棕點石斑魚(♀) × 清水石斑魚(♂) 雜交子代與親本表型比較及遺傳特征分析

王 同 方明宇 楊 揚 宋樂玲 蔡春有 蒙子寧, 劉曉春,

(1.中山大學生命科學學院, 有害生物控制與資源利用國家重點實驗室, 廣東省水生經濟動物良種繁育重點實驗室,廣州 510006; 2.海南晨海水產有限公司, 三亞 572000; 3.南方海洋科學與工程廣東省實驗室(珠海), 珠海 519080)

雜交育種可以將親本的優勢性狀結合到一起,從而獲得性狀優良的雜交新品種[1]。雜交育種技術已經在家禽[2]、家畜[3]及糧食作物[4]、蔬菜[5]等眾多經濟物種中得到良好應用。從20世紀50年代末至今, 我國共有一百多種魚類進行過雜交育種試驗,并獲得多個優良雜交品種[6,7]。根據中華人民共和國農業農村部歷年公告, 截至2023年, 經我國農業部水產原良種審定委員會審定通過的142個魚類新品種中, 雜交種共有48個, 占比33.8%。因此, 雜交育種作為行之有效的育種手段之一, 已經廣泛應用于農業生產系統。

外部形態結構特征是不同物種遺傳特性最為直觀的外在表現, 進行親本及雜交子代的表型差異對比可以最直觀地分析群體之間存在的差異。在外部形態結構的對比研究中, 可量性狀與可數性狀在水產領域中應用較多。為了更好地進行品系鑒定, Strauss等[8]提出魚體框架分析法, 選取一定的框架坐標點, 對點之間的距離進行測量, 并采取多種分析方法對魚的外部形態差異進行探究。在泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)和大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)雜交子代與其親本形態特征比較中, 對正反交后代兩種雜交子代的外部形態結構數據進行聚類分析及主成分分析, 發現雜交子代均與大鱗副泥鰍更相似[9], 王燕等[10]結合普通性狀測定與框架分析, 對5種石斑魚的相關性狀并進行了統計分析。冉光鑫等[11]對180條四川裂腹魚(Schizthorax kozlovi)和180條光唇裂腹魚(Schizothorax lissolabiatus)的25個比例性狀進行了統計, 并進行了判別分析和主成分分析, 探究兩種魚的外部形態差異, 鑒別外部相關特征。對種間外部形態結構特征的比較分析, 可以為品種鑒定及分類提供參考資料, 具有重要的指導意義。

在雜交組合的親本中, 控制優勢性狀的遺傳位點在雜合狀態時大多表現出不完全顯性, 通過雜交育種則可以產生全新的基因型組合, 從而在雜交子代實現優勢性狀的理想搭配[12]。通過雜交育種, 雜交子代可以形成更高的遺傳多樣性, 而遺傳多樣性的評價可以為動植物育種和遺傳改良奠定基礎[13]。對親本及雜交子代分子遺傳指標的比對可以為雜交育種性狀的進一步篩選提供理論依據。此外, 在微衛星的篩選過程中, 可以發現種間存在的特異性條帶, 對種間鑒定起到一定作用。

微衛星標記因其基團重復數目變化大、多態性豐富、擴增穩定、位點數量眾多并廣泛分布于基因組等特點[14], 在鑒定物種的種間差異性和種內遺傳多樣性上具有很大的優勢, 并且可以在雜交育種中用于分析親本與雜交子代的遺傳關系、探究雜種優勢、分析種群的遺傳變異等[15]。在常見作物的雜交育種中, 如水稻(Oryza sativa)[16]、小麥(Triticum aestivum)[17]、玉 米(Zea mays)[18]等, 微 衛星標記對雜交種的性狀探究及親本的選配都起到了重要的指導作用。在水產生物中, 微衛星分子標記也在大菱鲆(Scophthalmus maximus)[19]、對蝦(Penaeus)[20]、鮑(Haliotis)[21]、牡 蠣(Ostreidae)[22]、紅點鮭(Salvelinus leucomaenis)[23]、海鱸(Dicentrarchus labrax)[24]等物種中進行了遺傳結構及遺傳多樣性的分析, 為后續的選育及雜交提供了理論基礎。

石斑魚隸屬鱸形目(Perciformes), 石斑魚科(Epinephelidae), 共有16個屬, 160多個種, 其中, 在中國海域內約有60種, 國內有養殖記錄的共40多種[25]。石斑魚具有豐富的種質資源, 為開展雜交育種提供了非常有利的基礎。迄今為止, 通過雜交育種已經獲得了虎龍雜交斑和云龍石斑魚兩個水產新品種, 極大的推動了石斑魚養殖產業的發展。因此, 我們團隊開展了大量石斑魚雜交育種組合試驗,并獲得了多個有潛在開發前景的雜交后代。其中,以棕點石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus)為母本、清水石斑魚(E.polyphekadion)為父本的雜交組合,其子代在生產上體現出諸如抗逆性等優勢性狀, 經培育有望成為新品種。本文利用微衛星分子標記,對棕點石斑魚、清水石斑魚及雜交子代3個群體的外部形態結構及外型框架參數進行探究, 同時使用微衛星標記對雙親本及雜交子代的遺傳特征進行分析, 以期為石斑魚的種間鑒定及雜交新品種的培育提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗魚與樣品采集

本實驗所用的棕點石斑魚、清水石斑魚及雜交子代來自于海南晨海水產有限公司, 個體均為1.5—2.5齡群體, 所有個體體型大小相近。測量及取樣前, 3個群體在水泥池中暫養1周, 飼養溫度26—30℃, 溶解氧為5—6 mg/L。對3個群體, 每個群體隨機挑選的30尾石斑魚進行外部形態的測定并剪取尾鰭條保存于95%酒精中。

1.2 實驗方法

雜交子代及其親本外部形態結構數據的測定與統計分析對12個可量性狀進行精準的測定,測定范圍見圖1。框架系統測定D1—2、D1—3等21項框架性狀參數, 具體參照位點可見圖2。比值處理可量性狀, 減少不同魚體大小對實驗結果造成的影響, 最終得到11個比值數據, 通過公式1計算雜交指數(HI)。分別將這11個可量性狀比值與21個框架性狀參數數據總計32個數據使用SPSS統計軟件進行聚類分析和主成分因子分析。

圖1 石斑魚形態學長度測定范圍Fig.1 The measuring range of morphological length of grouper

圖2 石斑魚框架測量圖Fig.2 The truss network of grouper

DNA提取使用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司, 北京; DP324)對取樣的90尾石斑魚的尾鰭條提取DNA, 提取后的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop分光光度計檢測濃度和質量。

微衛星分子標記的篩選微衛星分子標記篩選的過程利用ddRAD-seq (Double digest restriction-site associated DNA sequencing)技術, 將提取后的一個棕點石斑魚DNA樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司構建RAD文庫, 使用6堿基酶EcoR1進行RAD酶切建庫, 在片段兩端加上相應接頭, 擴增后構建測序文庫。使用Paired-End100策略上機(Illumina HiSeq2000)進行高通量測序, 測序所得數據進行RAD tag (標簽)的聚類, 產生組裝 apireend read (read 2), 通過contig檢測和組裝得到長度約300 bp的酶切相關 contig, 用以開發SSR標記。根據測序結果, 使用MISA軟件初步篩選SSR標記,MISA參數設置為二核苷酸重復6次以上, 三核苷酸重復5次以上, 四核苷酸重復5次以上, 五核苷酸重復5次, 六核苷酸重復5次以上, 兩個SSR之間的間隔為100 bp以上。然后進行初篩, 隨機挑選80個重復數在10至25之間的二核苷酸重復、重復數在6至20之間的三核苷酸重復進行引物合成。而后進行PCR擴增, 實驗設置平行對照, 每一對微衛星引物用8個DNA模板進行擴增。PCR反應總體系為10 μL,其中, 加入2×TaqPCR StarMix 5 μL, ddH2O 3.2 μL,3′及5′端微衛星引物各0.4 μL, DNA模板1 μL。PCR程序設定為: 95℃預變性5min; 接著在95℃、68℃和72℃各反應30s, 共10個循環, 每個循環降低1℃; 然后95℃、58℃和72℃各反應30s, 共25個循環, 最后,72℃延伸10min。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 在120 V電壓下電泳16min, 并觀察條帶。保留瓊脂糖凝膠電泳中具有單一亮條帶的微衛星標記, 確認引物可用。然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE), PCR產物在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳, 每泳道上樣PCR產物3 μL, DNA Marker(10 bp DNA Ladder) 為3 μL, 電泳緩沖液為0.5×TBE,電壓600 V下電泳1h。在電泳完成后, 進行硝酸銀染色, 最后將膠片平鋪并拍照分析, 再進行微衛星位點的多態性篩選。根據電泳顯示的結果, 挑選等位基因數大于等于3且沒有非特異性擴增的微衛星位點, 再進行群體擴增。

群體擴增與毛細管電泳每個微衛星位點的正向引物5′端用熒光染料標記。PCR程序設定為: 95℃預變性5min; 95℃、55℃、72℃各反應30s,共38個循環; 最后72℃延伸10min。PCR產物進行毛細管電泳短片段重復序列(Short tandem repeat,STR)分型檢測, 使用ABI 3730 Analyzer進行檢測后, 利用Genemapper 4.0軟件分析, 所用內標為LIZ500, 可檢測FAM、HEX 和ROX三種熒光。根據所得到的峰值判斷微衛星分子位點在3個群體中的多態性程度, 從而對微衛星分子位點進行更為精確的篩選。

數據處理根據上述結果計算等位基因數(Alleles number,A)、 等 位 基 因 頻 率(Allele frequency), 并利用Cervus軟件運算觀測雜合度(Observed heterozygosity,Ho)、 期 望 雜 合 度(Expected heterozygosity,He)和多態信息含量(Polymorphic information content, PIC)[26,27]。

2 結果

2.1 雜交子代與親本可量性狀數據比較分析

根據SPSS分析結果表明(表1), 棕點石斑魚與清水石斑魚有5個可量性狀比值呈現顯著性差異,占全部可量性狀比值的45.45%; 雜交子代與兩個親本相比, 有8個可量性狀比值均呈現出了顯著性差異, 占全部可量性狀比值的72.73%。

表1 雜交斑及親本可量性狀比較Tab.1 Comparison of measurable characters between hybrid grouper and its parents

由表1可以看出, 在11個可量性狀比值中, 體長/體高、體長/體寬、體長/頭長、體長/尾柄長、尾柄長/尾柄高、頭長/吻長、頭長/眼間距、頭長/眼后頭長表現為超親偏離; 全長/體長表現為偏父本;頭長/眼徑表現為偏母本; 雜交指數(HI)均值為49.76, 結果表現出雜交子代可量性狀的比值接近于中心數值。

2.2 雜交子代與親本外型框架比較分析

雜交子代與其親本的外形框架呈現出一定的差異(圖3)。棕點石斑魚頭部較大, 背部稍有隆起,背腹側擴張明顯, 后部有明顯收縮, 尾部偏向矩形;清水石斑魚下頜至腹部呈現平滑連接, 頭上部至背部也向后平滑舒展, 沒有明顯隆起, 軀干前后部拉伸明顯, 尾部偏向梯形; 雜交子代吻前端至頭背部末端呈現較長的拉伸, 背部微微隆起, 整體軀干延展距與母本接近, 偏向棕點石斑魚。尾部性形狀近父本。

圖3 雜交子代及其親本外形框架圖Fig.3 Body shape truss network of Hybrid grouper and its parents

2.3 雜交子代與親本測量數據聚類分析及主成分分析

根據測量數據所計算出的雜交子代與棕點石斑魚的歐氏距離為1.756, 與清水石斑魚的歐氏距離為2.532, 由圖4的樹狀圖可以看出, 雜交子代先與棕點石斑魚聚成一支后, 兩者再與清水石斑魚聚成一支, 說明了雜交子代在形態上與母本棕點石斑魚更為相似。

圖4 雜交斑及其親本的聚類分析樹狀圖Fig.4 Hierarchical dendrogram of hybrid grouper and its parents

根據主成分分析結果, 提取出前4個主成分, 由表2可以反映出32個參數對4個主成分的貢獻率情況。第一個主成分PC1貢獻率為70.161%、D7—10、D9—10、D7—8、D5—6、D6—7、D7—9等載荷系數較大, 均在0.90以上, 可以得出PC1主要反映了石斑魚臀鰭、尾鰭的位置信息, 說明雜交斑及其親本的形態學上的差異變化主要發生在魚體尾部。第二個主成分貢獻率為12.217%, 頭長/眼徑,D1—3, 頭長/吻長、頭長/眼后頭長等載荷系數較大, 均在0.60以上, 由此可見PC2主要反映了石斑魚的頭部結構數據對變異的貢獻。四個主成分呈現的91.674%的累積貢獻率具有代表性, 可以選擇用這4個獨立的主成分因子概括魚體外形性狀。使用主成分1和主成分2的相關數值繪制棕點石斑魚、清水石斑魚、雜交子代的主成分散布圖(圖5), 結果顯示, 棕點石斑魚、清水石斑魚及雜交子代形態特點分布各異, 形成3個不同的類群, 相互形態特點不同, 雜交子代有其特有的形態特點。

表2 雜交子代及其親本的32個性狀對4個主成分的特征向量及主成分的貢獻率Tab.2 Eigenvectors and cumulative contribution rates of four principal components from the thirty-two traits of hybrid grouper and its parents

圖5 雜交子代及其親本主成分1和主成分2的散點圖Fig.5 Scatter diagram for PC1 and PC2 of hybrid grouper and its parents

2.4 微衛星分子標記的篩選

對棕點石斑魚進行簡化基因組測序, 所測得有效序列信息占原始測序數據99.70%, 過濾后的有效數據量(Clean bases)共6171561900 bp, 過濾后Q20為95.87%, Q30為89.75%, GC含量為41.04%, 測序數據可以進行后續分析。經過MISA軟件篩選得到SSR位點6266個, 其中二核苷酸2751個(占比43.90%),三核苷酸2380個(占比37.98%), 四核苷酸884個(占比14.11%), 五核苷酸和六核苷酸分別為206個(占比3.29%)和45個(占比0.72%)。

根據隨機選取的80個SSR位點設計引物, 設計引物由廣州擎科生物技術有限公司合成, 對合成的引物進行PCR擴增, 然后進行瓊脂糖凝膠電泳來特異性篩選, 符合要求的PCR產物再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳, 部分電泳結果如圖6。每一個微衛星位點均用8個不同個體進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,結果可見, ae27和ac34兩個微衛星位點主帶明顯,每一個個體在目的區間最多只有2個等位基因, 并且同一引物不同DNA模板擴增的條帶片段有3個以上的等位基因, 可以保留作進一步篩選。

圖6 微衛星位點ae27多態性篩選結果(A)和微衛星位點ac34多態性篩選結果(B)Fig.6 Results of microsatellite loci ae27 diversity screening (A)and loci ac34 diversity screening (B)

2.5 群體擴增及毛細管電泳

根據毛細管電泳結果, 最終篩選出7個特異性強且在棕點石斑魚、清水石斑魚和雜交子代3個群體中均有較高多態性的微衛星分子位點(表3), 對每個群體的30個個體分別進行毛細管電泳STR分型, 根據峰值得到微衛星分子標記準確的PCR產物長度, 進行后續操作。

表3 七個SSR位點的引物序列及退火溫度等相關信息Tab.3 Primer sequences and annealing temperature of seven SSRs loci

由表4可知, 除引物ab42外, 其他6對引物均可在部分群體中擴增出特異性條帶, 如引物對ad30,在棕點石斑魚可以擴增出長度為145和151 bp的特異性條帶, 在雜交子代中可以擴增出長度為154 bp的特異性條帶, 由此可以區分3個群體。

表4 棕點石斑魚、清水石斑魚和雜交子代7個SSR位點及等位基因頻率統計Tab.4 Allele frequencies of seven SSRs loci in E.fuscoguttatus, E.polyphekadion and the hybrid grouper

2.6 等位基因數、基因雜合度和多態信息含量分析

由表5可見, 在3種石斑魚的等位基因數平均值中, 最大的是棕點石斑魚, 數值為10.000, 最小的是雜交子代, 數值為8.000。雜交子代的觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)均為3種石斑魚中最大, 數值分別為0.891和0.768, 最小的均為清水石斑魚。

表5 棕點石斑魚、清水石斑魚和雜交子代的遺傳變異參數Tab.5 Parameters of genetic variation of E.fuscoguttatus, E.polyphekadion and the hybrid grouper

Botstein提出多態信息含量(PIC)大于0.5時為高度多態位點。清水石斑魚的ad19位點PIC最高,數值為0.869; 雜交子代ac34位點的PIC最低, 數值為0.441。3個群體的平均PIC為0.674, 為高度多態位點。具體觀察3種魚每個群體, 可以發現, 對于棕點石斑魚而言, 其平均PIC為0.699, 7個位點均為高度多態性位點。對于清水石斑魚而言, 平均PIC為0.606, 其中ae26、ad19、ad25和ae27為高度多態性位點。對于雜交子代而言, 平均PIC為0.717, 其中ad30、ae26、ab42、ad19、ad25和ae27為高度多態性位點。

綜上所述, 本實驗選取的7個微衛星位點ad30、ae26、ab42、ad19、ad25、ae27和ac34多態性較高, 可用于遺傳結構和遺傳多樣性分析。

3 討論

3.1 雜交子代及其親本外部形態結構數據的測定與統計分析

在不同魚類進行雜交時, 雜交性狀通常處于兩親本的中間狀況[28]。本文為了判斷雜交子代的育種前景, 從外部形態結構方面進行了分析。通過測定雜交子代和親本的外部形態可量數據, 并進行相關分析, 從而呈現三者之間的異同。

在可量性狀方面, 通過計算出全長/體長(TL/SL)、體長/體高(SL/BD) 等11個可量性狀比值, 得出雜交子代的平均雜交指數(HI) 為49.76, 接近于中心數值。其中, 雜交子代與棕點石斑魚在全長/體長(TL/SL)、體長/肛前體長(SL/LBA)上無顯著性差異, 與父本清水石斑魚在頭長/眼后頭長(HL/HLAE)上也無顯著性差異, 可以推測雜交子代在繼承雙親性狀時具有一定的選擇性。在外形框架方面測定了D1—2、D1—3等21個框架性狀參數, 在雜交子代及親本外形框架的比較中, 雜交子代頭部及軀干部位偏向棕點石斑魚, 尾部偏向于清水石斑魚。

在外部形態特征分析時, 常進行聚類分析及主成分分析對雜交子代與親本之間的差異和聯系進行探究。聚類分析是利用多個參數對不同群體進行分類, 比較對象之間的相似程度及關聯, 該方法已廣泛運用于水生生物的差異分析領域。王成輝[29]分析了4種中國紅鯉(Cyprinus carpioL.)的38個表型性狀, 發現荷包紅鯉(C.c.var.wuyuanensis)與其他3種紅鯉的形態差異十分顯著; 馬愛軍等[30]利用聚類分析研究了四個國家的大菱鲆形態特征, 探究不同群體間的外部形態結構差異大小。主成分分析將相互獨立的因子作為主成分去鑒定分析魚類的外觀形態性狀, 并得出不同主成分上載荷較大的相關參數[31]。宋文等[32]在4種魴屬魚類形態結構的主成分分析中得到的前三個主成分可以將4個群體分開。張紅艷[33]對以框架測量法對近海的3個地方的中國(Sillago sinica)群體測定了18個框架數據,并基于多變量分析法對測量數據進行了統計分析,進而將3個群體區分開。本實驗利用11個可量性狀比值和21個框架性狀參數總計32個數值對棕點石斑魚、清水石斑魚和雜交子代進行聚類分析及主成分分析。聚類分析結果顯示, 雜交子代先與母本聚合, 兩者再與父本聚合, 說明雜交子代在形態特征方面偏向于棕點石斑魚。主成分分析所得到的前4個主成分的貢獻率分別為70.161%、12.217%、5.486%和3.810%, 其中PC1和PC2的散點圖顯示出3種石斑魚構成不同類群, 說明三者有著各自的形態特點, 雜交子代也有其獨特外形特征。

3.2 雜交子代及其親本SSR分子標記篩選及遺傳特征分析

以往的短片段文庫法SSR分子標記開發, 需要先制備基因組DNA片段, 篩選較小DNA片段, 連接載體并轉化大腸桿菌, 構建基因組文庫, 整體較為復雜[34]。而本文在SSR位點的獲得上采用ddRAD-seq技術是隨著高通量測序的出現應運而生的一種技術。Baird等[35]第一次報道了ddRAD-seq技術后,此技術被廣泛應用到了多態性分子標記的開發中。由酶切產生的RAD-tag進行高通量測序, 覆蓋基因組范圍較廣且準確度高, 能夠開發大量的SNP和SSR標記, 較于傳統的SSR標記開發具有成本低、準確率高、不受參考基因組序列限制等優點[36], 因此在魚類開發SSR標記中也被大量運用。本實驗所得到的7個SSR標記, 在擴增中發現其中6對引物不僅具有較高的多態性, 還可以在部分群體中擴增出特異性條帶, 可以用于區分3個群體。

基因雜合度(H)與群體遺傳多樣性密切相關,是評估每個群體在不同位點上的遺傳變異重要指標之一, 其數值越高則說明變異越大。在本實驗中,雜交子代的觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He) 與遺傳多樣性均最高。由此可見, 雜交育種得出的新品種石斑魚在遺傳多樣性得到了豐富和提高。多態信息含量(PIC)與一個群體中雜合個體所占有的比例成正比。雜合個體越多, 遺傳多樣性便越豐富,有效群體較大, 種群結構穩定。本次實驗中雜交子代的PIC為0.717, 高于棕點石斑魚和清水石斑魚,表明其在遺傳信息的多樣性方面有著一定的提高。根據本實驗結果可以說明, 對于雙親, 棕點石斑魚和清水石斑魚的遺傳多樣性較高, 有利于種質資源的保存, 但在選育上, 雙親仍有待進一步選育后再進行雜交育種得到性狀更為優良和穩定的子代。