基于特征肽的高效液相色譜-串聯質譜法鑒定沙門氏菌

關鍵詞沙門氏菌；特征肽；高效液相色譜-串聯質譜法；多反應監測

沙門氏菌（Salmonella）是常見的食源性致病菌之一，主要通過被污染的食品引起人類食物中毒[1]。在我國，沙門氏菌引起的細菌性食物中毒事件位列榜首[2-3]。沙門氏菌的快速準確鑒定對食源性疾病的監測、預防和控制具有重要意義。目前，我國制定了散裝即食食品和預包裝食品中致病菌限量標準[4-5]，其中明確規定了沙門氏菌的限量要求為每25g（mL）樣品中不得檢出。食品中沙門氏菌檢驗的國標方法（GB4789.4—2024）[6]需要經過多次富集和選擇性分離，然后通過生化和血清學方法進行定性鑒定。該過程通常需要5d以上的時間才能完成[7]。因此，發展快速、準確的沙門氏菌定性檢測方法極其重要。

隨著生物質譜技術的快速發展，基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜技術（MALDI-TOFMS）已被廣泛應用于未知微生物的快速鑒定[8]。每種微生物都有自己獨特的蛋白質組成，通過MALDI-TOFMS采集質譜圖并與蛋白質指紋圖譜數據庫比對，可在數分鐘內完成對微生物的定性鑒定[9]。MALDI-TOFMS技術具有操作簡單、速度快、成本低和通量高等優點，但是需要花費大量時間培養和分離相關微生物，并且在區分親緣物種方面存在一定的局限[10]。為了提高親緣物種的分辨能力，可在肽水平上采用串聯質譜方法進行檢測[11]。理論上，若某致病微生物在蛋白酶解后具有可區分于其它微生物的特異性多肽序列，即可通過串聯質譜方法檢測這些特征肽，實現目標微生物的靈敏和可靠檢測。高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜的多反應監測模式（Multiplereactionmonitoring，MRM）對母離子和子離子具有靶向選擇性，可實現低濃度特征肽的靈敏檢測，從而縮減微生物分離和培養步驟，目前已被應用于臨床常見致病菌的快速檢測[12-13]。Karlsson等[10]采用MRM技術對臨床樣本中4種致病菌的蛋白特征肽進行靶向分析，揭示了可用于診斷呼吸道感染的潛在生物標志物。Wang等[14]結合基因組學和蛋白質組學方法鑒定出5種革蘭氏陰性菌的特征肽，并建立了這些特征肽的靶向分析方法，實現了支氣管肺泡灌洗液中致病菌的直接鑒定。MRM技術不僅可同時檢測多種致病菌的特征肽，還可對某一致病菌展開種屬鑒定、耐藥性和毒力因子等多維度分析。例如，Charretier等[15]利用MRM技術對臨床樣品中的金黃色葡萄球菌進行菌種鑒定，同時對耐藥性和毒力進行評估。對于復雜基質（如環境樣本和食品樣本）中致病菌的檢測，通過免疫磁珠預先富集目標致病菌可顯著提高質譜檢測的靈敏度和特異性，目前已經有針對炭疽芽孢桿菌[16]、鼠疫耶爾森菌[17]和金黃色葡萄球菌[18-19]的相關研究報道。得益于自下而上的蛋白質組學的發展，已發現了沙門氏菌的屬、種、亞種甚至是血清型特異性多肽序列[20]。然而，尚未見采用靶向質譜方法檢測沙門氏菌特征肽的研究報道。

本研究針對8條適合于質譜檢測的沙門氏菌特征肽，結合Skyline軟件模擬和實驗優化了這些特征肽的MRM參數，建立了基于高效液相色譜-串聯質譜技術（HPLC-MS/MS）的沙門氏菌定性鑒定方法。進一步評估了本方法在菌種鑒定中的特異性，確定了其檢出限，并成功應用于5種人工污染樣品中沙門氏菌的檢測。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

TripleQuardTM4000QTRAPHPLC-MS/MS聯用系統（美國SCIEX公司）；JY92-IIDN超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技有限公司）；1-15PK高速冷凍離心機和3-16PK冷凍離心機（德國西格瑪公司）。超濾離心管（3kD，美國密理博公司）；低蛋白吸附管（1.5mL，德國艾本德公司）。

實驗所用7株沙門氏菌標準菌株，包括鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）、都柏林沙門氏菌（CMCC50042）、阿巴特圖巴沙門氏菌（ATCC35640）、布倫登盧普沙門氏菌（H9812）、傷寒沙門氏菌（CMCC50071）、腸炎沙門氏菌（ATCC13076）和鴨沙門氏菌（ATCC9270），購自美國模式培養物集存庫（Americantypeculturecollection，ATCC）和中國醫學細菌菌種保藏管理中心（Nationalcenterformedicalculturecollections，CMCC）。

NH4HCO3和尿素（優級純，德國西格瑪公司）；二硫蘇糖醇和碘乙酰胺（優級純，德國默克公司）；胰蛋白酶（質譜級，美國賽默飛世爾科技有限公司）；特征肽標準品（純度gt;95%，南京杰肽生物科技有限公司合成）；甲酸和乙腈（色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司）；胰蛋白胨大豆瓊脂和緩沖蛋白胨水（北京陸橋技術股份有限公司）。

1.2實驗方法

1.2.1菌體培養

采用胰蛋白胨大豆瓊脂平板培養菌株，食品樣品的預增菌采用國標法培養。采用無菌操作取25g（mL）食品樣品，置于盛有225mL緩沖蛋白胨水的均質袋中；向樣品中添加沙門氏菌標準菌株，置于36℃培養18～24h；以4500r/min低溫離心10min，棄上清液，用無菌水洗滌1次，離心收集菌體。

1.2.2細菌蛋白的提取

每50～100mg濕重菌體加入500μL菌體變性液（含7mol/L尿素、10mmol/L二硫蘇糖醇和50mmol/L碳酸氫銨），室溫振蕩30min后，在冰浴下超聲破碎菌體，功率100W，超聲2s/間隔3s，共5min；以15000r/min低溫離心20min，收集上清液，直接進行下一步操作或在–20℃保存。

1.2.3蛋白烷基化與酶解

在蛋白溶液中加入0.5mol/L碘乙酰胺溶液（終濃度25mmol/L），避光反應30min；加入0.5mol/L二硫蘇糖醇（終濃度25mmol/L）終止烷基化反應；加入50mmol/LNH4HCO3溶液稀釋體系，使尿素濃度低于2mol/L。加入胰蛋白酶（為樣品蛋白濃度的1/10），37℃反應12h；加入甲酸（終體積分數1%）終止消化；樣品溶液過0.22μm濾膜，直接上機分析或在–20℃保存待測。

1.2.4高效液相色譜-串聯質譜儀的工作條件

色譜條件：WatersXBridgeBEHShieldRP18色譜柱（50mm×2.1mm，130?，5μm），柱溫40℃，流動相A為0.1%（V/V）甲酸溶液，流動相B為乙腈，流速0.2mL/min，進樣量10μL。梯度洗脫程序：0～3min，5%B；3～6min，5%～15%B；6～30min，15%～35%B；30～40min，95%B；40～50min，5%B。

質譜采集條件：電噴霧電離；正離子模式；多反應監測模式；霧化氣、幕簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純度氮氣；電噴霧電壓4000V；離子源溫度550℃；幕簾氣流170kPa；霧化氣流340kPa；輔助氣流340kPa。

2結果與討論

通過結合自下而上的蛋白質組學和在線BLAST+序列比對搜索庫（2.15.0版本）[20]，共篩選出199條沙門氏菌物種特異性多肽，其中有92條同時存在于沙門氏菌的6個亞種中。非靶向蛋白質組學分析方法不需要針對特征肽建立和優化特定的方法，易于實施，但是檢測靈敏度不高，不利于在富含蛋白質和雜菌的基質（如食品）中的應用[19]。為了解決這一問題，本研究針對8條響應值高適合于質譜檢測的沙門氏菌特征肽，建立靶向質譜分析方法，用于特征肽的高靈敏和全覆蓋檢測。

2.1特征肽的靶向質譜方法的建立

2.1.1子離子全掃描分析

高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜的MRM模式可對特定的母離子-子離子對進行選擇性檢測，從而提高檢測靈敏度。采用Skyline軟件（23.1版本）預測8條沙門氏菌特征肽的碎裂情況，分別得到3對理論離子對。為驗證子離子的有效性，進一步采用三重四極桿質譜的子離子全掃描模式對所有特征肽標準品進行分析（圖1）。結果表明，SE1、SE2、SE4、SE6和SE7的預測結果與實驗中響應強度前三位的子離子吻合，由此選定這些特征肽的定性離子對。與Skyline軟件的預測結果不同，SE8在m/z244.1（y2）、m/z345.2（y3）、m/z458.3（y4）和m/z990.5（y9）處的響應較高。其中，y2子離子的響應強度在C端y系列產物離子中最高，適用于MRM檢測。此外，y9子離子、y3子離子和y4子離子響應強度分別排名第二、第三和第四，但y3子離子專屬性較差，同時能檢測到另一個色譜峰且分離度較差。因此，為了保障分析方法的專屬性和靈敏度，最終選用m/z617.3→244.1、m/z617.3→990.5和m/z617.3→458.3作為SE8的定性離子對。按照上述方法，獲得適合于MRM監測的SE3和SE5離子對。表1匯總了各特征肽調整后的MRM參數。

2.1.2碰撞能量的優化

為了實現特征肽的靈敏檢測，除了選定豐度高的子離子，還需要設置適宜的質譜參數（碰撞能量等）。雖然質譜參數可以通過Skyline軟件預測得到，但儀器條件、溶液環境等均會影響離子對的響應情況。因此，進一步通過實驗優化了離子對碰撞能量。以3eV為步長，在碰撞能量為6～72eV時記錄各離子對的響應值，歸一化后導入GraphPadPrism軟件（6.01版本），采用高斯曲線擬合，獲得最佳碰撞能量（圖2）。結果表明，在Skyline軟件預測值的條件下，所有特征肽的離子對均不能達到最佳響應。如SE1的離子對m/z709.9→951.5在33.8eV時的響應僅為37.1eV時的59%。經過優化，SE1的3個離子對m/z709.9→951.5、m/z709.9→1080.6和m/z709.9→468.3的最佳碰撞能量分別為37.1、40.3和35.9eV。采用相同方法，獲得其余特征肽各離子對的最佳碰撞能量。將表1所示的已優化好的特征肽質譜參數輸入MRM列表，初步建立MRM方法。

2.1.3特征肽標準品的MRM靶向分析

將特征肽標準品等濃度混合（1μg/mL），采用上述MRM方法進行分析。如圖3所示，各特征肽均取得了較好的檢測結果，對應的色譜峰分離效果良好且峰形對稱，并且同一濃度下各個特征肽的響應強度存在差異。其中，SE1的響應最強，SE2、SE3、SE5和SE7次之，而SE4、SE6和SE8的響應較弱。特征肽的質譜響應能力越強，越容易被檢出，理論上響應能力很差的肽段不適合于MRM檢測。不同蛋白質在沙門氏菌中的表達水平不同，導致其酶解形成的多肽濃度差異較大，某一肽段是否適合于MRM檢測還取決于其在實際生物樣品中的檢出效能。

2.1.4沙門氏菌的MRM靶向分析

采用所建立的特征肽靶向質譜方法對7株沙門氏菌標準菌株進行分析。如圖4所示，SE1在7株沙門氏菌的響應均最強，SE2、SE3、SE4和SE5的響應強度普遍較高，而SE6、SE7和SE8在多個菌株的響應較低。與特征肽標準品混合樣的分析結果相比，SE4在沙門氏菌的響應強度變高，這可能是因為SE4來源于丙酮酸激酶，是糖酵解途徑中的一個關鍵酶，在細菌中大量表達。與之相反，SE7在沙門氏菌的響應強度變低，可能的原因是序列中含有較多疏水性氨基酸，溶解性較差，不易提取。值得注意的是，SE5和SE8的保留時間發生較大變化，二者均來源于脂蛋白，蛋白上的糖基化修飾可能對多肽出峰有較大影響。總體而言，盡管各特征肽在不同菌株中的響應強度存在差異，但均能被檢出。

2.2沙門氏菌定性鑒定方法的驗證

2.2.1特異性驗證實驗

特異性反映了定性方法區分目標微生物和非目標微生物的能力。本研究共收集33株常見的食源性致病菌標準菌株，涵蓋了沙門氏菌同屬及同科物種。如圖5所示，沙門氏菌標準菌株的檢測結果為陽性，而33個非目標菌株的檢測結果為陰性。上述結果表明，本方法可準確區分沙門氏菌與其它常見食源性致病菌，具有較好的特異性。

2.2.2方法的檢出限

以3倍信噪比（S/N=3）確定檢出限。如表2所示，SE1～SE8的檢出限分別為0.1、0.4、0.2、1.0、4.0、8.0、8.0和1.0ng/mL。50%檢出限（LOD50）是微生物定性檢驗方法的重要參數。如表3所示，本方法在牛奶基質中的LOD50為0.35CFU/25g，與現行國標法[6]一致。這表明本研究建立的靶向質譜法檢測到的沙門氏菌污染水平與國標法相當。

2.3人工污染樣品分析

對5種人工污染的牛奶、豆奶、魚丸、雞肉腸和鹵蛋樣品進行檢測，沙門氏菌添加水平為100CFU/25g。經過18h增菌后，離心收集細菌，再進行蛋白質提取、胰蛋白酶消化和MRM分析，結果見表4。結果表明，5種人工污染樣品均檢出沙門氏菌，與國標法[6]的檢測結果一致，驗證了靶向質譜方法在實際應用中的可能性。

3結論

建立了基于HPLC-MS/MS多反應監測模式的沙門氏菌定性鑒定方法，并初步評估了本方法在菌種鑒定方面的性能。結果表明，本方法具有良好的特異性，其檢出限與國標法基本相當，證明其在人工污染樣品檢測中的有效性。HPLC-MS/MS方法在沙門氏菌的定性鑒定中展現了良好的應用前景，未來研究可以進一步篩選和優化更多類型的特征肽，以擴展本方法的應用范圍，推動其在食品安全檢測領域的實際應用。