基于麝香酮對大鼠心肌細胞凋亡的影響探討辛溫通絡法治療糖尿病心肌病的作用機制

魏 芹, 趙曉鵬, 于華林, 燕彩霞

(山東省濟南市中西醫結合醫院, 1. 內分泌, 2. 骨二科, 3. 肝病內科, 4. 腫瘤科, 山東 濟南, 271100)

糖尿病心肌病(DCM)是世界范圍內心力衰竭的重要原因[1], 其發病機制涉及心臟炎癥、氧化應激、心肌纖維化和心肌細胞凋亡等方面[2]。全國老中醫藥專家陳樹泉認為, DCM的基本病機是久病入絡,辛溫通絡為其基礎治法。心肌細胞凋亡增加是DCM發生的直接原因之一[3],且越來越多的證據表明糖尿病患者心肌細胞凋亡水平升高,引起心肌細胞減少和心功能不全[4]。因此,抑制心肌細胞凋亡的藥物或可作為DCM的潛在治療藥物。麝香酮是人造麝香的主要活性成分,作為辛溫通絡治療中的代表性藥物,其具有抗腦缺血、抗炎、抗氧化等藥理作用[5]。相關研究[6]顯示,麝香酮可通過抑制氧化應激和細胞凋亡來緩解大鼠心肌缺血再灌注損傷,表明麝香酮具有心肌保護作用。另有研究[7]顯示,抑制脂肪酸合成酶(Fas)/脂肪酸合成酶配體(FasL)通路可緩解2型糖尿病大鼠心肌損傷。但麝香酮能否通過調控Fas/FasL信號通路而影響DCM大鼠心肌細胞凋亡目前尚不明確。本研究探討麝香酮對DCM大鼠心肌細胞凋亡的影響及其作用機制,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠(考慮到雌激素對DCM具有保護作用[8], 為了更好地體現藥物作用,故僅選用雄性大鼠)72只, 6周齡,體質量210～220 g, 購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司桐鄉分公司,生產許可證號為SCXK(浙)2020-0002。本研究得到濟南市中西醫結合醫院動物倫理委員會審核批準,且所有動物實驗遵循3R原則。

1.2 主要試劑

麝香酮購自滁州仕諾達生物科技有限公司; 鏈脲佐菌素購自上海西唐生物科技有限公司; 二甲雙胍購自中美上海施貴寶制藥有限公司; 重組人FasL蛋白(rh-FasL)(Fas/FasL通路激活劑)購自湖北艾普蒂生物工程有限公司; Masson染色試劑盒購自無錫云萃生物科技有限公司; 大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司; 兔源一抗裂解的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、Fas、FasL、GAPDH及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。

1.3 DCM大鼠模型構建

采用高脂飼料喂養聯合腹腔注射鏈脲佐菌素方式構建DCM大鼠模型[9], 即用高脂飼料喂養大鼠4周后,禁食12 h, 再一次性腹腔注射30 mg/kg鏈脲佐菌素, 3 d后若大鼠空腹血糖高于16.7 mmol/L, 表明DCM大鼠模型構建成功。

1.4 動物分組及處理

按照隨機數字表法將SD大鼠隨機分為空白組、DCM組、麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組、二甲雙胍組、麝香酮高劑量+rh-FasL組,每組12只。除空白組外,其他組均構建DCM大鼠模型,建模成功后進行給藥處理, 1次/d給藥,持續6周。麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組[10]、二甲雙胍組[11]大鼠分別灌胃0.68 mg/kg麝香酮、2.72 mg/kg麝香酮、140 mg/kg二甲雙胍,且均腹腔注射等體積生理鹽水; 麝香酮高劑量+rh-FasL組[12]大鼠灌胃2.72 mg/kg麝香酮,且腹腔注射0.017 mg/kg rh-FasL; 空白組、DCM組大鼠均灌胃等體積生理鹽水,且腹腔注射等體積生理鹽水。

1.5 空腹血糖及左室射血分數(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)檢測

末次處理結束后,取全部大鼠,禁食、禁水12 h后,先使用動物血糖儀檢測大鼠空腹血糖,然后使用彩色多普勒超聲顯像儀檢測LVEF、LVFS。

1.6 標本收集方法

2%戊巴比妥鈉麻醉后處死大鼠,收集大鼠心肌組織,分為2份(每份包含6只大鼠的心肌組織),一份固定于4%多聚甲醛中用于蘇木素-伊紅(HE)染色、Masson染色和TUNEL染色,另一份凍存于-80 ℃環境用于氧化應激指標檢測和蛋白質印跡法(Western blot)實驗。

1.7 HE染色法、Masson染色法檢測大鼠心肌組織病理損傷、纖維化程度

將固定于4%多聚甲醛中的心肌組織室溫下脫水,包埋在石蠟中,切成5 μm厚切片。對切片進行HE染色或Masson染色,于光學顯微鏡下觀察心肌組織病理變化,通過ImageJ軟件計算心肌膠原面積,心肌膠原面積分數(%)=心肌膠原面積/整個視野面積×100%。

1.8 大鼠心肌組織SOD活性及MDA含量檢測

嚴格按照試劑盒說明書檢測大鼠心肌組織中SOD活性及MDA含量。

1.9 TUNEL染色法檢測心肌細胞凋亡

取1.7中的切片利用蛋白酶K試劑透化15 min后,加入TdT反應緩沖液37 ℃孵育10 min, 再與TUNEL試劑共同避光孵育30 min, 最后加入DAPI染料對細胞核進行染色,使用熒光顯微鏡觀察細胞染色情況。細胞凋亡率(%)=TUNEL陽性細胞數/DAPI陽性細胞數×100%。

1.10 Western blot檢測大鼠心肌組織中Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表達

將心肌組織在含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中勻漿,并將勻漿在4 ℃條件下以14 000 g離心20 min。蛋白質濃度采用二喹啉甲酸(BCA)法測量。將等量蛋白質經電泳、轉膜后,用5%脫脂奶粉封閉非特異性結合位點, 4 ℃條件下與一抗Cleaved-caspase-3(1∶3 000)、Bax (1∶4 000)、Fas(1: 3 000)、FasL(1∶3 000)、GAPDH(1∶4 000)孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌后,將膜與二抗(1∶4 000)孵育2 h。使用電化學發光(ECL)試劑觀察蛋白印跡,應用ImageJ軟件對蛋白圖像進行定量分析。

1.11 統計學分析

2 結 果

2.1 各組大鼠空腹血糖及LVEF、LVFS比較

與空白組比較, DCM組大鼠空腹血糖升高, LVEF、LVFS降低,差異有統計學意義(P<0.05); 與DCM組比較,麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組、二甲雙胍組大鼠空腹血糖降低, LVEF、LVFS升高,差異有統計學意義(P<0.05); 與麝香酮低劑量組比較,麝香酮高劑量組、二甲雙胍組大鼠空腹血糖降低, LVEF、LVFS升高,差異有統計學意義(P<0.05); 與麝香酮高劑量組比較,麝香酮高劑量+rh-FasL組大鼠空腹血糖升高, LVEF、LVFS降低,差異有統計學意義(P<0.05), 見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖及心臟功能指標LVEF、LVFS比較

2.2 各組大鼠心肌組織病理損傷及心肌纖維化

HE染色結果顯示,空白組大鼠心肌組織結構正常; DCM組大鼠心肌組織中心肌細胞排列紊亂,有大量炎性細胞浸潤; 與DCM組比較,麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組、二甲雙胍組大鼠心肌組織病理損傷減輕; 與麝香酮高劑量組比較,麝香酮高劑量+rh-FasL組大鼠心肌組織病理損傷加重,見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色和Masson染色光學顯微鏡圖像(放大200倍)

Masson染色結果顯示, DCM組大鼠心肌膠原面積分數高于空白組,麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組、二甲雙胍組大鼠心肌膠原面積分數低于DCM組,麝香酮高劑量組、二甲雙胍組大鼠心肌膠原面積分數低于麝香酮低劑量組,麝香酮高劑量+rh-FasL組大鼠心肌膠原面積分數高于麝香酮高劑量組,差異均有統計學意義(P<0.05),見圖1、表2。

表2 各組大鼠心肌膠原面積分數比較 %

2.3 各組大鼠心肌組織中SOD活性和MDA含量

與空白組比較, DCM組大鼠心肌組織中SOD活性降低, MDA含量升高,差異有統計學意義(P<0.05); 與DCM組比較,麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組、二甲雙胍組SOD活性升高, MDA含量降低,差異有統計學意義(P<0.05); 與麝香酮低劑量組比較,麝香酮高劑量組、二甲雙胍組SOD活性升高, MDA含量降低,差異有統計學意義(P<0.05); 與麝香酮高劑量組比較,麝香酮高劑量+rh-FasL組SOD活性降低, MDA含量升高,差異有統計學意義(P<0.05), 見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中SOD活性和MDA含量比較

2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較

DCM組大鼠心肌細胞凋亡率高于空白組,麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組、二甲雙胍組大鼠心肌細胞凋亡率低于DCM組,麝香酮高劑量組、二甲雙胍組大鼠心肌細胞凋亡率低于麝香酮低劑量組,麝香酮高劑量+rh-FasL組大鼠心肌細胞凋亡率高于麝香酮高劑量組,差異均有統計學意義(P<0.05),見圖2、表4。

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡的TUNEL染色結果(放大200倍)

表4 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較 %

2.5 各組大鼠心肌組織中Cleaved-caspase-3、Bax蛋白及Fas/FasL通路相關蛋白表達情況比較

表5 各組大鼠心肌組織中Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表達比較

與空白組比較, DCM組大鼠心肌組織中Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表達升高,差異有統計學意義(P<0.05); 與DCM組比較,麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組、二甲雙胍組Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表達降低,差異有統計學意義(P<0.05); 與麝香酮低劑量組比較,麝香酮高劑量組、二甲雙胍組Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表達降低,差異有統計學意義(P<0.05); 與麝香酮高劑量組比較,麝香酮高劑量+rh-FasL組Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表達升高,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖3、表5。

圖3 各組大鼠心肌組織中相關蛋白表達的Western blot檢測結果

3 討 論

DCM是心力衰竭和猝死的危險因素[13], 其發病率隨著糖尿病患者例數的增加而升高。氧化應激是DCM發病機制中的重要病理生理過程,包含SOD在內的內源性抗氧化劑系統受到高血糖的不利影響,引發進行性氧化應激損傷,改變線粒體膜通透性,導致促凋亡因子釋放,進而引起心肌細胞凋亡[14-15]。MDA是由多不飽和脂肪酸氧化產生的不飽和醛,可加重氧化應激反應; SOD是氧化應激的標志物,可發揮抗氧化的作用[16]。本研究通過高脂飼料喂養聯合腹腔注射鏈脲佐菌素方式構建DCM大鼠模型后發現,與空白組比較, DCM組大鼠空腹血糖升高, LVEF、LVFS降低,心肌組織病理損傷及心肌纖維化嚴重,提示DCM大鼠模型構建成功。本研究還發現,與空白組比較,DCM組大鼠心肌組織中SOD活性降低,MDA含量、心肌細胞凋亡率及凋亡相關蛋白Cleaved-caspase-3、Bax表達升高,表明DCM大鼠存在氧化應激及心肌細胞凋亡。

全國老中醫藥專家陳樹泉認為, DCM的基本病機是久病入絡,應以“辛溫通絡”為治療大法。麝香味辛溫,《雷公炮制藥性解》提到“麝香為諸香之最,其氣透入骨髓,故于經絡無所不入”,《得配本草》提到“麝香,通關竅,開經絡,透肌骨,安心神”。以麝香為君藥的麝香保心丸已被證實對DCM患者心臟功能具有改善作用,還能抑制炎性反應,減輕臨床癥狀。麝香酮是中藥麝香的主要成分,具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的特性[17]。據報道[18-19], 麝香酮通過抗纖維化、抗凋亡來增強心肌梗死小鼠的運動耐力,且可抑制糖尿病周圍神經病變過程中雪旺細胞的凋亡。本研究結果顯示,麝香酮可抑制DCM大鼠氧化應激及心肌細胞凋亡,且麝香酮劑量越高,抑制作用越明顯。二甲雙胍是臨床常用的DCM治療藥物[20], 本研究以該藥物作為陽性藥物,發現高劑量麝香酮與二甲雙胍對DCM大鼠氧化應激及心肌細胞凋亡的抑制作用無顯著差異,提示麝香酮能抑制DCM大鼠氧化應激及心肌細胞凋亡,可能成為治療DCM的潛在有效藥物。

作為一種經典的細胞凋亡調節劑, Fas與FasL結合后,可導致具有死亡結構域的Fas相關蛋白募集到致死信號傳導復合物中而引起細胞凋亡[21]。據報道,抑制Fas/FasL通路可減輕大鼠心肌缺血再灌注過程中氧化應激反應造成的心肌損傷[22-23], 激活Fas/FasL通路則可誘導阿霉素處理的大鼠心肌細胞凋亡[24-25]。本研究結果顯示,與空白組大鼠比較, DCM大鼠心肌組織中Fas、FasL蛋白表達升高,而經麝香酮干預后, DCM大鼠心肌組織中Fas、FasL蛋白表達降低,故推測麝香酮可能通過抑制Fas/FasL通路而抑制DCM大鼠氧化應激及心肌細胞凋亡。為了驗證該推測,本研究在高劑量麝香酮作用的基礎上加用Fas/FasL通路激活劑rh-FasL干預DCM大鼠,結果顯示, rh-FasL減弱了高劑量麝香酮對DCM大鼠氧化應激及心肌細胞凋亡的抑制作用,證實麝香酮可能通過抑制Fas/FasL通路而抑制DCM大鼠氧化應激及心肌細胞凋亡。

綜上所述,麝香酮可能通過抑制Fas/FasL通路抑制DCM大鼠氧化應激及心肌細胞凋亡。但麝香酮對DCM大鼠氧化應激及心肌細胞凋亡的抑制作用可能還涉及其他通路,未來還需進一步深入研究加以探討。