心肌梗死及心肌梗死后心力衰竭患者血漿酰基肉堿的靶向代謝組學研究

關鍵詞酰基肉堿；超高效液相色譜-高分辨質譜聯用；心肌梗死；心力衰竭；代謝組學

心肌梗死（Myocardialinfarction，MI）和心力衰竭（Heartfailure，HF）是最嚴重的兩種心血管疾病，發病率高、預后差[1-2]。最新研究表明，經皮冠狀動脈介入治療后，仍然有14%～36%的心肌梗死患者將發展成為心力衰竭[3-4]。隨著老齡人口加速增長，我國已成為全球心力衰竭患病人群最大的國家[5]。研究顯示，代謝紊亂是多種心血管系統疾病的共同誘因。近年來，心血管疾病的代謝組學研究已成為熱點，為揭示心血管疾病的發病機制和尋找新的治療靶點提供了新的視角[6]。

酰基肉堿（Acylcarnitines）是一種脂肪酸與肉堿結合生成的酯類化合物，在細胞能量代謝過程中發揮了關鍵作用[7]。目前，已有多項研究表明，酰基肉堿代謝紊亂與心血管疾病的發生和發展密切相關。Ruiz-Canela等[8]研究了酰基肉堿血漿水平與心力衰竭和心房顫動發生之間的關聯，發現C14、C16、C18和C18∶2等長鏈酰基肉堿與心力衰竭發生風險增加相關。Jansen等[9]通過隊列研究，發現酰基肉堿C3、C4、C6-DC、C8∶1、C16、C18和C18∶2水平變化與肥厚性心肌病的嚴重程度相關。Strand等[10]采用5種主要的酰基肉堿評估了穩定型心絞痛患者發生急性心肌梗死的風險，發現血清乙酰、辛酰和棕櫚酰肉堿水平升高與心肌梗死風險的增加相關。Ahmad等[11]對心力衰竭患者進行代謝組學研究發現，相較于慢性收縮期心力衰竭患者，終末期心力衰竭患者血漿中長鏈酰基肉堿C16和C18的濃度水平升高。以上研究表明，酰基肉堿在心血管疾病的病理生理過程中具有重要作用，可能成為預測疾病進展的生物標志物或治療干預的潛在靶點。然而，心血管疾病中酰基肉堿代謝紊亂的研究目前主要集中在心絞痛、心肌梗死、心力衰竭以及心肌病等方面，對于心肌梗死與心肌梗死后心力衰竭患者的酰基肉堿差異代謝特征研究鮮有報道。

酰基肉堿的酰基鏈結構多樣，并且在血漿樣本中酰基肉堿含量普遍較低。如何從基質復雜的血漿中準確測定酰基肉堿，提高酰基肉堿檢測的覆蓋度和準確性，是心血管疾病研究面臨的重要挑戰。目前，對于酰基肉堿的分析檢測主要采用超高效液相色譜-三重四極桿質譜的多反應監測模式（Multiplereactionmonitoring，MRM）以及基于超高效液相色譜-高分辨率質譜（Ultra-performanceliquidchromatography-highresolutionmassspectrometry，UPLC-HRMS）的全掃描（Full-scanmassspectrometry，FullMS）結合數據依賴型掃描模式（Data-dependentacquisition，ddMS2）。MRM模式是酰基肉堿靶向檢測最常用的方法[12-14]，能夠靶向選取酰基肉堿的母離子和子離子，形成特征的離子對，再對其進行定量分析。MRM檢測過程中可消除大部分干擾信號，大大提高了定量分析的準確度，但由于其質譜分辨率不高，難以分離酰基肉堿的同分異構體。FullMS/ddMS2是獲得二級質譜數據的常用方法，能夠實現酰基肉堿的高分辨檢測[15-16]。但是，對于低含量酰基肉堿，仍然難以獲得其二級質譜信息，因而無法實現低含量酰基肉堿的準確定性分析。因此，迫切需要建立能全面表征血漿中酰基肉堿的定性和定量分析方法。近年來，由多反應監測模式演變而來的基于UPLC-HRMS的平行反應監測模式（Parallelreactionmonitoring，PRM）可實現目標代謝物二級質譜信息的高分辨采集，為酰基肉堿同分異構體的檢測提供了可能。相比于MRM，PRM具有分辨率高、靈敏度高和動態范圍寬等優點，能夠很好地減小背景噪聲的干擾[17]。因此，為提高血漿酰基肉堿檢測的覆蓋率和準確性，本研究結合UPLC-HRMS不同掃描模式的優勢，建立了一種FullMS/ddMS2和FullMS/PRM相結合的血漿酰基肉堿分析方法，并將其應用于心梗及心梗后心衰患者的靶向代謝組學分析研究。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

UltiMate3000超高效液相色譜儀和Q-ExactiveFocus軌道離子阱高分辨質譜儀（美國ThermoScientific公司）；KM-1030C超聲波清洗機（廣州科盟清潔技術有限公司）；PTY-224/323電子分析天平（福建華志電子科技有限公司）；Milli-QIQ7015超純水機（德國Merck公司）；DHG-9070A鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

甲醇、乙腈和甲酸（質譜級，德國Merck公司）；9種酰基肉堿和3種內標的標準品（HPLC級，美國Sigma公司），詳細信息見電子版文后支持信息表S1。

1.2實驗方法

1.2.1血漿樣本收集

本研究收集了58例心梗和42例心梗后心衰患者的血漿樣本。心梗患者的入選標準為：出現無明顯誘因胸痛、心電圖提示ST段抬高或壓低、心肌酶和肌鈣蛋白等血清心肌損傷標志物發生變化；心梗后心衰患者的入選標準為：出現心衰的癥狀和體征、冠狀動脈造影顯示冠狀動脈嚴重狹窄、心肌梗死既往史、心功能分級Ⅱ-Ⅳ級、NT-proBNPgt;125pg/mL[18-19]。本研究排除了既往存在風濕性心臟病、重度肺動脈高壓及先天性心臟病、縮窄性心包炎、嚴重腎功能不全患者、合并惡性腫瘤患者以及存在嚴重的創傷性疾病和嚴重血液系統疾病的患者，并且排除了處于妊娠期及哺乳期的婦女。清晨從空腹8h的志愿者肘部靜脈采血，經肝素鋰抗凝，4℃靜置3h后，在3000r/min條件下離心20min，取上清液置于–80℃凍存，患者的具體信息見表1。本研究通過了云南省第一人民醫院倫理審查委員會的批準，并獲得了所有參與者知情同意。

1.2.2血漿樣本前處理

血漿樣本放置在4℃下完全解凍后，渦旋1min；準確移取100μL血漿樣本，加入20μL0.2μg/mL的AC（C4-d3）、AC（C8-d3）和AC（C16-d3）3種混合同位素內標溶液、400μL質譜級冷乙腈，渦旋1min，室溫下靜置10min；在4℃以13000r/min離心15min，收集上清液，在室溫下用氮氣吹干；采用200μL25%乙腈溶液復溶，渦旋1min，在4℃以13000r/min離心10min，取上清液，過0.22μm有機膜后，轉移至帶內襯管的進樣瓶中，待分析。

在相同條件下制備質量控制（Qualitycontrol，QC）樣本，用于評價方法的重復性和樣本的穩定性。QC樣本的前處理與上述樣本相同，在進樣分析時均勻穿插在實驗樣本中，共計采集18個QC樣本數據。

1.2.3液相色譜條件

色譜柱為ThermoScientificHypersilACE3C18（150mm×3.0mm，3μm），柱溫為40℃。以乙腈為流動相A、0.1%甲酸-水為流動相B。采用梯度洗脫程序：0～0.5min，10%A；0.5～3.0min，10%～15%A；3～5min，15%～30%A；5～21min，30%～97%A；21～23min，97%A；23～23.5min，97%～10%A。運行時間為23.5min，流速為0.35mL/min，進樣體積5μL。每次進樣前后，均使用90%甲醇溶液清洗進樣針。

1.2.4質譜條件

高分辨質譜相關參數設置如下：離子源采用電噴霧電離源，噴霧電壓：4000V（+），3500V（–）；霧化溫度：300℃；鞘氣壓力：4.5MPa（+），4.0MPa（–）；輔助氣壓力：1.5MPa（+），1.0MPa（–）；傳輸毛細管溫度：350℃（+），320℃（–）。

采用兩步掃描模式進行分析。（1）全掃描/數據依賴型掃描模式（FullMS/ddMS2）。全掃描分辨率為70000，數據依賴二級掃描（ddMS2）分辨率為35000，高能碰撞誘導電壓為15、25和35eV。為了獲得更加豐富的MS/MS信息，酰基肉堿靶向分析采用全掃描結合分段掃描的方式采集數據：全掃描的質荷比范圍為m/z200～500；分段掃描共設置3段，掃描的質荷比范圍為m/z199～300、m/z299～400和m/z399～500。數據采集均在正離子模式下進行。（2）全掃描結合平行反應監測模式（FullMS/PRM）。對于第一步ddMS2模式未測定出二級質譜的酰基肉堿，使用PRM模式采集二級質譜進行定性分析。所有酰基肉堿均采用全掃描模式進行定量分析。質譜參數：全掃描分辨率為35000，PRM分辨率為17500，質荷比掃描范圍為m/z100～500，碰撞能量為35eV。

1.2.5數據處理

傾向性評分匹配（Propensityscorematching） 為避免性別和年齡差異對兩組患者血漿代謝組的影響，采用R4.2.3匹配軟件包（Optimal方法）對58例心梗患者和42例心梗后心衰患者的年齡和性別進行匹配，最終匹配到42例心梗患者和42例心梗后心衰患者。

代謝物定性分析 對于AC（C4）、AC（C5）、AC（C6）、AC（C8）、AC（C10）、AC（C12）、AC（C14）、AC（C16）和AC（C18）這9種有標準品的酰基肉堿，通過與標準品的保留時間、一級質譜和二級質譜信息進行比對，實現準確定性分析；對其它無標準品的酰基肉堿，根據其在反相色譜柱上的色譜流出規律和質譜裂解規律，結合參考文獻、HMDB和Massbank等數據庫信息進行比對，實現定性分析。血漿中的酰基肉堿存在大量同分異構體，本方法只能實現這些同分異構體的分離，無法實現準確定性分析。因此，本研究采取一種簡化的標記策略，將檢測出的酰基肉堿同分異構體按照出峰順序編號，例如，將第一個出現的峰標記為a，第二個標記為b，依此類推。

代謝物定量分析 基于定性分析結果，采用Xcalibur3.0.63.3軟件提取代謝物的峰面積，結合外標法或內標法對代謝物進行定量分析。對9種有標準品的酰基肉堿采用外標法建立標準曲線（見電子版文后支持信息表S2），用于進行定量分析；對其余無標準品的酰基肉堿，根據其碳鏈長度而采用不同的內標進行定量分析。短鏈酰基肉堿（C2～C5）使用內標AC（C4-d3）進行定量分析，中鏈酰基肉堿（C6～C12）使用內標AC（C8-d3）進行定量分析，長鏈酰基肉堿（gt;C12）使用內標AC（C16-d3）進行定量分析，以提高定量分析的準確性。

分類模型的建立與差異性特征代謝物篩選 （1）采用MetaboAnalyst6.0平臺對心梗與心梗后心衰兩類樣本進行偏最小二乘-判別分析（Partialleastsquares-discriminantanalysis，PLS-DA），建立兩類疾病分類模型，篩選變量重要性投影值（Variableimportanceinprojection，VIP）gt;1的變量；（2）利用SPSS27.0軟件進行t檢驗分析，篩選兩類樣本之間含量有顯著性差異（plt;0.05）的酰基肉堿代謝物，并根據p值計算錯誤發現率（Falsediscoveryrate，FDR），剔除假陽性結果；（3）結合VIPgt;1與FDRlt;0.05為標準，篩選兩類樣本的差異性特征代謝物。

火山圖分析 計算出兩類患者間各酰基肉堿濃度的差異倍數（Foldchange，FC），結合上文計算出的FDR值，繪制火山圖，繪制時設置FCgt;1.5和FDRlt;0.05為閾值，系統自動篩選出符合設置要求的代謝物，最后以火山圖形式直觀展示兩組樣本之間代謝物的差異變化。

相關性分析 將樣本中酰基肉堿的定量分析結果與臨床表型數據（包括NT-proBNP、Tn、TR、LA、E/A、E/e′、PASP、LVEDD、RV、IVS、e′和EF）繪制熱圖，進行相關性分析。利用皮爾遜相關系數量化二者之間的線性關系強度。重點關注了皮爾遜相關系數絕對值|r|≥0.5且plt;0.05的代謝物。熱圖中單元格顏色越鮮明說明變量相關性越高。

受試者工作特征（Receiveroperatingcharacteristic，ROC）曲線 采用Logistic回歸分析及ROC分析進一步評估所篩選出的酰基肉堿指標對兩類患者的診斷能力。首先，分別對單個指標進行ROC分析，評估單個指標的診斷能力；然后，聯合不同指標進行多變量ROC分析，評估多指標對疾病的診斷能力。plt;0.05表明具有統計學意義。

2結果與討論

2.1酰基肉堿的色譜流出規律及質譜裂解規律

酰基肉堿由相同的肉堿頭基部分和酰基鏈組成，由于酰基碳鏈長度不同（C2～C26）、碳鏈骨架異構以及碳鏈的不同位置存在多種官能團修飾，因此，酰基肉堿的結構復雜多樣、種類繁多。本研究采用反相色譜洗脫酰基肉堿代謝物，結果表明，對于不同碳數的酰基肉堿，碳數小的先出峰，碳數大的后出峰；相同碳數的酰基肉堿，不飽和的先出峰，飽和的后出峰，不飽和度越大出峰時間越早；相同碳數的酰基肉堿，含有羥基官能團的先出峰，含有羥基且不飽和的酰基肉堿，不飽和度越大，出峰時間越早。質譜分析結果表明，由于酰基肉堿由相同的肉堿頭基和不同的酰基鏈組成，酰基肉堿會產生C4H5O2+（m/z85.0284）、TMAI（三甲胺離子，m/z60.0808）和C7H14NO2+（肉堿-H2O+H+，m/z144.1014）3個主要特征質譜碎片，其中，C4H5O2+（m/z85.0284）為酰基肉堿最顯著的特征峰，其豐度隨著碰撞能量的增加而增大。對于含有一個不飽和鍵且含一個羥基的酰基肉堿，存在M-carnitine-H2O=M-179.1152的特征片段，若羥基位于3號位，則還存在m/z145.0495的特征片段[20]。

2.2血漿中酰基肉堿的定性分析

根據酰基肉堿的特征質譜裂解規律，利用FullMS/ddMS2模式對血漿樣本進行分析，將含有特征碎片離子m/z60.0808、85.0284和144.1014的代謝物確定為酰基肉堿前體離子，最終通過分段掃描篩選出108個酰基肉堿前體離子（圖1）。然而，實驗結果表明，所篩選的大部分酰基肉堿前體離子經提取后僅存在一個或多個一級質譜峰，并沒有二級質譜，無法對其準確地進行定性分析。因此，本研究進一步探索能獲得更多二級質譜的實驗方法。DDA掃描是獲得二級質譜數據的常用方法，但只采集強度超過預定閾值的前體離子的MS/MS數據，對于低含量的代謝物，這種模式難以獲得足夠的MS/MS信息[21-22]。PRM是一種新型靶向檢測方法，近年來被廣泛應用于肽和小分子化合物的靶向定性和定量分析[23-25]。PRM模式能夠靶向采集所有目標前體離子的MS/MS數據，化合物的前體離子在Q1中被選擇，然后在Q2中碰撞碎裂，生成的產物（MS/MS）均可通過全掃描軌道離子阱質譜儀實現高分辨檢測[26]。PRM模式可以提供高分辨率的MS/MS譜，但受掃描速度的限制，很難在一次數據采集過程中同時獲得所有潛在酰基肉堿的MS/MS譜，并且峰形較差。因此，本研究將第一步所篩選出的108種前體離子通過3次PRM掃描進行分析，再通過Xcalibur軟件提取FullMS/PRM采集的數據。分別提取不同酰基肉堿前體離子的提取離子流圖和該前體離子下二級質譜的提取離子流圖（m/z60.0808、85.0284和144.1014），若前體離子及其二級質譜離子在相同時間出峰，并具有一一對應關系，則將其確定為酰基肉堿。最終，在血漿樣本中定性分析出165種酰基肉堿。

2.3血漿中酰基肉堿的質譜定量檢測參數的優化

質譜參數會對離子的響應強度及峰形等產生影響，而質譜分辨率會影響分析方法的靈敏度和重復性[27]。質譜掃描的分辨率越高，所需的掃描時間越長，到達檢測器的目標離子采集次數就會變少，使得離子強度降低，定量峰形變差，重復性變差。因此，質譜分辨率應根據實際需要進行選擇。此外，碰撞能量對于質譜分析結果也有很大影響。較高的碰撞能量可以產生更多碰撞解離反應，使離子斷裂更徹底，產生更多碎片離子，但可能會降低母離子豐度；較低的碰撞能量可能導致碰撞解離反應不完全，離子斷裂不完全[28-29]。本研究對FullMS/PRM模式下酰基肉堿質譜檢測的分辨率和碰撞能量等進行了優化。采用QC樣本進行優化的結果顯示，絕大部分酰基肉堿在一級質譜分辨率為35000、二級質譜分辨率為17500時，質譜響應更強（圖2A）；在碰撞能量為35eV時，離子的質譜響應更強（圖2B）。因此，將酰基肉堿定量分析方法中的一級和二級質譜分辨率分別設置為35000和17500，碰撞能量設置為35eV。本研究采用此質譜條件結合外標法與內標法定量分析了血漿中的111種酰基肉堿。為了考察方法的穩定性，進行了重復性實驗，發現QC樣本中酰基肉堿定量結果的RSD均小于20%（n=5），說明本定量方法重復性好，穩定性和可靠性高。

2.4心肌梗死及心肌梗死后心力衰竭患者血漿酰基肉堿差異分析

2.4.1分類模型建立及差異性特征代謝物篩選

采用SPSS27.0軟件對這兩類患者的111種酰基肉堿的含量進行t檢驗分析，發現有98種酰基肉堿含量具有顯著性差異（FDRlt;0.05）（電子版文后支持信息表S3）。心梗與心梗后心衰患者的PLS-DA判別模型（Accuracy=0.976，R2=0.953，Q2=0.858）分析結果表明，兩類患者可完全分開（圖3A），10-折交互檢驗和置換檢驗也驗證了此模型的可靠性和預測能力。結合VIP（gt;1）（圖3B）和t檢驗（FDRlt;0.05）篩選出24種能夠區分心梗與心梗后心衰患者的酰基肉堿類代謝物。同時，結合兩類樣本代謝物濃度的FC（gt;1.5）和FDR（lt;0.05）繪制火山圖（圖3C），結果表明，相較于心梗患者，心梗后心衰患者有46種酰基肉堿含量顯著上升，包括23種上述篩選出的差異代謝物（表2）。

2.4.2酰基肉堿與臨床表型指標之間的相關關系分析

為揭示酰基肉堿血漿水平與臨床表型之間的關系，對單個酰基肉堿、短鏈、中鏈、長鏈以及總酰基肉堿與臨床表型指標（包括NT-proBNP、Tn、TR、LA、E/A、E/e′、PASP、LVEDD、RV、IVS、e′和EF）之間的相關性進行分析。結果表明，心梗后心衰患者血漿中的AC（C11∶1）、AC（C14-OH）、AC（C16∶4b）、長鏈酰基肉堿、總酰基肉堿與臨床表型指標NT-proBNP呈顯著正相關。NT-proBNP是臨床上用于診斷心力衰竭及其嚴重程度和預后評估的首選生物標志物[30]。AC（C12∶1a）與PASP呈顯著正相關（r≥0.5，plt;0.05）（圖4A）。此外，相關性分析得到的AC（C14-OH）和AC（C12∶1a）也是之前所篩選出的差異代謝物（表2）。為進一步評估所篩選指標在心梗后心衰診斷中的潛在價值，對AC（C14-OH）、AC（C12∶1a）、長鏈酰基肉堿、總酰基肉堿、NT-proBNP和PASP進行ROC分析。結果表明，AC（C14-OH）、AC（C12∶1a）、長鏈酰基肉堿和總酰基肉堿對心衰患者均具有診斷意義（plt;0.05），AUC值分別為0.7993、0.9019、0.8248和0.8231（圖4B）；NT-proBNP、PASP對心衰具有診斷意義（plt;0.05），AUC值分別為0.8254和0.6644（圖4C）。通常，AUCgt;0.7才能表示模型具有一定的診斷準確性[31]。因此，將AUCgt;0.7的5個指標結合起來進行聯合診斷，結果表明，心梗后心衰的診斷靈敏度和特異度均得到提升，AUC值提升至0.9456（圖4D）。綜上，酰基肉堿結合臨床表型指標具有優秀的診斷能力，對于提高心梗后心衰診斷的準確性具有重要意義。

3結論

酰基肉堿是人體能量代謝的關鍵產物，但目前對于心梗及心梗后心衰這兩類疾病的酰基肉堿代謝紊亂特征研究仍較少。本研究基于UPLC-HRMS技術，建立了FullMS/ddMS2和FullMS/PRM相結合的血漿酰基肉堿定性和定量分析方法，并將其用于心梗和心梗后心衰患者的酰基肉堿靶向分析，在兩類樣本中定性分析出165種酰基肉堿，定量分析了111種酰基肉堿。此外，在定量分析酰基肉堿的基礎上，結合t檢驗、PLS-DA和VIP等方法，篩選出24種可區分心梗與心梗后心衰患者的差異性特征代謝物。結合火山圖發現，心梗后心衰患者血漿酰基肉堿水平發生顯著變化，46種酰基肉堿含量顯著上升。酰基肉堿含量變化與臨床表型指標之間的相關關系分析表明，酰基肉堿與心衰的臨床生物學標志物NT-proBNP之間呈顯著正相關，AC（C14-OH）、AC（C12∶1a）、長鏈酰基肉堿、總酰基肉堿和NT-proBNP的聯合檢測可顯著提高心梗后心衰診斷的靈敏度和特異度，有望成為心梗后心衰診斷的有效指標。本研究為心肌梗死后心力衰竭患者的精準診斷及疾病發展進程中的治療和營養干預提供了重要的代謝靶標。