基于智能手機傳感平臺的納米酶比色法用于葡萄糖的快速檢測

關鍵詞納米酶；智能手機；比色分析；數字圖片比色法；葡萄糖

葡萄糖（Glucose，Glu）是人類生命活動所需能量的重要來源，是不可缺少的營養物質。體液中葡萄糖的含量異常容易引起多種急慢性疾病。例如，體液中葡萄糖的含量偏低容易引起心慌、乏力和休克昏迷等癥狀；葡萄糖的含量偏高易導致肥胖、齲齒、糖尿病和酮癥酸中毒等癥狀[1-2]。血糖濃度檢測可以客觀地反映血糖含量，為監測高危人群血糖異常情況、篩查血糖相關疾病以及評價治療效果等提供依據[3-4]。臨床上以空腹血糖水平作為評估標準，血糖的檢測分析常通過比色法進行，依賴于全自動分析儀和酶標儀等大型儀器，根據檢測體系的顏色變化進行樣品測定[5]。盡管這些儀器具有較高的準確性，但存在不易攜帶、成本高、需要專業人員進行操作等缺點，難以在基層醫療部門以及普通家庭中推廣使用[6]。為了滿足人們對日益增長的身體健康監測的需求，亟需開發易普及、靈敏、成本低和智能化的便攜式檢測儀器以滿足血糖等生化指標的現場快速檢測的需求。

即時檢測（Point-of-caretesting，POCT）是一種在現場采樣，再利用便攜式分析儀器及配套試劑快速得到檢測結果的檢測方式，這種模式使得醫療工作方式更加快速高效[7]，因此，體積小、易操作、耗時短、易攜帶的POCT設備成為研究熱點。目前，POCT的主流傳感策略包括比色法[8]、熒光法[9]、電化學法[10]和化學發光法[11]等。其中，比色法具有成本低、操作簡便、實用性強和可裸眼分辨等優點，因此備受關注。近年來，隨著智能手機設備不斷普及和性能不斷升級優化，包括功耗低、高分辨成像、大規模數據儲存和強大的數據運算能力等，構建基于智能手機的比色傳感設備引起了廣泛關注，并在生化檢測領域得到了快速推廣應用[12-13]。目前，以數字圖片比色法為原理，基于智能手機的便攜式檢測設備已應用于疾病診斷、食品安全、環境監測等領域的POCT檢測。Sajed等[14]設計了基于智能手機與光學元件組裝的便攜式檢測儀器，用于檢測由Hg2+引起金納米顆粒聚集而發生的顏色變化。Sáez-Hernández等[15]基于數字圖片比色方法研發了一種基于智能手機的檢測設備，通過捕捉烘烤過程中吐司的顏色變化評估自制吐司中的丙烯酰胺濃度。這些研究中采用的智能手機不僅可以替代復雜的光學檢測系統采集高質量的比色圖像，還可替代電腦完成檢測結果的計算和數據輸出。因此，結合智能手機的優勢以及POCT對檢測儀器的需求，研發一種基于智能手機的便攜式比色傳感平臺，對于血糖和血脂等生化分子的POCT檢測具有非常重要的意義。

除研發便攜式檢測儀器之外，改進常用的生化檢測方法也可進一步降低血糖日常的檢測成本。常用的底物比色檢測方法需要生物酶催化介導以獲得目標信號，而生物酶存在易失活、儲存條件苛刻和成本高等缺點，進一步限制了其在日常血糖監測中的廣泛應用[16]。納米酶是具有類酶催化活性的納米材料，相較于生物酶，具有催化活性穩定、易于保存和成本低等優點，已成為構建穩定比色探針的新選擇[17]。

本研究發展了一種基于智能手機傳感平臺的納米酶比色法用于葡萄糖的快速檢測，其檢測原理如圖1所示，由葡萄糖氧化酶（GOx）催化氧化葡萄糖生成H2O2，利用四氧化三鐵納米顆粒（Fe3O4NPs）優良的類過氧化物酶活性，催化H2O2氧化底物3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）生成藍色氧化態TMB產物（oxTMB）。通過智能手機采集顯色圖像，并在手機終端嵌入基于數字圖片比色法的檢測程序，可實時讀取反應體系的色度值，并自動輸出分析結果，實現葡萄糖的準確檢測。本方法操作簡便、檢測快速、成本低，可實現高通量檢測，能夠在基層醫療部門的糖尿病早期篩查或家庭健康護理等領域推廣使用。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

UV-3100PC紫外-可見分光光度計（上海美普達科技有限公司）；MB100-4A微孔板恒溫振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）；KQ-400DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Honor7i智能手機（華為技術有限公司）；快速混勻器（上海精密儀器儀表有限公司）；MultiskanFC酶標儀（美國賽默飛世爾儀器有限公司）。

FeCl3（≥99.9%）、FeCl2（98%）、NH3·H2O（28%）和抗壞血酸（Ascorbicacid，AA，≥99%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；GOx購自上海新鉑化學技術有限公司；TMB、H2O2、D-（+）-葡萄糖（≥99.5%）、甘氨酸（Gly，gt;99%）、谷胱甘肽（GSH，gt;98%）、蔗糖（Suc，99%）和尿素（Urea，99.5%）購自上海碧云天生物技術有限公司。實驗用水為超純水（電阻率為18.20MΩ·cm）。

1.2智能手機比色傳感平臺的設計

采用SolidWorks軟件設計基于智能手機的比色傳感平臺，由3D打印機組裝而成。此傳感平臺集成了一個封閉的光學裝置和一個96孔孔板載物臺，其中的光學元件包括LED陣列式光源、菲涅爾透鏡和導光板等，并且對這些光學附件的大小與集成位置進行了系統優化，為智能手機采集圖像提供優良的光照環境；96孔孔板載物臺為檢測容器，用于樣品的高通量搭載。此檢測平臺基于Windows操作系統，以Java語言為主要開發語言，采用顏色傳感器及嵌入式開發技術在Androidstudio中完成自動化檢測樣品的應用程序編寫，包括樣品的圖像采集、存儲、分析、導出和檢索等多重功能。基于數字圖片比色法建立色度值與待測物含量之間的關系，實現樣品的快速定量檢測。

1.3Fe3O4NPs的制備

Fe3O4NPs的制備參考文獻[18]方法。將500μL1mol/L的FeCl3和100μL2mol/L的FeCl2溶液混合均勻，逐滴添加5mL0.7mol/L稀氨水，每次20μL，滴加完畢后充分攪拌；30min后，得到棕黑色的分散液，通過磁鐵對粗產物進行分離富集；水洗5次，得到純化的Fe3O4NPs，分散于水中，備用，濃度為10mg/mL。

1.4Fe3O4NPs的類過氧化物酶活性探究

向96孔板各孔中分別加入100μLTMB溶液（0.15mmol/L）和100μLH2O2溶液（2mmol/L），充分混勻，再加入一系列不同濃度梯度的Fe3O4NPs，使終濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.15、0.2和0.25mg/mL，于37oC下孵育。以未加Fe3O4NPs的空白組作為對照，每組實驗重復3次。每隔5min采用智能手機比色傳感平臺進行圖像采集與色度值分析，探究Fe3O4NPs的類過氧化物酶活性及其隨濃度與時間變化的情況。以100μLTMB溶液（0.15mmol/L）、100μLH2O2溶液（2mmol/L）以及Fe3O4NPs（終濃度0.25mg/mL）為研究體系，探究回收后Fe3O4NPs以及存儲不同時間后Fe3O4NPs的類過氧化物酶活性。

1.5智能手機比色傳感平臺定量檢測葡萄糖

向96孔板各孔中加入100μLTMB溶液（0.15mmol/L），再向各孔依次加入等量的Fe3O4NPs（終濃度為0.25mg/mL）和GOx（終濃度為0.75mg/mL），充分混勻，置于恒溫振蕩器中于37℃預熱5min。向其中加入100μL不同濃度梯度的葡萄糖溶液（1、2、5、10、20和30mmol/L），37℃下孵育30min，除去Fe3O4NPs。以未加葡萄糖的微孔作為空白對照，各組實驗重復3次。反應過程中，采用智能手機比色傳感平臺采集圖像進行實時監測，并通過智能手機終端的應用程序對各實驗組進行自動化分析。同時采用酶標儀對不同濃度的葡萄糖進行檢測。20份臨床血清樣本來自山西省第一人民醫院（患者知情同意，相關研究已得到倫理委員會批準），采用相同的方法對其血糖濃度進行檢測，以探究智能手機比色傳感平臺對實際樣品中葡萄糖檢測的可行性。作為對照，所有樣本的葡萄糖濃度均采用酶標儀進行檢測，測定650nm處的吸光度。

2結果與討論

2.1構建基于智能手機的比色傳感平臺

基于智能手機的比色傳感平臺整體尺寸（長×寬×高）為140mm×100mm×155mm，包括獲取圖像的光學裝置與智能手機終端嵌入的檢測程序（圖2A）。光學裝置分為4個部分，包括陣列式LED光源（9×10排列）、96孔板載物臺、光學調控原件（菲涅爾透鏡與導光板）和拍照孔（裝置頂部中心）。儀器內部的光路如圖2B所示，光束由LED面光源發出通過96孔板，經導光板使得光通量均勻分布在整個裝置內，然后經菲涅爾透鏡折射后匯聚到拍照孔被智能手機攝像頭接收，用于96個微孔的全部準確成像。

在Windows操作平臺下，基于顏色傳感器及嵌入式開發技術，在智能手機終端編寫自動化檢測應用程序，讀出圖像的RGB值信息（取值范圍：0～255），且RGB色度值可轉換為CMYK與HSV色彩空間信息，目前已集成多重顏色通道（RGBYH）檢測模式，包括紅色（Red，R）、綠色（Green，G）、藍色（Blue，B）、黃色（Yellow，Y）和色調（Hue，H）通道，具體功能包括圖像采集、分析、導出和檢索等。應用程序界面如圖2C所示，主要包括主界面、微孔板成像界面和數據界面等。檢測流程如下：打開應用程序進入主界面，先點擊“Instruction”查看操作說明，再點擊“Start”進入檢測界面，將智能手機放置于儀器頂部卡槽，調用后置攝像頭對準拍照孔，使矩形預覽框與微孔板的各微孔對齊，待攝像頭自動聚焦后，點擊“Capture”得到顯色圖像；點擊“Next”，檢測程序將圖像信息轉化為RGB等色度值信息，根據內置的標準曲線自動計算96孔板中樣品的含量，輸出檢測結果并以“Excel”文件形式導出。此外，用戶還可以點擊“Search”來查看歷史檢測結果，包括實驗名稱、檢測時間和檢測結果等。檢測結束后，點擊“Exit”可退出應用程序。

2.2智能手機比色傳感平臺檢測性能的評估

因TMB-H2O2體系在催化反應后顯藍色，本研究以藍色墨水為例，基于智能手機比色傳感平臺對顯色體系進行定量檢測，評估其成像效果與檢測性能，并與酶標儀檢測結果進行對比。智能手機采集不同濃度藍色墨水（0.04%、0.08%、0.1%、0.2%、0.3%和0.6%）的顯色圖像后，將圖像自動導入手機終端編寫的檢測程序，基于數字圖片比色法分析樣品在不同顏色通道的色度值，并根據擬合工作曲線的線性相關系數（R2）選擇最優的顏色通道。如圖3A～3E所示，隨著藍色墨水濃度增加，R和G值不斷降低，H值不斷升高，B值與Y值呈不規則變化，并且藍色墨水在G通道的擬合效果最好，在0.04%～0.60%范圍內呈良好的線性關系，得到的線性方程為y=–78.41x+1.64（R2=0.997）。同時，將G通道與酶標儀（650nm處的吸光度值）的檢測結果進行對比，兩種方法檢測結果具有較好的相關性（R2=0.997）（圖3F）。上述結果說明，智能手機比色傳感平臺對于藍色體系的檢測具有較好的敏感度和準確性。

2.3Fe3O4NPs的表征

制備的Fe3O4顆粒呈棕黑色（圖4A），在磁鐵作用下易與液相分離，表明此顆粒具有很好的磁性特征（圖4B）。透射電鏡圖像顯示Fe3O4為分布均勻的球形顆粒（圖4C）；采用動態光散射方法測定了Fe3O4顆粒的粒徑分布，平均粒徑約為15nm（圖4D）。

2.4Fe3O4NPs的類過氧化物酶活性探究

采用TMB-H2O2體系，探究制備的Fe3O4NPs的類過氧化物酶活性。首先，在H2O2存在條件下，通過Fe3O4NPs催化底物TMB的反應，考察Fe3O4NPs的類過氧化物酶活性。如圖5A所示，TMB與H2O2混合溶液、Fe3O4NPs與TMB混合溶液反應后，在650nm處均無明顯吸收峰；將Fe3O4NPs加入到TMB-H2O2混合液中反應一定時間后，體系在650nm處出現明顯的oxTMB吸收峰，表明Fe3O4NPs具有良好的類過氧化物酶活性，但不具有氧化酶活性。考察了不同濃度的Fe3O4NPs催化TMB底物的反應隨時間的變化，使用智能手機比色傳感平臺進行色度值分析。如圖5B所示，對于相同的反應時間，隨著Fe3O4NPs濃度增加，ΔG逐漸增加（ΔG定義為對照組與實驗組G值之差）；在相同濃度Fe3O4NPs條件下，隨著反應時間的延長，ΔG逐漸增加，反應30min后，ΔG達到穩定水平。因此，選擇Fe3O4NPs濃度為0.25mg/mL、催化反應30min為最佳反應條件。

使用智能手機比色傳感平臺進一步探究了磁性分離回收后的Fe3O4NPs的類過氧化物酶活性。在最佳反應條件下，使用Fe3O4NPs催化TMB底物的氧化反應，以第一次的檢測信號為100%，通過磁鐵進行Fe3O4NPs回收后繼續用于催化TMB的氧化反應，重復5次，檢測結果如圖5C所示。在第5次回收時，Fe3O4NPs的催化效果并未出現大幅度下降，檢測信號保持初始信號的89%。探究了Fe3O4NPs在室溫下的儲存穩定性，由圖5D可見，Fe3O4NPs催化效果隨存儲時間延長而逐漸下降，在第11天時，檢測信號仍保持為初始信號的81%。上述結果說明，制備的Fe3O4NPs具有較強的類過氧化物酶催化活性和較好的穩定性。

2.5基于智能手機比色傳感平臺檢測葡萄糖

采用基于智能手機傳感平臺的納米酶催化比色法檢測不同濃度梯度的葡萄糖溶液（1～30mmol/L）。反應過程中，智能手機作為拍照設備對反應體系進行實時監測，采集0～40min內的顯色圖像。如圖6A所示，體系的顏色隨反應時間延長而逐漸加深，在30min時顏色達到最深，并且在40min時仍保持穩定。因此，選擇30min作為最佳孵育時間。基于數字圖片比色法，通過智能手機終端的檢測軟件對圖像進行色度值分析，根據線性擬合效果自動選擇最優的G通道。如圖6B所示，當葡萄糖濃度為1～30mmol/L時，在G通道擬合的工作曲線為ΔG=1.57C+10.92，檢出限為0.366mmol/L，能夠完全覆蓋正常成年人空腹血糖濃度范圍（3.9～6.1mmol/L）[19-20]。同時，采用酶標儀對葡萄糖標準品進行檢測，并與G通道的檢測結果進行比較，二者的檢測結果具有較好的相關性（R2=0.996）（圖6C），表明基于智能手機傳感平臺的納米酶催化比色法在葡萄糖檢測中具有良好的準確性和可靠性。進一步考察了方法的選擇性。采用本手機傳感平臺分別檢測了血液中潛在的5種干擾性物質抗壞血酸（AA）、谷胱甘肽（GSH）、甘氨酸（Gly）、蔗糖（Suc）和尿素（Urea），以未加干擾物與葡萄糖的空白組作為對照，結果如圖6D所示，5種干擾物的檢測信號與空白對照組的信號相當，均遠低于葡萄糖組；對各干擾物檢測結果與葡萄糖組的檢測結果進行t檢驗分析，結果顯示均存在顯著性差異（plt;0.001），表明本方法對于葡萄糖的檢測具有良好的選擇性。上述結果表明，開發的智能手機比色傳感平臺檢測葡萄糖具有很高的準確性和特異性。

將本方法與其它文獻報道的葡萄糖檢測法進行對比，如表1[21-26]所示，與文獻[21，23，25-26]報道方法相比，本方法具有更寬的濃度檢測范圍；與文獻[21-22，24，26]相比具有更低的檢出限，并且本研究中的檢測儀器便攜、操作簡單、成本低，具有良好的潛在的臨床應用價值。

2.6實際樣品分析

為了探究建立的智能手機比色傳感平臺用于臨床血糖檢測的可行性，采用本方法建立的擬合工作曲線對采集的20份臨床血清樣品進行定量檢測。如圖7所示，在20組血清樣品中，11號樣本表現出低血糖特征，血糖濃度為3.15mmol/L；8號樣本的血糖濃度略高于正常范圍，為6.42mmol/L；6號樣本（12.42mmol/L）和18號樣本（8.96mmol/L）表現出高血糖特征，大于血糖正常閾值范圍；其余樣本均處于正常濃度范圍內。同時，將以上檢測結果與酶標儀和醫院的檢測數據進行對比，通過t檢驗進行檢測結果差異性分析，發現智能手機比色傳感平臺與酶標儀只有第六組檢測結果存在顯著性差異（plt;0.05），其余各組檢測結果均保持一致（pgt;0.05），與醫院的檢測結果均不存在顯著性差異（pgt;0.05）。同時，本方法對于低血糖（11號）、正常血糖以及高血糖樣本（6、8和18號）的判斷與醫院的檢測數據具有良好的一致性，顯示出潛在的臨床應用價值。

3結論

本研究構建了基于Fe3O4NPs輔助的比色法測定血糖濃度，并通過智能手機比色傳感平臺的“一鍵式”模式輸出檢測結果。Fe3O4NPs具有制備簡單、催化活性高、成本低和可回收利用的優勢，彌補了生物酶制備困難、成本高和穩定性差的不足。智能手機比色傳感平臺具有采集圖像快、數據易儲存、可進行數據自動化分析并且能隨時進行數據查詢與導出等優勢。結合Fe3O4NPs的類過氧化物酶催化活性與智能手機比色傳感平臺的檢測性能，在1～30mmol/L范圍內，傳感平臺的G值與葡萄糖濃度具有良好的線性關系。進一步將此傳感平臺用于臨床血液樣本的血糖濃度檢測，結果表明，本方法能夠準確地鑒別出異常值，與酶標儀檢測結果和醫院提供的檢測數據基本保持一致。本方法具有通量高、操作簡單、普適性強和成本低等優點，有望進一步應用于基層醫療體系生化指標的即時檢測。