MC1R對白癜風黑色素細胞增殖和凋亡的影響研究

袁相鳳 羅增香 李建娜 孫麗娜

濰坊醫學院附屬醫院皮膚科，山東濰坊 261013

白癜風是一種常見的色素脫失性皮膚病，發病率占全球人口的0.5%～2.0%[1]。該疾病的特征是黑色素細胞丟失，導致皮膚出現典型的非杯狀白色斑點。近年來，研究者對白癜風發病機制的認識取得了較大進展，目前已明確將白癜風歸類為自身免疫性疾病。白癜風不僅影響患者容貌外觀，而且會給患者心理上造成沉重的壓力，在日常生活導致諸多不便[2]。黑素皮質受體（melanocortin receptors，MCRs）參與了包括色素沉積、攝食、能量代謝、抗感染等各環節的調節。目前已經發現了5 個MCRs家族成員：MC1R ～MC5R，其中黑素皮質受體1（melanocortin 1 receptor，MC1R）蛋白參與黑色素的生物學反應，影響黑色素細胞的產生。MC1R 活性降低會導致頭發變紅、膚色變淺。另有研究指出，MC1R 活性降低與雀斑、皮膚癌的發生也有關[3-5]。研究發現在白癜風患者皮膚組織中MC1R 基因表達下調，提示MC1R 可能是與白癜風相關的基因[6]。目前MC1R 在白癜風黑色素細胞中調控作用的相關研究報道罕見。因此，本研究探討MCIR 在白癜風黑色素細胞中的作用和機制，旨在闡明白癜風發生機制，為臨床診治靶點選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常人表皮黑色素細胞系PIG1 和白癜風黑色素細胞系PIG3V 購自上海中科院。Trizol 試劑盒和細胞轉染試劑盒（美國Invitrogen 公司），Western Blot 一抗（美國ABCam 公司），Western Blot 酶標二抗和活性氧（reactive oxygen species，ROS）試劑盒（南京建成生物研究所），真核表達載體和siRNA（上海吉瑪公司），MTT 試劑盒（德國Thermo 公司），凋亡試劑盒（美國BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 MC1R 真核表達載體和siRNA 轉染細胞 PIG1細胞用于構建MC1R 敲減細胞模型，隨機分為MC1R siRNA 組、siRNA 陰性對照（negative control，NC）組和空白對照（PIG1）組；PIG3V 細胞用于構建MC1R過表達細胞模型，隨機分為過表達（overexpression，oe）-MC1R 組、MC1R NC 組和空白對照（PIG3V）組。將5 μl MC1R siRNA/siRNA NC、pcDNA-MC1R/pcDNA NC 與245 μl Opti-MEMTM減血清培養基混勻；將5 μl 轉染液和245 μl Opti-MEM 混勻；再將以上兩種混合液混合，室溫放置30 min；緩慢將上述混合液逐滴滴加到相應組別的6 孔板孔中，混勻，37℃培養6 h，更換成完全培養液繼續培養24 h。

1.2.2 Western Blot RIPA 蛋白裂解液提取細胞總蛋白，定量檢測蛋白濃度后，電泳分離，轉膜后封閉，含5%脫脂奶粉的1×TBST 緩沖液按1 ∶100稀釋一抗，4℃過夜。用1×TBST 緩沖液洗膜后，加入二抗，室溫下孵育60 min，用1×TBST 緩沖液洗膜3 次。ECL 試劑顯色，并成像。

1.2.3 MTT 檢測 將各組細胞消化后計數，調整濃度為105/ml，按100 μl/孔加入96 孔板，每組設3 個復孔，共接種6 塊96 孔板，放回培養箱繼續培養。在接種后的第0、6、12、24、48、72 小時，分別取出1 塊96孔板，向各孔加入10 μl MTT 檢測試劑，將96 孔板放回培養箱培養4 h，用酶標儀檢測OD450，以時間為橫坐標，繪制反映細胞生長情況的增殖曲線。

1.2.4 流式細胞術檢測周期和凋亡 將各組細胞消化后計數，調整為105/ml 的細胞懸液。向流式細胞管中先加入20 μl 膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰基熒光素（FITC），再加入100 μl 各組細胞，混勻后室溫遮光孵育15 min，再各加入20 μl 碘化丙啶（propidine iodide，PI），混勻后室溫避光孵育10 min。設置僅加20 μl Annexin V-FITC 或僅加20 μl PI 的兩支單陽管和不加任何試劑的陰性對照管。各管加入1 ml PBS 緩沖液，混勻，上機檢測。

1.2.5 活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測 將各組細胞用胰蛋白酶消化后計數，鋪6 孔板培養過夜。向6 孔板各孔加入1 ml 不完全DMEM 培養液按1 ∶1000 稀釋的2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）探針，繼續培養60 min。將細胞置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統計學處理

使用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q 檢驗，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 調控MC1R表達對黑色素細胞增殖的影響

MC1R siRNA 組細胞MC1R mRNA 和蛋白表達降低（P＜ 0.05），顯著抑制細胞增殖（P＜ 0.05）；oe-MC1R 組細胞MC1R mRNA 和蛋白表達增高（P＜ 0.05），促進細胞增殖（P＜ 0.05）。見圖1。

圖1 調控MC1R 表達對黑色素細胞增殖的影響

2.2 調控MC1R表達對黑色素細胞周期和凋亡的影響

MC1R siRNA 組下調MC1R 表達后導致黑色素細胞凋亡率增加（P＜ 0.05），G2/M 期細胞所占比例升高（P＜ 0.05）；oe-MC1R 組細胞過表達MC1R 后抑制黑色素細胞凋亡，G2/M 期細胞所占比例降低（P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 調控MC1R 表達對黑色素細胞周期和凋亡的影響

2.3 調控MC1R表達對黑色素細胞ROS產生的影響

MC1R siRNA 組細胞下調MC1R 表達后ROS水平顯著增加（P＜ 0.05），oe-MC1R 組細胞過表達MC1R 后ROS 水平顯著降低（P＜ 0.05）。見圖3。

圖3 調控MC1R 表達對黑色素細胞ROS 產生的影響

2.4 調控MC1R表達對黑色素細胞促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase phosphatases，MAPK）通路、凋亡和細胞周期相關蛋白表達影響

MC1R siRNA 組細胞下調MC1R 表達后Bcl-2、Cyclin D1 蛋白水平降低（P＜ 0.05），p-p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、Caspase 3、Bax、p53 和p21 蛋白水平升高（P＜ 0.05）。oe-MC1R組細胞過表達MC1R 后Bcl-2、Cyclin D1 蛋白水平升高（P＜ 0.05），p-p38 MAPK、JNK、Caspase 3、Bax、p53 和p21 蛋白水平降低（P＜ 0.05）。見圖4。

圖4 調控MC1R 表達對黑色素細胞MAPK 通路、凋亡和細胞周期相關蛋白表達影響

3 討論

MC1R 是黑色素生成和色素沉著的調節劑之一。研究表明，白癜風患者非病變皮膚中MC1R 的表達減少，而上調MC1R 表達可能通過負反饋機制恢復病變皮膚中的正常色素沉著[7-8]。但是否可以通過調控MC1R 表達從而改變黑色素細胞生物學行為尚未見報道。本研究通過人為干預細胞中的MC1R 表達水平，使人正常黑色素細胞低表達MC1R，而白癜風黑色素細胞高表達MC1R，從而進一步觀察各組細胞生物行為變化，并對相關機制進行初步研究。

本研究結果顯示，MC1R siRNA 組MC1R 表達減少后，黑色素細胞增殖速度明顯減慢，而轉入過表達載體的oe-MC1R 組，MC1R 表達顯著增加可以加速白癜風黑色素細胞的增殖速度，該結果提示過表達MC1R 對黑色素細胞的增殖有促進作用。既往研究提示在白癜風病變過程中，由于黑色素細胞數量減少，導致患者病情加重，而在其病變組織中MC1R 表達水平明顯降低，MC1R 表達降低可抑制黑色素細胞增殖，病變組織不能及時補充黑色素細胞，因此無法代償患者的病變損傷[9]。本研究表明可以通過上調MC1R 的表達，促進黑色素細胞增殖，有利于白癜風病變組織補充黑色素細胞，從而輔助白癜風治療。

白癜風病變組織中黑色素細胞數量減少除了和增殖減慢無法代償病損之外，同時也和黑色素細胞破壞增多密切相關，研究證實G2/M 期阻滯能誘導黑色素細胞凋亡，進而導致黑色素細胞破壞增多，加重了黑色素細胞減少[10-11]。本研究發現，在黑色素細胞中敲減MC1R 的表達，可以導致黑色素細胞凋亡率增高，G2/M 期細胞所占比例升高；而在白癜風黑色素細胞中上調MC1R 表達，可降低白癜風黑色素細胞的凋亡率，G2/M 期所占比例降低，結果證實MC1R 表達下調能引起黑色素細胞的G2/M期阻滯，促進黑色素細胞凋亡，這可能是導致白癜風病情進展的重要因素之一。

既往研究表明[12-16]，病理情況下，ROS 過度累積可以直接或間接損傷DNA、蛋白質、脂質等生物大分子，誘導細胞啟動凋亡程序，引起皮膚黑色素細胞破壞和丟失，是白癜風發病的重要機制之一。本研究顯示，在黑色素細胞中敲減MC1R 的表達，導致ROS 水平升高；反之，在白癜風黑色素細胞上調MC1R 表達，可引起ROS 水平降低，該結果提示高表達MC1R 能減輕白癜風黑色素細胞中ROS 損傷發生，促進黑色素細胞中的氧化-抗氧化系統平衡，保護細胞不受氧化應激損傷。

MAPK 通路是真核細胞中一個經典的信號通路，可以參與細胞凋亡和細胞周期過程。MAPK 通路中p-p38 MAPK 能促進p53 磷酸化，磷酸化抗凋亡蛋白Bcl-2 家族相關成員，促進線粒體細胞色素釋放，激活Caspase 級聯反應，激活凋亡蛋白Caspase 3，從而誘導細胞凋亡。細胞受損時，p53 能激活p21 轉錄，使細胞周期停滯在G2 期，對于無法完成修復的細胞，將誘導啟動凋亡程序，細胞周期蛋白Cyclin D1 能促進細胞周期進展[17-20]。本研究進一步發現，敲減MC1R 在正常人黑色素細胞的表達，Bcl-2、Cyclin D1 蛋白水平降低，p-p38 MAPK、JNK、Caspase 3、Bax、p53 和p21 蛋白水平升高。而上調MC1R 在癜風黑色素細胞表達，則逆轉上述蛋白表達水平。

本研究結果證實了高表達MC1R 能夠調控MAPK 途徑以及抑制ROS 產生，進而調控細胞凋亡蛋白家族和細胞周期相關因子，從而抑制黑色素細胞凋亡，上調G2/M 期，促進細胞增殖。本研究在既往研究基礎上進一步深入研究，探討了MC1R在黑色素細胞增殖和凋亡中的作用和相關調控機制，并證實了MC1R 可以作為白癜風黑色素細胞中的關鍵調控因子。但本研究存在一定局限性，目前僅停留在細胞水平上，未在動物水平進一步證實，在下一步研究中擬建立白癜風動物模型，分析調控MC1R 表達對白癜風的治療作用和相關機制，從而為臨床白癜風新靶點確定提供參考。

綜上所述，MC1R 可能通過調控MAPK 途徑和ROS 生成，調控細胞周期和凋亡相關因子，引起黑色素細胞生物學行為改變，參與白癜風黑色素細胞的病變過程。