Sox8基因過表達誘導中華鱉ZW性腺的雄性分化

莊天依 沈佳東 樓靈媛 , 王金霓 孫 偉 肖 玲 * 葛楚天 *

(1.浙江萬里學院動物性別與發育重點研究所, 寧波 315100; 2.浙江萬里學院生物與環境學院, 寧波 3151003;3.上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306)

中華鱉(Pelodiscus sinensis)是我國重要的水產養殖品種, 相對于雌性, 雄鱉生長速度快、個體大、裙邊寬厚、具有更高的營養和經濟價值, 因此單性養殖具有明顯的優勢[1]。中華鱉具有微小性染色體(Z/W)[2], 屬于基因型性別決定機制(Genetic sex determination, GSD)。然而, 目前中華鱉性別決定和性腺分化的分子機制尚不明晰, 嚴重阻礙了中華鱉單性育種技術的研發。

位于Y染色體上的Sry(Sex determining region of Y chromosome)基因是哺乳動物雄性性別決定的主控基因[3,4], SRY蛋白能夠直接結合到Sox9(Sryrelated HMG-box 9)基因啟動子上, 通過上調Sox9的表達啟動雄性通路[5], 從而誘導具有雙向潛能的性腺發育為睪丸。Sry和Sox9均屬于Sox基因家族,Sox家族基因在睪丸發育、中樞神經系統發育、軟骨形成、神經嵴細胞發育等胚胎發育的多個方面發揮作用。除Sry和Sox9之外,Sox3、Sox5、Sox6、Sox8、Sox17和Sox30等Sox家族基因也參與脊椎動物性別分化與性腺發育[6—8]。其中Sox8在雄性性別分化和睪丸維持中都發揮重要作用[9]。

Sox8在小鼠[10]、龜[11]和魚[12]等不同演化地位的脊椎動物性腺中都呈現雌雄二態性的表達模式。我們的前期研究表明,Sox8在中華鱉性別分化關鍵時期的雄性性腺中高度表達, 且Sox8功能缺失導致ZZ胚胎性腺發生由雄到雌的性逆轉, 表明Sox8基因是中華鱉雄性性別分化的必需因子[13]。本文進一步在ZW胚胎中過表達Sox8基因, 從而驗證Sox8基因是否能夠單獨誘導中華鱉的雄性分化,為解析中華鱉性別決定和性腺分化的分子機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 中華鱉受精卵孵化

實驗中華鱉受精卵采自紹興市大畈水產養殖基地。中華鱉受精卵采集時間控制在雌鱉產卵后12h內, 置于恒溫恒濕孵化箱(FHX-400, 寧波東南儀器有限公司)中進行孵化。將采集的中華鱉受精卵動物極朝上放置于孵化盤定位孔中, 孵化溫度保持在29.5—30℃, 濕度保持在85%—90%。根據中華鱉胚胎發育圖譜[14], 鑒別并收集特定發育時期的胚胎, 用于分離性腺或性腺-中腎復合物。

1.2 LV-Sox8-OE慢病毒過表達載體的構建及鱉胚感染

根據中華鱉Sox8基因cDNA序列(XM_00613 9628.3), 構建Sox8慢病毒過表達載體(LV-Sox8-OE),生產高滴度病毒濃縮液(109U/mL, 上海吉瑪公司)。中華鱉受精卵發育至第14期時, 向中華鱉受精卵的氣室中注射7 μL慢病毒液。設置空白對照組(LVempty)。處理組及對照組注射鱉卵各800枚。收集第16和第27期性腺和性腺-中腎復合物分別用于RNA提取和組織切片染色。

1.3 RNA提取和實時熒光定量PCR

按照TRIzol試劑盒(Thermo Fisher Scientific, 美國)方法提取RNA, 利用反轉錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific, 美國)合成cDNA。實時熒光定量PCR設置3個平行組, 以Gapdh為內參基因, 用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量。數據分析利用軟件SPSS20.0的單因素方差分析(*P＜0.05; **P＜0.01;***P＜0.001)。所用引物序列如表1。

表1 熒光定量PCR分析的基因及其引物序列Tab.1 Genes and their primer sequences analyzed by Real-time quantitative PCR

1.4 石蠟切片及蘇木素-伊紅染色

性腺-中腎復合體于4%多聚甲醛內固定24h后,用50%乙醇置換固定液, 2h后置于70%乙醇中進行組織包埋或長期保存。待包埋樣品經乙醇濃度從低到高梯度脫水, 二甲苯透明, 石蠟包埋后進行石蠟切片, 厚度為6 μm。在切片烘干后, 于二甲苯中完全脫蠟, 經乙醇濃度從高到低梯度復水, 蘇木素-伊紅(碧云天, 中國)染色, 封片后于正置顯微鏡(Nikon,日本)下觀察拍照。

1.5 免疫熒光染色

切片經二甲苯脫蠟、復水后, 于檸檬酸鈉溶液(0.01 mol/L), 96℃抗原修復20min。待切片冷卻至室溫后, 滴加足量封閉液(10%驢血清, 3%羊血清蛋白, 0.3%Trion X-100)于組織上, 孵育1h。去除封閉液后滴加一抗稀釋液于組織上, 4℃過夜。用磷酸鹽Trion X-100緩沖液(PBST)洗脫10min, 重復3次。在室溫避光條件下, 滴加二抗和DAPI染液, 37℃孵育2h, PBST洗脫15min, 重復3次。用甘油∶PBS (1∶3)封片后于激光共聚焦顯微鏡進行觀察拍攝。本實驗所用一抗信息如下: 兔抗SOX9 (1∶500, Millipore, 美國)、鼠抗DMRT1 (1∶100, Millipore, 美國)、兔 抗VASA (1∶500, Abcam, 英 國)、羊 抗FOXL2(1∶200, Abcam, 英國)、鼠抗CTNNB1 (1∶500, Sigma,美國)、鼠抗AROM (1∶50, Abcam, 英國)。本實驗所用二抗信息如下: 驢抗兔 IgG 594 (1∶500, Invitrogen, 美國)、驢抗羊 IgG 488 (1∶500, Invitrogen, 美國)、驢 抗 鼠 IgG 488 (1∶500, Invitrogen, 美 國)、DAPI (1∶10, Sigma, 美國)。

2 結果

2.1 Sox8過表達對性腺組織形態的影響

在中華鱉胚胎發育至第14期時, 向受精卵中注入LV-Sox8-OE慢病毒載體, 從而開展Sox8基因的功能獲得研究。在第16期時, 通過實時熒光定量PCR檢測經LV-Sox8-OE處理后的ZW性腺中Sox8基因的表達變化, 結果顯示注射慢病毒后Sox8基因表達出現了上調(圖1A), 證實攜帶Sox8過表達載體的慢病毒已進入中華鱉胚胎性腺并導致Sox8在ZW性腺中的異位表達。發育至第27期時, 對照組ZZ性腺外觀短粗, 形狀類似圓柱體(圖1E)。HE染色結果顯示, ZZ性腺橫截面呈現橢圓形, 皮質區退化, 髓質區高度發育, 出現性索(圖1I)。而對照組第27期ZW性腺外觀細長(圖1B), 橫截面呈現扇形, 皮質區高度發育, 髓質區退化(圖1F)。經Sox8過表達后,ZW胚胎性腺外觀與對照組ZW并無明顯變化(圖1C和1D)。但組織學觀察發現部分處理組ZW胚胎性腺皮質區變薄, 同時髓質區發育并出現睪丸特有的性索結構, 整體呈現卵睪丸的特征(圖1H); 也有部分處理組ZW性腺髓質區未出現性索, 依然發育為卵巢(圖1G)。

圖1 Sox8過表達后胚胎性腺組織形態學變化Fig.1 The morphological changes of embryonic gonads after Sox8 overexpression

2.2 Sox8過表達對生殖細胞分布的影響

為了研究Sox8過表達對生殖細胞發育的影響,本研究對生殖細胞標記蛋白VASA進行了免疫熒光染色, 結果發現對照組ZW胚胎性腺中的生殖細胞大量分布在皮質區(圖2A和2E), 而ZZ胚胎性腺中的生殖細胞分布在髓質區的性索上(圖2D和2H)。在Sox8過表達后, 部分ZW胚胎性腺中生殖細胞同時在皮質區與髓質區出現, 呈現出雌雄同體的分布特征(圖2C和2G); 而其余ZW性腺中生殖細胞的分布依然只出現在皮質區, 與對照組ZW胚胎性腺一致(圖2B和2F)。

圖2 Sox8過表達后性腺中生殖細胞分布變化Fig.2 The distribution changes of germ cells in gonads after Sox8 overexpression

2.3 Sox8過表達對雌雄特異性基因mRNA和蛋白表達的影響

通過qRT-PCR檢測第27期雌雄性特異性基因的mRNA表達水平的變化。結果顯示,Sox8過表達后的ZW胚胎性腺中雌性通路基因Foxl2(圖3A)、Cyp19a1(圖3B)表達顯著下調, 而雄性特異性基因Amh(圖3C)、Dmrt1(圖3D)的表達量顯著增加, 在分子水平上證實了Sox8過表達后的ZW胚胎出現了由雌性向雄性變化。

圖3 Sox8過表達后性別特異性基因的表達變化Fig.3 The expression changes of sex-specific genes after Sox8 overexpression

為了進一步驗證Sox8基因過表達后對性別分化的影響, 本文進一步分析了雄性特異性蛋白SOX9、DMRT1和雌性特異性蛋白FOXL2、AROM的表達變化。免疫熒光結果顯示, 在對照組ZZ性腺中,SOX9和DMRT1蛋白大量表達(圖4D、4L、4L’、4P、4X和4X’), 幾乎充滿整個性腺髓質區, 未見AROM和FOXL2蛋白表達(圖4H和4T)。在對照組ZW胚胎性腺中, AROM和FOXL2大量表達(圖4E、4I、4I’、4Q、4U和4U’), 未見SOX9、DMRT1蛋白表達(圖4A和4M)。Sox8過表達的ZW胚胎性腺部分與對照組ZW一致, 僅表達雌性特異性蛋白FOXL2和AROM (圖4B、4F、4J、4J’、4N、4R、4V和4V’); 而另一部分在FOXL2、AROM蛋白表達的同時, 髓質區也出現SOX9和DMRT1蛋白的表達(圖4C、4G、4K、4K’、4O、4S、4W和4W’)。綜上所述,Sox8過表達后部分ZW性腺確實出現了不完全的性逆轉現象。

圖4 Sox8過表達后性別特異性蛋白的表達變化Fig.4 The expression changes of sex-specific protein after Sox8 overexpression

數據統計顯示, 對照組ZW胚胎性腺100%朝著卵巢方向發育(52/52), 對照組ZZ胚胎性腺100%朝著睪丸方向發育(55/55)。Sox8過表達的ZW胚胎性腺有50% (14/28)皮質區未退化完全, 髓質區發育出現性索結構, 雌性特異性蛋白Foxl2、Cyp19a1和雄性特異性蛋白Sox9、Dmrt1同時表達, 呈現卵睪丸狀態(表2), 往雄性方向發育; 而另外50% (14/28)依然發育為卵巢。

表2 Sox8過表達后ZW胚胎雌雄比例Tab.2 Male to female ratio of ZW embryos after Sox8 overexpression

2.4 Sox8過表達對1月齡中華鱉性別的影響

本研究觀察和分析了4只經Sox8過表達處理,基因型為ZW的1月齡中華鱉的性腺結構及基因表達。結果發現其中一個個體的性腺外觀粗短(圖5C),HE染色結果顯示其具有明顯的雄性性腺特征: 皮質區退化, 髓質區出現明顯的性索(圖5G)。不同于對照組ZW性腺出現了大量卵泡(圖5E), VASA蛋白免疫熒光染色結果顯示其生殖細胞分布在性索(圖5K和5K’)。同時免疫熒光檢測到大量SOX9和DMRT1信號, 未檢測到FOXL2、AROM信號(圖5O、5O’、5S、5S’)。以上結果均與對照組ZZ一致(圖5D、5H、5L、5L’、5O、5O’、5S和5S’), 說明其出現了完全的性逆轉現象。其余3個處理組ZW個體中華鱉性腺外觀(圖5B), HE染色(圖5F)和VASA蛋白染色(圖5J和5J’)都與對照組ZW(圖5A、5E、5I、5I’、5M、5M’、5Q和5Q’)相似, 免疫熒光檢測到FOXL2、AROM熒 光 信 號, 未 檢 測 到SOX9和DMRT1熒光信號(圖5N、5N’、5R和5R’), 未發生性逆轉。

圖5 Sox8過表達后性腺組織形態學變化及性別特異性蛋白的表達變化Fig.5 The morphological changes of embryonic gonads and the expression changes of sex-specific protein after Sox8 overexpression

3 討論

前期研究發現Sox8在中華鱉性別決定和分化關鍵時期的性腺組織中表現出雄性特異性的高表達, 且Sox8敲低導致ZZ性腺發育為卵巢。本實驗進一步通過LV-Sox8-OE慢病毒過表達載體誘導Sox8基因在性腺分化前的ZW性腺中異位表達。結果顯示Sox8過表達后的ZW性腺在包括性腺形態、生殖細胞分布模式及性別分化相關基因Dmrt1、Sox9、Amh、Foxl2和Cyp19a1表達等方面表現出雄性化的特征, 表明Sox8的過表達可以誘導ZW胚胎性腺的往雄性方向分化, 提示Sox8在爬行動物睪丸分化過程中的重要作用。

小鼠Sox8敲除后XY性腺中性索發育正常, 性腺分化為睪丸, 且Sox8突變的睪丸最初是可育的,只在后期表現出進行性曲細精管衰竭和不育[15,16]。哺乳動物Sox8顯示出與Sox9的高度同源性, 在Sox9功能部分缺失的情況下, 可以補償Sox9的功能:組織特異性敲除Sox9的XY小鼠仍然發育出性索,然而在此基礎上敲除Sox8則導致性索完全消失, 性腺無法發育為睪丸[16]; 在敲除雌性調控因子Rspo1的小鼠中, 單獨缺失Sox9或者Sox8都會導致XX性腺發育為卵睪丸, XY性腺發育為睪丸(Sox8缺失)或發育不良睪丸(Sox9缺失), 而三突變體(Rspo1、Sox8和Sox9同時缺失) XX和XY小鼠的性腺都發育為卵巢[17]。以上結果表明, 哺乳動物Sox8和Sox9在性別分化過程中存在功能冗余,Sox8并不是哺乳動物睪丸分化的必需基因, 但通過增強或補充Sox9的功能參與性別分化。同樣的, Portnoi等[18]發現Sox8的突變并導致人類的性別逆轉, 但能夠使人類XY個體表現出性別發育障礙。而我們的實驗結果表明Sox8功能缺失或獲得均可導致中華鱉性逆轉現象的發生, 提示Sox8在爬行動物性別分化中的作用比哺乳動物中更為重要。

此外, 本研究發現Sox8的過表達能引起睪丸標記因子Dmrt1和Amh的上調和卵巢調節因子Cyp19a1和Foxl2的下調。Dmrt1和Amh是調控脊椎動物睪丸分化的重要因子, 已被證實是中華鱉雄性性別決定和分化中的必需基因[19,20]。Cyp19a1編碼的芳香化酶是脊椎動物雌激素合成的限速酶, 通過調控雌激素的合成參與性別分化。而Foxl2是脊椎動物卵巢發育的關鍵蛋白, 可正調控Cyp19a1的表達[21],Foxl2功能缺失和獲得都能誘導中華鱉發生性逆轉[22]。在Sox8敲低之后, 也觀察到Dmrt1和Amh表達量的降低及Cyp19a1和Foxl2的上調表達[13], 提示Sox8與這些性別相關基因存在密切的調控關系, 可能是Sox8參與雄性分化的原因。Sox8屬于SoxE轉錄因子亞家族, 該亞家族的蛋白(SOX8、SOX9和SOX10)具有類似的反式激活機制: 通過蛋白質中間的反式激活結構域(TAM)與C端的反式激活結構域(TAC)協同作用[23]激活靶基因的轉錄。SOX8可以特異性結合Amh啟動子序列, 也可以協同SF1激活Amh轉錄[24]。此外, SOX8也可和SF1協同激活在睪丸細胞通訊和精子發生中發揮重要作用的連接蛋白Cx43的表達[25]。牙鲆SOX8蛋白的兩個亞型SOX8A和SOX8B可分別直接結合到3β-hsd和Cyp19a1基因啟動子上, 通過調控性類固醇激素合成酶的表達來控制性類固醇激素的合成, 從而參與硬骨魚類性別分化[12]。本實驗檢測到Sox8過表達后Dmrt1、Amh、Cyp19a1和Foxl2的表達變化, 因此我們推測中華鱉Sox8可能也是通過調控這些雌雄通路基因的表達從而參與雄性分化。

綜上所述, 本研究通過Sox8基因功能獲得分析發現, 50%的ZW性腺髓質區在Sox8過表達后發育出含有生殖細胞的性索結構, 同時雌性特異性基因Foxl2和Cyp19a1表達量顯著降低, 而調控睪丸發育的Dmrt1、Sox9和Amh基因表達上調, 證實Sox8過表達誘導中華鱉ZW性腺向雄性方面分化, 從而揭示了Sox8在中華鱉雄性分化過程中的重要作用, 為解析中華鱉性別決定的分子機制奠定了基礎。