素在淡水環(huán)境中普遍存在, 但是二者的聯(lián)合毒性效應(yīng)研究十分有限, 微塑料對抗生素的毒性呈現(xiàn)“增強”或“減弱”效應(yīng)亟待澄清。劑量效應(yīng)關(guān)系是評價污染物毒性的核心。與高劑量、短期、單獨暴露相比, 使用環(huán)境相關(guān)濃度污染物進行長期、聯(lián)合暴露研究更具現(xiàn)實意義。雖然微塑料和抗生素實際環(huán)境濃度并不高, 但是可能會通過吸附互作, 在環(huán)境或生物體內(nèi)積累、遷移和轉(zhuǎn)化; 甚至?xí)ㄟ^食物鏈傳遞, 引發(fā)環(huán)境與健康風(fēng)險。因此,研究環(huán)境相關(guān)濃度兩類污染物共暴露引發(fā)的毒理效應(yīng)十分必要。浮游動物在水環(huán)境物質(zhì)循環(huán)和能量傳遞過程中發(fā)揮重要作用, 同時也影響污染物在食物鏈中的遷移轉(zhuǎn)化。大型溞(Daphnia magna)以浮游植物、藻類和細菌等生物為食, 同時又是魚類和其他水生動物的食物。大型溞是我國質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局官方認(rèn)定的污染物評估模式生物, 同時也是生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域的重要模式生物[20]。此外,大型溞蟲體透明、飼喂簡單、繁殖能力強, 是開展微塑料研究的良好實驗物種。鑒于此, 本研究選取PVC和SMZ為微塑料、抗生素的典型代表材料, 探討二者相互作用與聯(lián)合毒性效應(yīng), 關(guān)注其對大型溞生長生殖、氧化應(yīng)激、腸道和運動能力的影響, 以期為SMZ和PVC共存下引發(fā)的環(huán)境和生態(tài)風(fēng)險評估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

PVC微塑料(下文簡稱PVC)購自東莞市華創(chuàng)塑化有限公司。為確定該微塑料粒徑, 本研究借助掃描電鏡(JSM-IT500, Jeol, Japan)觀察, 并統(tǒng)計其粒徑分布。進行毒理學(xué)暴露實驗時, 用蒸餾水配制成1 g/L的PVC母液。

SMZ(分子式C10H11N3O3S, 純度≥98.0%, CAS號723-46-6)購自上海麥克林生化科技有限公司。由于SMZ水溶性不佳, 本研究選用二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)作為助溶劑。參照文獻[21]描述方法, 使用高效液相色譜儀(LC20, Shimadzu,Japan)檢測溶液中SMZ濃度。

1.2 PVC與SMZ的吸附作用

為了研究PVC與SMZ的相互作用, 參照文獻[22]描述方法, 考察水溶液中PVC對SMZ的吸附能力。在本吸附實驗中, 溫度均為(23.0±1.0)℃。首先, 考察PVC (20 mg/L)對SMZ (20 mg/L)的吸附動力學(xué)。然后, 配置不同濃度(4—30 mg/L)的SMZ溶液, 加入終濃度為20 mg/L的PVC, 在150 r/min振蕩12h后, 檢測溶液中SMZ濃度, 繪制吸附等溫線。在吸附平衡后, 使用傅立葉紅外光譜儀(FTS-40, Bio-Rad, USA)測定PVC表面官能團變化, 儀器的分辨率設(shè)定為2/cm, 掃描的波數(shù)范圍為400—4000/cm。PVC與SMZ的吸附作用實驗中, 助溶劑DMSO的終濃度為0.1% (w/v)。

1.3 大型溞飼喂與急/慢性毒理實驗

大型溞飼喂大型溞的養(yǎng)殖與飼喂參考本實驗室前期報道[12], 培養(yǎng)基為M4, 培養(yǎng)溫度為(23.0±1.0)℃, 光周期為14L∶10D, 培養(yǎng)密度為50只/L, 食物為蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)。培養(yǎng)過程為半靜態(tài), 即每2d更換50%的培養(yǎng)基。毒理學(xué)實驗所用大型溞為出生＜24h的幼溞, 并且幼溞需要活動靈敏、體型均一。

急性毒理實驗依據(jù)經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(Organization for economic co-operation and development, OECD)推薦的方法[23], 首先對大型溞進行48h的急性毒性實驗。本實驗設(shè)置對照組、PVC單獨暴露實驗組(1 mg/L)、SMZ暴露實驗組(濃度范圍50—270 mg/L); 同時, 在SMZ暴露組中添加終濃度為1 mg/L的PVC, 即形成SMZ+PVC聯(lián)合暴露實驗組。在實驗中, 將幼溞置于裝有100 mL M4培養(yǎng)基的燒杯中, 每個燒杯養(yǎng)殖20只幼溞。在48h后, 輕微晃動燒杯, 不能游動的幼溞認(rèn)為死亡。上述所有對照與實驗組培養(yǎng)液中均含有0.1% (w/v)的DMSO,每個實驗組均設(shè)置3個平行, 重復(fù)3次。參照文獻[24],計算SMZ與PVC聯(lián)合作用類型。同時, 在48h急性毒理實驗后, 對大型溞體內(nèi)PVC和SMZ含量進行檢測。大型溞體內(nèi)PVC微塑料含量參照報道方法[25]計數(shù); 48h急性毒理暴露后的大型溞經(jīng)洗滌、研磨、離心(10000×g, 10min)后, 取上清液進行SMZ濃度檢測。大型溞體內(nèi)PVC和SMZ濃度測定時, 每個實驗組設(shè)置3個平行, 重復(fù)3次。為降低培養(yǎng)液中PVC沉降帶來的實驗誤差, 每12h手動搖晃大型溞培養(yǎng)瓶1次。

21d慢性毒理實驗依據(jù)OECD推薦的大型溞慢性毒理實驗方法[23]開展21d慢性毒理試驗, 考察PVC和SMZ對大型溞生長繁殖的影響。PVC的濃度固定為1 mg/L, SMZ暴露濃度為10、100和1000 μg/L, 實驗組與對照組中含有0.01% (w/v)的DMSO。在21d慢性毒理試驗中, 對照及實驗組均設(shè)置10個平行, 每個平行1只幼溞。幼溞置于50 mL M4培養(yǎng)基, 其中添加設(shè)定濃度的PVC或/和SMZ。參照文獻[26], 統(tǒng)計大型溞存活率、蛻皮數(shù)和生殖數(shù), 每7d在體視鏡(M205A, Leica, Germany)下測量其體長, 直至21d實驗結(jié)束。為降低培養(yǎng)液中PVC沉降帶來的實驗誤差, 每12h手動搖晃大型溞培養(yǎng)瓶1次。

1.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)測定與腸道染色

檢測經(jīng)PVC或/和SMZ暴露21d后的大型溞體內(nèi)3個氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平: 丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(Glutathione s-transferase, GST)。本研究均使用南京建成生物研究所試劑盒檢測MDA、SOD和GST含量/活性,商品貨號分別為A003-1-1、A001-1-1和A004-1-1,測定方法均嚴(yán)格依照試劑盒說明書操作, 檢測原理如下: MDA為自由基攻擊生物膜等脂類物質(zhì)的終產(chǎn)物, MDA可與硫代巴比妥酸(Thibabituric acid)縮合形成紅色產(chǎn)物, 可通過532 nm處檢測其濃度來反饋MDA含量。超氧陰離子自由基會氧化羥胺形成亞硝酸鹽; SOD能清除超氧陰離子自由基, 亞硝酸鹽的濃度與SOD的活性呈反比, 可根據(jù)亞硝酸鹽濃度(顯色法測定532 nm吸光值)以反饋SOD酶活。GST具有催化還原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)與1-氯-2, 4-二硝基苯(1-chloro-2, 4-dinitrobenzene)結(jié)合的能力, 反應(yīng)體系中GSH與GST酶活呈反比關(guān)系; 因此, 可通過顯色法在412 nm處測定GSH濃度以反饋GST酶活性。檢測MDA、SOD和GST時, 大型溞樣品處理參照本實驗室前期報道方法[27], 將暴露21d后的大型溞使用M4培養(yǎng)基短暫洗滌以去除其體表吸附的SMZ和PVC。每個樣品取20只大型溞于1.5 mL的離心管中, 按試劑盒說明書要求加入勻漿緩沖液, 研磨充分后以2500 r/min的轉(zhuǎn)速離心10min, 收集上清液。使用Bradford法[28]測定上清液中蛋白質(zhì)含量, MDA、SOD和GST測定值用蛋白質(zhì)濃度進行歸一化處理。在上述生化指標(biāo)測定實驗中, 每個檢測樣品使用20只大型溞, 對照組和實驗組均設(shè)置5個平行重復(fù)。

根據(jù)本實驗室前期報道方法[12], 檢測大型溞腸道的組織學(xué)變化。取5只暴露21d后的大型溞于EP管中, 固定過夜, 用乙醇梯度脫水, 之后進行透明處理, 再通過浸蠟儀進行滲透, 最后用純石蠟將大型溞包埋。使用石蠟切片機在大型溞中腸部位切片, 干燥5h后進行蘇木精-伊紅染色, 并用中性樹脂封片, 然后在顯微鏡下對切片觀察并拍照。

1.5 運動行為測定

根據(jù)我們前期報道的方法[12]進行大型溞行為學(xué)檢測。將對照組和經(jīng)污染物暴露21d的大型溞置于6孔板中, 每孔放入1只大型溞, 內(nèi)含2 mL M4培養(yǎng)液。使用數(shù)碼攝像機(EOS450D, Canon, Japan)錄制大型溞運動視頻, 借助軟件Kinovea (Ver.9.4,Joan Charmant & Kinovea, https://www.kinovea.org/,USA)分析視頻, 計算其運動速度, 并使用軟件Ctrax(Ver.0.518, Caltech, http://ctrax.sourceforge.net/, USA)生成運動軌跡。在運動行為測定實驗中, 每個實驗組設(shè)置5次平行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利 用Excel (Ver.2019, Microsoft, https://www.microsoft.com/zh-cn/, USA)和SPSS (Ver.20.0, IBM,http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/,USA)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)分析, 數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(Standard deviation, SD)表示。實驗數(shù)據(jù)首先進行正態(tài)性檢驗, 如果通過檢驗,兩個獨立樣本(SMZ組與SMZ+PVC組)之間顯著性比較采用Student’st-text進行分析, 顯著性用星號表示(*表示P＜0.05, **表示P＜0.01); 使用單因素方程分析(one-way ANOVA)比較SMZ組或SMZ+PVC組內(nèi)的數(shù)據(jù)差異, 并進行Duncan多重比較檢驗, 不同大寫字母(A、B和 C)表示SMZ組內(nèi)的顯著差異(P＜0.05), 不同小寫字母(a、b和c)表示SMZ+PVC組間的顯著差異(P＜0.05)。

2 結(jié)果

2.1 PVC與SMZ的相互作用

本研究所用PVC微塑料呈規(guī)則球形(圖1a), 粒徑分布于0.03—2.32 μm, 平均粒徑為(0.65±0.32) μm,顆粒多集中在0.2—0.8 μm (圖1b)。圖1c是PVC與SMZ的吸附動力學(xué)曲線: 吸附開始時(0—2h), PVC對SMZ的吸附速率快, 吸附量增加也較快; 隨著反應(yīng)進行到6h, 吸附量增長緩慢; 反應(yīng)至10h時, 吸附逐漸飽和并趨于平衡。

圖1 PVC微塑料的表征及其與SMZ吸附作用Fig.1 Characterization of PVC particles and adsorption between PVC and SMZ

為了進一步明確PVC對SMZ的吸附特性, 本研究測定了PVC對SMZ的吸附等溫線。如圖1d所示,隨著溶液中SMZ濃度升高, 平衡吸附量呈線性增長。在吸附平衡后, 我們將PVC從溶液中分離、干燥處理后, 使用掃描電子顯微鏡和紅外光譜儀表征其形態(tài)與化學(xué)基團變化, 并統(tǒng)計其粒徑分布。如圖1e所示, 在PVC吸附SMZ處理后, 顆粒表面形貌無明顯變化。粒徑統(tǒng)計結(jié)果(圖1f)顯示, 充分吸附SMZ后的PVC粒徑分布于0.07—2.22 μm, 平均粒徑為(0.65 ± 0.31) μm, 顆粒多集中在0.2—0.8 μm。紅外光譜結(jié)果(圖1g)顯示, PVC與SMZ充分吸附后未出現(xiàn)新官能團峰, 且615/cm處C—Cl伸縮振動特征峰未偏移, 表明二者未發(fā)生化學(xué)吸附。

2.2 PVC緩解了SMZ對大型溞的致死效應(yīng)(48h急性毒理實驗)

結(jié)果顯示, SMZ對大型溞的48h急性毒性EC50(48h)為131.2 mg/L; 1 mg/L的PVC與不同濃度SMZ聯(lián)合暴露時, 對大型溞的EC50(48h)為156.9 mg/L,這表明PVC減輕了SMZ的毒性。圖2a顯示, SMZ與1 mg/L的PVC共存時, 與單獨SMZ暴露實驗組相比,大型溞致死率下降, 且在120、150和270 mg/L實驗組時存在統(tǒng)計學(xué)差異。

圖2 SMZ單獨或與PVC聯(lián)合暴露大型溞的48h急性毒理實驗Fig.2 48h acute toxicity test of SMZ or SMZ+PVC exposure to D.magna

圖2b顯示, SMZ的存在沒有影響大型溞對PVC的攝入。圖2c顯示, 1 mg/L的PVC與SMZ共同暴露時, 降低了大型溞體內(nèi)SMZ的含量, 且在120和150 mg/L實驗組中存在顯著差異(P＜0.05)和極顯著差異(P＜0.01)。通過光學(xué)顯微鏡觀測(圖2d), 我們發(fā)現(xiàn)SMZ+PVC共同暴露實驗組的大型溞腸道內(nèi)均有PVC存在, 且與SMZ濃度無明顯相關(guān)性, 該結(jié)果與大型溞體內(nèi)PVC計數(shù)結(jié)果(圖2b)一致。

2.3 SMZ+PVC對大型溞生長和生殖的毒性效應(yīng)(21d慢性毒理實驗)

圖3顯示了SMZ或SMZ+PVC暴露21d對大型溞的生長發(fā)育及生殖能力的影響。雖然SMZ與PVC單獨或聯(lián)合暴露對大型溞存活率(圖3a)與蛻皮次數(shù)無顯著影響(圖3b), 但是PVC會減緩10 μg/L SMZ對大型溞體長的促進作用(P＜0.01; 圖3c)。總產(chǎn)卵量計數(shù)結(jié)果(圖3d)顯示, SMZ對大型溞產(chǎn)卵量影響存在非典型劑量效應(yīng)關(guān)系。與對照組相比, PVC與SMZ聯(lián)合暴露顯著提升了100 μg/L (P＜0.001)和1000 μg/L (P＜0.05)濃度SMZ暴露組中大型溞的產(chǎn)卵量(圖3d)。綜上, 在21d毒理學(xué)實驗中, PVC和SMZ的存在對大型溞存活率和蛻皮數(shù)沒有影響; 值得注意的是, 對于大型溞的體長和產(chǎn)卵量而言, PVC具有減輕SMZ毒性的效果。

圖3 SMZ單獨或與PVC聯(lián)合暴露(21d)對大型溞存活、蛻皮和生長繁殖能力的影響Fig.3 Effects of SMZ or SMZ+PVC exposure on mortality, molt, body length, and reproduction of D.magna

2.4 PVC與SMZ聯(lián)合暴露誘發(fā)大型溞氧化應(yīng)激和腸道損傷(21d急性毒理實驗)

為了探究污染物單獨或者聯(lián)合暴露是否會引起大型溞氧化應(yīng)激, 我們檢測了MDA、SOD和GST三個生物標(biāo)志物的水平變化。如圖4a顯示, SMZ單獨暴露或者SMZ+PVC聯(lián)合暴露會使MDA含量呈濃度依賴性升高, 在高濃度SMZ暴露劑量時, 呈現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05); PVC的存在加劇了MDA的誘導(dǎo)產(chǎn)生(P＜0.05)。圖4b顯示, 1000 μg/L高劑量的SMZ暴露顯著降低了大型溞體內(nèi)SOD酶活性(P＜0.05); 在PVC與SMZ共同暴露時, 污染物對SOD活性的影響更為顯著(PVC+100 μg/L SMZ; PVC+1000 μg/L SMZ;P＜0.05)。圖4c顯示, 雖然SMZ單獨暴露對GST活性無顯著影響, 但是PVC與SMZ聯(lián)合暴露會導(dǎo)致GST活性呈濃度依賴性降低(PVC+1000 μg/L SMZ,P＜0.05), 即PVC的加入顯著加重了SMZ對GS0T活性的抑制。

圖4 SMZ單獨或與PVC聯(lián)合暴露(21d)大型溞導(dǎo)致氧化應(yīng)激和腸道損傷Fig.4 SMZ or SMZ+PVC exposure induces oxidative stress and intestinal structure damage of D.magna

為了考察SMZ單獨暴露或SMZ+PVC聯(lián)合暴露對大型溞腸道健康影響, 我們對污染物暴露21d后的大型溞的中腸部位的切片進行觀察。如圖4d所示, 對照組中大型溞的腸道結(jié)構(gòu)完整, 上皮細胞排列緊密有序, 腸道橫切面呈光滑的圓形。隨著SMZ暴露劑量的增加, 大型溞腸道組織出現(xiàn)明顯的損傷, 上皮細胞間界限模糊且略顯松散, 紋狀緣模糊, 部分細胞間甚至發(fā)生斷裂, 出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象; 并且, 損傷程度與SMZ濃度呈現(xiàn)依賴效應(yīng)。值得指出的是, 與單獨SMZ暴露組相比, SMZ和PVC聯(lián)合暴露后, 大型溞的腸道損傷更為明顯, 即PVC的存在加重了SMZ對大型溞的腸道損傷效應(yīng)。

2.5 PVC與SMZ聯(lián)合暴露誘發(fā)大型溞運動損傷(21d慢性毒理實驗)

如圖5a顯示, SMZ單獨暴露導(dǎo)致大型溞運動速度呈濃度依賴性降低(100及1000 μg/L SMZ;P＜0.05)。PVC與SMZ聯(lián)合暴露大型溞也顯示出類似的效果,且PVC的加入導(dǎo)致大型溞的運動速度均出現(xiàn)下降趨勢, 其中2個聯(lián)合暴露組(SMZ+PVC 10 μg/L及SMZ+PVC 100 μg/L)中出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)。我們將SMZ單獨暴露和SMZ+PVC聯(lián)合暴露各實驗組中大型溞的代表性運動軌跡進行分析。如圖5b所示, 對照組中大型溞運動軌跡平滑且較為均勻的分布于孔板各個位置。在SMZ暴露后, 大型溞運動軌跡出現(xiàn)停滯和原地轉(zhuǎn)動的現(xiàn)象, 且運動軌跡局限于孔板的某一范圍, 并且上述現(xiàn)象隨著SMZ暴露劑量的增加更為明顯。值得指出的是, 1 mg/L的PVC存在會加重各個劑量SMZ引發(fā)的大型溞運動損傷。

圖5 SMZ單獨或與PVC聯(lián)合暴露(21d)對大型溞運動能力的影響Fig.5 Effects of SMZ or SMZ+PVC exposure on the swimming behavior of D.magna

3 討論

3.1 污染物暴露濃度的選擇

微塑料和抗生素在環(huán)境中長期共存, 研究二者的相互作用與聯(lián)合毒性十分必要。抗生素SMZ使用劑量大、半衰期長, 在水體中檢出率高。SMZ在一般淡水環(huán)境中的濃度為ng/L到μg/L范圍, 在高污染水域中其濃度可達上百μg/L。例如, 越南河內(nèi)附近的醫(yī)藥和養(yǎng)殖廢水中SMZ濃度為252 μg/L[29]; 我國桂林會仙喀斯特濕地環(huán)境中, SMZ的環(huán)境濃度可達到51.14 μg/L[30]。微塑料的環(huán)境濃度一般在μg/L到mg/L范圍內(nèi)[7], 在人類活動密集的河流中微塑料的檢出率高, 賦存量甚至高于10 mg/L[31]。因此, 很多學(xué)者選擇mg/L級別的微塑料進行毒性效應(yīng)研究, 研究物種涉及鯉[4]、大型溞[32]和珊瑚(Tubastrea aurea)[33]。基于SMZ和微塑料環(huán)境相關(guān)濃度, 以及我們的前期研究基礎(chǔ)[13], 本研究選擇1 mg/L和10—1000 μg/L作為PVC和SMZ的暴露濃度, 考察兩種污染物對大型溞的聯(lián)合毒性。

3.2 SMZ和PVC的體外吸附研究

為了研究PVC對SMZ的吸附作用, 我們首先開展了吸附動力學(xué)和吸附等溫線實驗。吸附動力學(xué)曲線顯示(圖1c), SMZ從水相向PVC表面擴散速度很快(10h可達到吸附平衡), 說明二者吸附能力強。這種現(xiàn)象與PVC吸附環(huán)丙沙星的過程類似[34]。PVC對SMZ的親和力較大, 吸附等溫線呈線性增長模式(圖1d), 推測二者的互作機制為疏水分配作用和范德華力[35]。本研究吸附等溫線結(jié)果與文獻中PVC吸附四環(huán)素[36]和環(huán)丙沙星[37]的過程類似。此外, PVC吸附SMZ前后的表面形態(tài)、粒徑大小和紅外光譜結(jié)果無明顯變化。因此, 我們判斷二者的吸附類型為物理吸附。Xu等[38]的研究也發(fā)現(xiàn)SMZ與PE微塑料會發(fā)生物理吸附, 范德華力和疏水鍵是二者吸附的主要作用力。當(dāng)然, 確定PVC對SMZ吸附官能團及吸附模型等機制問題還需要借助X射線光電子能譜儀、傅里葉變換紅外光譜儀等技術(shù)手段進一步確定。值得指出的是, 文獻顯示PVC對左氧氟沙星[3]、阿莫西林[39]、四環(huán)素[36]和環(huán)丙沙星[37]等抗生素均存在吸附作用。基于文獻和本研究結(jié)果, 我們認(rèn)為PVC與SMZ會在水環(huán)境和生物體中吸附互作, 從而產(chǎn)生復(fù)雜的生物毒性。因此, 二者共存時的生物毒性研究亟待開展。

3.3 SMZ和PVC聯(lián)合暴露對大型溞生長和生殖的影響

急性毒性實驗是評價化學(xué)品安全性的首選方法。本研究顯示, 1 mg/L的PVC會降低SMZ對大型溞的致死率(圖2a)。通過顯微鏡觀察和微塑料顆粒計數(shù), 我們發(fā)現(xiàn)PVC積累于大型溞腸道內(nèi)(圖2b和2d)。并且, SMZ+PVC聯(lián)合暴露組中大型溞體內(nèi)的SMZ濃度顯著低于SMZ單獨暴露組(圖2c)。經(jīng)微塑料與SMZ聯(lián)合暴露的羅非魚[40]和小鼠[41]也存在類似結(jié)果, 即微塑料的存在會降低SMZ在生物體中的積累。日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)相關(guān)研究[26]也顯示, 96h急性毒理實驗時, PS微塑料會通過吸附鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate, DBP)而降低其生物利用度, 展現(xiàn)出減弱DBP毒性的生物效應(yīng)。本研究推測PVC對SMZ毒性的減弱是由于積累于大型溞腸道內(nèi)的微塑料將SMZ吸附固定, 使得生物體內(nèi)“有效”SMZ濃度下降, 進而減弱了抗生素毒性。本文認(rèn)為, 該生物毒性效應(yīng)與PVC能快速吸附SMZ的研究結(jié)果是可相互印證的。

劑量效應(yīng)是研究污染物毒性的關(guān)鍵因素。實際上, 暴露劑量是污染物濃度和暴露時間的雙重效應(yīng)加和結(jié)果。雖然PVC在48h急性毒理實驗中可以降低SMZ對大型溞的致死效應(yīng), 但是PVC與SMZ的長期暴露毒性效應(yīng)還需要進一步證實。與急性毒理實驗相比, 慢性毒理實驗中污染物暴露濃度設(shè)置更接近于環(huán)境相關(guān)濃度, 研究結(jié)果更能反映真實生態(tài)風(fēng)險。尤其是, 慢性毒理實驗可以考察污染物的遺傳毒性、免疫毒性和運動損傷等指標(biāo), 更適合微塑料、抗生素等低毒物質(zhì)的生態(tài)風(fēng)險評價。李勤等[42]研究發(fā)現(xiàn), 雖然12.5 mg/L的PVC微塑料對大型溞心率、攝食和抗氧化酶活性無影響, 但是其子代會出現(xiàn)體長變短、發(fā)育畸形等現(xiàn)象。因此, 本研究選擇了環(huán)境相關(guān)濃度PVC和SMZ開展21d慢性毒理實驗, 從生長生殖、氧化應(yīng)激、腸道生理和運動行為角度進一步探究二者的聯(lián)合毒性。結(jié)果顯示, 雖然SMZ單獨或者與PVC聯(lián)合暴露均沒有影響大型溞致死率、蛻皮數(shù)、體長和產(chǎn)卵量; 但是, 對于大型溞的體長和產(chǎn)卵量而言, PVC具有減輕SMZ毒性的效果(圖3)。這與PS微塑料和磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethazine)聯(lián)合暴露海洋青鳉(Oryzias melastigma)的研究結(jié)果相似, 即微塑料不僅對生物體發(fā)育與生殖無影響, 并且會減弱抗生素的生殖毒性[43]。

3.4 SMZ和PVC聯(lián)合暴露引發(fā)大型溞氧化應(yīng)激、腸道損傷和運動障礙

與生長、生殖等生物學(xué)指標(biāo)相比, 大型溞的抗氧化系統(tǒng)對污染物的毒性反饋更為敏感[44]。MDA、SOD和GST均是公認(rèn)的氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物。當(dāng)生物體遭受外界環(huán)境脅迫時, 通常會誘導(dǎo)活性氧自由基爆發(fā), 導(dǎo)致細胞內(nèi)的多聚不飽和脂肪酸受損產(chǎn)生MDA[45]。SOD的生物功能是清除活性氧自由基,其活力下降代表機體抗氧化能力降低[46]。GST可通過修復(fù)自由基引起的膜磷脂損傷、抑制微粒體過氧化反應(yīng)等途徑發(fā)揮抗氧化作用, 并參與生物體解毒功能[47]。方海燕等[48]研究發(fā)現(xiàn)PVC微塑料暴露可以顯著上調(diào)大型溞SOD基因表達量。也有報道顯示, SMZ暴露誘發(fā)斑馬魚等水生生物產(chǎn)生氧化應(yīng)激[49]。本研究發(fā)現(xiàn), SMZ單獨或SMZ+PVC聯(lián)合暴露21d后, 均會引發(fā)大型溞氧化應(yīng)激; 并且, PVC會加劇SMZ誘發(fā)的氧化損傷(圖4)。與48h急性毒理實驗不同, PVC和SMZ的疊加毒性效應(yīng)在21d實驗中逐漸展現(xiàn)出來。結(jié)合PVC與SMZ的吸附效應(yīng)分析, 長期積累于大型溞體內(nèi)的PVC顆粒可能發(fā)揮了富集水體中SMZ的作用。由此推測, 大型溞的抗氧化系統(tǒng)難以及時清除體內(nèi)的活性氧自由基, 污染物誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化損傷可能會進一步影響其營養(yǎng)吸收和生理代謝。

大型溞的中腸是分泌消化酶和吸收營養(yǎng)的重要器官, 腸道結(jié)構(gòu)完整性是其發(fā)揮生理功能的基礎(chǔ)[50]。作為濾食性生物, 大型溞的腸道是微塑料攻擊的首要器官[7]。此外, 水環(huán)境中的抗生素也會不斷進入大型溞腸道, 破壞腸道菌群平衡, 間接損傷腸道穩(wěn)態(tài)。實際上, 除了大型溞, 微塑料對水生生物腸道功能破壞十分普遍, 涉及腸道結(jié)構(gòu)受損[51]、腸道炎癥[52]等。例如, 盛誠等[5]發(fā)現(xiàn)PVC微塑料會加重抗菌劑三氯生對斑馬魚腸道的損傷。本研究發(fā)現(xiàn), SMZ單獨暴露會引起大型溞腸道結(jié)構(gòu)損傷,SMZ+PVC聯(lián)合暴露會加劇大型溞腸道損傷, 甚至導(dǎo)致腸道上皮細胞間發(fā)生斷裂和空泡化(圖4d)。基于本研究PVC對SMZ物理吸附結(jié)果, 推測積累于大型溞消化道中的PVC會持續(xù)吸附培養(yǎng)液中的SMZ, 進而增多SMZ在腸道的攝入與積累量, 造成兩種污染物在大型溞腸道局部“強化”暴露, 導(dǎo)致SMZ+PVC聯(lián)合毒性效應(yīng)疊加。雖然微塑料和抗生素單獨暴露引發(fā)生物體腸道損傷的研究很多, 但是長期暴露下微塑料加劇抗生素腸道毒性的報道并不多見, 該聯(lián)合毒性效應(yīng)需引起關(guān)注。

生物體需要攝取能量以應(yīng)對污染物脅迫。我們推測, 積累于腸道的PVC可能會導(dǎo)致大型溞虛假性飽腹感。并且, SMZ+PVC聯(lián)合暴露引發(fā)的腸道損傷會直接降低大型溞營養(yǎng)吸收, 造成能量供應(yīng)不足。實驗動物的運動行為可直觀地反饋生物體的能量代謝水平, 該指標(biāo)已成為評估污染物的毒性效應(yīng)的有效手段[53]。本研究發(fā)現(xiàn), SMZ單獨或SMZ+PVC聯(lián)合暴露大型溞21d后, 都會引發(fā)大型溞游泳速度下降; 并且, SMZ+PVC聯(lián)合暴露增強了該毒性效應(yīng)(圖5)。本研究認(rèn)為, SMZ暴露引起大型溞運動能力速度下降, 與能量供給不足密切相關(guān)。在PVC與SMZ共存時, 嚴(yán)重的腸道損傷更為降低大型溞的能量攝取。此外, PVC吸附SMZ產(chǎn)生的氧化損傷會干擾大型溞免疫和代謝調(diào)控, 進而引起運動行為受損。有研究表明, PE微塑料-苯并芘(Benzopyrene)聯(lián)合暴露會導(dǎo)致海洋青鳉幼魚游泳速度降低[54]; 微塑料-汞聯(lián)合暴露也會影響歐洲鱸(Dicentrarchus labrax)的運動行為, 甚至出現(xiàn)昏睡和倒立游泳等現(xiàn)象[55]。大型溞是淡水環(huán)境食物鏈中重要組成部分,積累于大型溞腸道中的微塑料和抗生素會隨食物鏈傳遞與富集。在長期暴露時, 本研究所展示的PVC對SMZ腸道毒性、氧化應(yīng)激和運動損傷的增敏效應(yīng)不容忽視, 二者共存所產(chǎn)生的生態(tài)毒理風(fēng)險需引起足夠重視。

抗生素與微塑料在水環(huán)境中長期共存, 兩類污染物的生態(tài)風(fēng)險與毒性效應(yīng)評估已引起學(xué)者關(guān)注。然而, 二者的聯(lián)合毒性效應(yīng)報道不一: 微塑料減弱或者增強抗生素毒性均有報道。例如, PS微塑料會加重四環(huán)素對草魚(Ctenopharyngodon idella)腸道和鰓組織損傷[56]。Fonte等[57]也發(fā)現(xiàn), PE微塑料會加重頭孢氨芐對蝦虎魚(Pomatoschistusmicrops)的神經(jīng)毒性和氧化損傷。相反,Y u等[14]將PS微塑料和土霉素聯(lián)合暴露斑馬魚, 觀察到微塑料會減輕土霉素引起的腸道損傷,且大粒徑微塑料對抗生素的毒性緩解作用更大。類似的,Guo等[58]在底棲生物河蜆(Corbicula fluminea)的研究中也顯示出PS微塑料可減輕環(huán)丙沙星的生物毒性。本文推測,微塑料會通過腸道損傷,增加生物體對污染物的攝入[59];相反, 微塑料也能通過吸附作用,改變生物體對污染物的可利用性[60]。結(jié)合本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)微塑料-抗生素對于生物體的毒害可能受污染物劑量效應(yīng)、微塑料粒徑效應(yīng)和受試物種差異等多方面因素影響, 該科學(xué)問題需要從毒理學(xué)、環(huán)境化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和腸道微生物學(xué)等多學(xué)科、多角度探究。尤其是, 使用環(huán)境相關(guān)濃度污染物對生物體進行長期、多世代暴露研究更具現(xiàn)實意義。總之, 微塑料和抗生素的聯(lián)合毒性效應(yīng)復(fù)雜而多變, 相關(guān)毒性機制還有待深入闡述。